Summary
Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.
Abstract
Magensaftresistente bakteriengemeinschaften sind schon früh im Leben etabliert und Immunzelle Entwicklung und Funktion zu beeinflussen. Die neonatale Mikrobiota ist anfällig für zahlreiche äußere Einflüsse, einschließlich Antibiotika-Einsatz und Ernährung, die Anfälligkeit für Autoimmun-und Entzündungserkrankungen auswirkt. Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit (IBD) zeichnen sich durch einen massiven Zustrom von Immunzellen in den Darm. Immunzellen, die bedingt durch die Mikrobiota können jedoch zusätzlich aus den Darm zu beeinflussen Immunreaktionen an extra Darm Standorten auswandern. So, gibt es eine Notwendigkeit zu identifizieren und zu charakterisieren, Zellen, die mikrobielle Nachrichten aus dem Darm zu distalen Seiten tragen können. Hier beschreiben wir eine Methode, um beschriftungszellen in den Darm des Neugeborenen Mäusen in Vivo , die ihre Identifizierung an extra Darm Standorten nach der Migration ermöglicht.
Introduction
Der Säugetiere Magen-Darm-Trakt beherbergt Hunderte von Arten von Bakterien, die in einer symbiotischen Beziehung mit dem Host1vorhanden sind. Die Immunzellen vorhanden im lokalen Umfeld ein friedliches Zusammenleben mit dieser Mikroben zu erzwingen und eine schützende Barriere gegen Erreger Invasionen zu etablieren. Bi-direktionale Interaktionen zwischen den Immunzellen und die Mikrobiota sind so entscheidend für eine Kommensale Gemeinschaft zu etablieren, die bildet das Immunsystem des Wirts und setzt die Schwelle für immune Reaktivität gegenüber Krankheitserregern. Änderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung oder Dysbiose, stören die Immunsystem Homöostase und Radardetektoren Regelkreise, die Darm-Entzündungen zu immunvermittelte Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und IBD2,3 zurückhalten .
Die Zeit unmittelbar nach der Geburt eine einmalige Entwicklung in der intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften beginnen, zur gleichen Zeit das Immune System zu etablieren reift4. Die postnatale Mikrobiota ist nicht stabil, mit Verschiebungen in der Zusammensetzung natürlich vorkommenden und häufig5. Die Immunzellen, die Interaktion mit der Mikrobiota befinden sich in zwei unterschiedlichen anatomischen Standorten im Darm - Lamina Propria und dem Darmepithel6. Zahlreiche Arten von Immunzellen sind im Darm, einschließlich Lymphozyten (z. B. T-Zellen, B-Zellen und angeborene Lymphzellen) sowie myeloische Zellen (die dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen enthalten). Diese Zellen, auch bekannt als hämatopoetischen Zellen führen eine Vielzahl von Funktionen, die bewahren die Darmbarriere und Homöostase aufrechtzuerhalten.
Neben ihrer regulatorischen Funktionen im Darm Websites können immune Zellen der Schleimhaut auch mikrobielle Nachrichten zu den extra Darm Sites, systemische Immunität7,8,9Regeln durchführen. Dies ist ein Bereich des wachsenden Forschungsinteresses und unterstreicht die Notwendigkeit der Methoden zur Ermittlung von Immunzellen, die aus intestinalen Gewebe migrieren, um ihre Funktion zu prüfen. Das Protokoll hier berichtet nutzt eine handelsübliche Maus-Modell in dem ein Photoconvertible fluoreszierendes Protein Label Zellen genutzt wird. PhAMherausgeschnitten Mäuse express ubiquitär ein grünes fluoreszierendes Dendra2 Protein, das irreversibel auf rote Fluoreszenz bei Aktivierung durch ultraviolette (UV) Licht10umgestiegen ist. Verwenden eine Faser-Optik-Kanüle, um 405 nm Licht in den Darm des Neugeborenen Mäusen zu liefern, zeigen wir, dass die Photoconverted hämatopoetischen Zellen, die ihren Ursprung in oder Durchreise durch den Darm in der Milz gefunden werden können.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung und unter Einhaltung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital durchgeführt.
Achtung: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von einem Laser der Klasse 3 b (LG3). LG3 Laserschutzbrillen müssen immer verwendet werden, wenn diese Laser in Betrieb. Entsprechende Schulung und Sicherheit Richtlinien befolgt werden, um das Risiko von Verletzungen zu vermeiden.
1. Aufbau und Montage von Laser
- Schließen Sie die Leuchtdiode (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fasergekoppelte) der LED-Treiber über die 4-polige M8 Stecker Kabel, das kommt beigefügt, die LED. Sorgfältig die Schraube um die Verbindung zu befestigen.
- Vor dem Anbringen der optogenetik Patchkabel an die LED, halten Sie den Connector Öffnung der LED für das Licht, um sicherzustellen, dass keine sichtbare Hindernisse sind. Schlag auf das Loch, alle Hindernisse zu beseitigen, falls erforderlich und die optogenetik Patch-Kabel in die Öffnung einführen.
- Schließen Sie Fiber optic Kanüle durch einführen der Kanüle in beiden Enden der Steckverbinder Hülse an die optogenetik Patch-Kabel an. Legen Sie das andere Ende des Ärmels Connector auf Patch-Kabel. Genügend Druck zu sichern die Verbindung aber nicht verbiegen oder brechen die optische Faser in die Kanüle vorsichtig sein.
Hinweis: Die fragile Fiber optic Kanüle wird mit der Schutzkappe behandelt, wenn der Laser nicht benutzt wird. - Stellen Sie die LED-Treiber in den kontinuierliche Welle (CW) Modus mit den kontinuierlichen Einstellknopf auf 0 und die Strombegrenzung auf 1,2 A. festgelegt
(2) Ladungszustand der Zellen im Darm
Hinweis: Männliche und weibliche Mäuse wurden Intracolonic 405 nm Licht noch 1-2 Tage nach ihrer Geburt ausgesetzt und wurden geopfert, vor 1 Woche alt.
- Einem dunklen Ort mit einem Zugang zu einer Steckdose zu sichern. Schließen Sie das LED-Netzteil an die Steckdose.
Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt in dem minimalen weißen Licht wie eine längere Belichtung der Mäuse an das Umgebungslicht eine unerwünschte Ladungszustand der Zellen führen kann. Rotes Licht wird als Alternative verwendet.
Achtung: Der folgende Schritt bezieht den Gebrauch eines Tieres Narkose. Die Verwaltung des Betäubungsmittels erfolgt in Klasse II Kapuze oder mithilfe einer anderen geeigneten Aufräumvorgang Systems. Die Inhalation des Betäubungsmittels kann Schwindel, Benommenheit oder sogar Bewusstlosigkeit führen. - Die Maus durch die Einwirkung von 4-5 % Isofluran in 100 % O2 in einer Induktion-Box zu betäuben. Überprüfen Sie richtige Tiefe der Narkose durch fest Kneifen eine Hinterpfote (keine Antwort). Pflegen Sie Anästhesie über eine bugnase bei ca. 2 % Isofluran. Verhindern Sie Handler Exposition gegenüber Isofluran durch Verwendung einer geeigneten Haube oder Narkose Aufräumvorgang Gerät.
- Position der narkotisierten Maus für die Intracolonic Belichtung mithilfe von 1 hand Scruff die Rückseite der Maus sanft mit dem Zeigefinger und dem Daumen. Schalten Sie die Maus über den Bauch aussetzen. Lösen Sie den Griff, wenn die Maus fängt an, seine rosa Farbe verlieren oder ihre Atemfrequenz beginnt sich zu verlangsamen. Sichern Sie das Ende der Maus zwischen dem Ring und kleinen Finger.
- Entfernen Sie mit der anderen Hand die Schutzkappe von der Kanüle. Unter Beibehaltung der Längsachse parallel zur Mittellinie der Maus, der Kanüle sanft legen Sie Fiber optic Kanüle durch den Anus in den Darm so, dass alle 5 mm der Lichtleitfaser sind im Inneren der Maus.
Hinweis: Dieser Vorgang erfolgt langsam und mit Sorgfalt nicht auf die Kolon Wand zu perforieren. Minute wackeln und Verdrehen der Kanüle hilft bei die Weiterentwicklung in den Darm. - Don die Schutzbrille und erhöhen Sie den Laser auf den maximalen Wert (ganz im Uhrzeigersinn). Bestätigen Sie die Anwesenheit von UV-Licht durch das Betrachten des transluzenten Bauches der Maus.
Hinweis: Die LG3 Laserschutzbrillen verringern drastisch Sichtbarkeit. Haben ein Kollege (tragen Schutzausrüstung) helfen bei der Brille anziehen und Einschalten des Lasers. - Setzen Sie dem Doppelpunkt, das Laserlicht für insgesamt 2 min. zurückziehen der Kanüle ca. 1 mm alle 30 s, der luminalen Umgebung ausgesetzt, das Licht zu maximieren. Am Ende von 2 min schalten Sie den Laser aus.
- Entfernen Sie die Kanüle langsam von der Maus. Nach der Genesung von Anästhesie in einem leeren Käfig warm, die Maus zu Hause Käfig zurück
3. Isolation von Darm-Lymphozyten
- Bereiten Sie 1 L die Hank ausgewogen Salz Lösung/Kalb Serum (HBSS/CS) Puffer, 200 mL von epithelialen Streifen Puffer, 500 mL waschen Medien und 200 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-freie Medien zu waschen.
Hinweis: Die Reagenz Mengen sind für eine Stichprobengröße von 9 berechnet.- Machen Sie den HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS) durch Zugabe von 50 mL CS bis 950 mL HBSS. Bewahren Sie es auf dem Eis.
- Vorbereiten des epithelialen Streifen Puffers [HBSS; 5 % CS; 5 mM EDTA; 1 mM Dithiothreitol (DTT), 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) (pH 7,2-7,5)] durch Zugabe von 10 mL CS 200 µL des DVB-t, 2 mL 0,5 M EDTA und 3 mL 1 M HEPES-Puffer 1 M bis 185 mL von HBSS. Ort der epithelialen Streifen-Puffer in einem 37 ° C-Wasserbad.
- Machen Sie waschen-Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 5 mL CS und 1 mL 0,5 M EDTA auf 494 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie die EDTA-freie Wäsche Medien (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES vor) durch Zugabe von 2 mL CS und 3 mL 1 M HEPES auf 195 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.
- Machen einen FACS-Puffer [1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,2); 2 % CS] durch Zugabe von 10 mL CS bis 490 mL PBS. Bewahren Sie es auf dem Eis.
- Bereiten Sie das Gewebe Sammlung Gericht, indem man ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 x 10 mm. Das Gericht 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 hergestellt und auf Eis gelagert) hinzu, und legen Sie es auf dem Eis.
- Der Maus über eine Überdosierung von inhalativen Isofluran mit entsprechenden Aufräumvorgang von Narkose einschläfern (ein ca. 3 min Exposition gegenüber > 4 % Isofluran in der Raumluft oder 100 % O2). Nach dem scheinbaren Einstellung der Atmung und reflex-Bewegung, die Abwesenheit von tiefen Schmerz durch eine Hinterpfote fest kneifen zu überprüfen (mit Pinzette wird empfohlen). Stellen Sie sicher der Euthanasie über eine Enthauptung mit der Chirurgische Schere oder ein neues Rasiermesser.
Hinweis: Zervikale Dislokation empfiehlt sich nicht für diesen Schritt aufgrund der Größe und Alter des Tieres. Diese Methoden sind im Einklang mit den 2013 AVMA Richtlinien über Sterbehilfe und von der MGH IACUC genehmigt. - Ernten Sie den Doppelpunkt mit saubere Zange und Schere um den Bauch zu öffnen. Spiegeln Sie den Darm zu 1 Seite der Maus Abdomen Dickdarm aussetzen. Entfernen Sie den gesamten Dickdarm durch erste transecting es nur distal (in Richtung des Afters), der Blinddarm. Verwenden Sie dann während fest greifen den Darm mit der Pinzette, Schere, Schneiden durch die Harnröhre, den Enddarm. Schneiden Sie den Doppelpunkt als in der Nähe des Afters wie möglich. Ernte die Milz nach dem Entfernen des Dickdarms (siehe Schritte 4.1-4.2 unten).
Hinweis: Während der Ladungszustand Protokoll nur ~ 25 % der Neugeborenen Colon (5 mm der Fiber optic Kanüle) richtet, ist der gesamte Dickdarm geerntet, um die Zelle isoliert zu unterstützen. - Reinigen Sie den Doppelpunkt mit Zange um den Inhalt aus dem Dickdarm und auf einem trockenen Papiertuch zu schieben. Das Gewebe mit Rasierklingen fein hacken des Dickdarms zu einer Paste auf dem Cover von einer Kulturschale und übertragen diese Paste in die Zelle Sieb in der Petrischale zu homogenisieren.
- Fügen Sie eine saubere 8 mm lange magnetische Stir Bar in das Sieb und legen Sie die Schüssel auf einen 9-Position Magnetrührer Teller. Die magnetische Stir Bar Geschwindigkeit auf 800 u/min und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Den Puffer zu verwerfen und mit 10 mL HBSS/CS (die HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 vorgenommen und gespeichert auf dem Eis) zu wiederholen. Verwerfen Sie den Puffer am Ende des SPÜLPROGRAMMS.
- Die Epithelzellen durch Zugabe von 10 mL vorgewärmte epithelialen Streifen Puffer (die HBSS 5 % CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] Puffer, der war im Schritt 3.1.2 hergestellt und gelagert in einem Wasserbad von 37 ° C) in die Zelle Sieb zu distanzieren und bei 800 u/min für 30 min in einem 3 rühren 7 ° C Inkubator. Am Ende der Inkubation übertragen des Puffers bereichert in der epithelialen Fraktion um eine saubere 15 mL-Tube.
Hinweis: Das Epithel und die zugehörigen Zellen (intestinale Epithelzellen und der intestinalen epithelialen Lymphozyten) sind in den Puffer veröffentlicht, während die Zellen in die intakte Lamina Propria auf die Zelle Sieb während dieser Schritt11bleiben.- Zentrifugieren Sie den angereicherten intestinalen epithelialen Bruch (Lal) 700 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Bewahren Sie es auf dem Eis für Schritt 3.15.
- Waschen den Lamina Propria Bruch innerhalb der Zelle Sieb 2 X mit HBSS/CS. Dazu die Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Lösung (HBSS; 5 % CS Puffer, die im Schritt 3.1.1 gemacht wurde, die auf dem Eis gespeichert wurden) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
- Waschen Sie die Probe 2 X Waschen Medien. Die Zelle Sieb 10 mL waschen Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA Puffer, die im Schritt 3.1.3 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 15 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
- Bewahren Sie nach der Verwendung waschen Medien es auf dem Eis für den Einsatz im Schritt 3.14.
- Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer in 3.1.1 Schritt gemacht, der auf dem Eis gespeichert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
- Inkubieren Sie das Gewebe in EDTA-freie Waschpuffer. Fügen Sie 10 mL EDTA-freie Waschpuffer (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES-Puffer, der in Schritt 3.1.4 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) in die Zelle Sieb und inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur ohne sich zu rühren. Verwerfen Sie den Puffer am Ende dieses Schrittes.
- Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS und bereiten Sie die Enzymlösung. Fügen Sie 10 mL HBSS/CS (HBSS; 5 % CS Puffer gemacht synchron 3.1.1 auf Eis gespeichert wurde) in die Zelle Sieb Puffern und rühren Sie es mit 800 u/min für 10 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.
- Vorbereiten der Enzymlösung (EDTA-frei waschen Puffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase) während der zweiten Periode waschen: 9 mg hinzufügen der DNase I und 15 mg gefriergetrockneten Kollagenase, 90 mL EDTA-freie Puffer waschen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
- Die Lamina Propria Bruchteil enthalten in der Zelle Sieb Lamina Propria Lymphozyten (Vormerkung) zu verdauen. Fügen Sie 10 mL der Enzymlösung (EDTA-freie Waschpuffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase Puffer in Schritt 3.12.1 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert) in die Zelle Sieb und rühren Sie es mit 800 u/min für 45 min in einem Inkubator 37 ° C.
Hinweis: Vormerkung gelangen in die Lösung nach der enzymatischen Verdauung.- Sammeln Sie das Enzym-Lösung enthält die Zellen zu und Filtern sie durch eine neue Zelle Sieb in ein 50 mL konische Röhrchen.
- Die gefilterten Zellen zu blockieren, die Kollagenase-Aktivität in der Enzymlösung fügen Sie 20 mL kaltwäsche Medien (die HBSS; 1 % CS; 1mM EDTA Puffer im Schritt 3.1.3 gemacht und gespeichert auf dem Eis im Schritt 3.9.1 hinzu). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 6 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets, die Vormerkung in 1 mL der FACS-Puffer enthalten.
- Kombinieren Sie IEL (aus Schritt 3.7.1) und die LPL (aus Schritt 3.14) Brüche und Färben sie mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).
Hinweis: IEL und LPL Fraktionen können separat gefärbt werden, wenn Fach Informationen gewünscht wird.
4. Isolierung von Lymphozyten aus der Milz
- Bereiten Sie das sammelröhrchen durch Zugabe von 500 µL FACS Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Bewahren Sie es auf dem Eis.
- Nach dem Entfernen des Dickdarms (Schritt 3.4), Ernten Sie die ganze Milz und legen Sie sie in das sammelröhrchen. Speichern Sie das Gewebe auf dem Eis.
- Mit Hilfe einer elektrischen Gewebe-Homogenisator, Homogenisieren der Milz in einem Microcentrifuge Schlauch für ca. 1 min. Zentrifuge der Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.
- Führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch resuspending der Probenmaterials in 500 µL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer, Zelltod durch osmotische Lyse zu initiieren. Lassen Sie die Probe 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren und es dann in 725 µL FACS Puffer aufzuwirbeln.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand. Aufschwemmen Sie das Pellet in 500 µL Puffer FACS und Filtern sie durch ein Sieb 40 µm Zelle zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch. Die gesamte Probe zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen und Färben Sie es mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).
5. Identifizierung von Dendra-R+ Zellen mittels Flow Cytometry
- Zentrifugieren Sie IEL/LPL und Milz Proben bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.
- Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 100 µL Antikörper Färbung Mischung. Vorbereiten des Antikörpers Färbung Mischung durch Zugabe von 1 µL eindringmittel konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu 100 µL FACS Puffer pro Probe.
Hinweis: Es ist wichtig, die Antikörper für die Durchflusszytometrie vor dem Experiment zur Bestimmung der optimalen Konzentration wo tritt verbindlich Sättigung verwendet titrieren. - Inkubieren Sie die Proben auf Eis (an einem dunklen Ort) 35 min.
- Aufschwemmen Sie die Proben in 300 µL Puffer FACS und Zentrifugieren sie 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Proben in 325 µL FACS-Puffer. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.
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Representative Results
Ein LWL-Kabel wurde verwendet, um 405 nm Licht in die Doppelpunkte der 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Mäuse zu liefern. In bisherigen Experimenten wurde eine 30 s Belichtung entschlossen, einen maximalen Ladungszustand der Doppelpunkt Zellen mit minimalen Zytotoxizität (Abb. 1A) zu geben. Daher wurden sequenziellen 30 s Forderungen der verschiedenen Segmente des Dickdarms durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Im Anschluss an die Laserbelichtung die Mäuse waren sofort eingeschläfert, und den Ladungszustand der Zellen wurde festgestellt. Einzellige Vorbereitungen des gesamten Kolon Gewebes waren voller Flecken mit Leuchtstoff-konjugierten Anti-CD45 Antikörper und der durchflusszytometrischen Analyse wurde durchgeführt, um Ladungszustand zu erkennen. Unkonvertierte Dendra2-grün (Dendra-g) Protein hat Anregung und Emission Maxima bei 490 und 553 nm bzw. und detektiert werden in den FITC-Kanal, während Photoconverted Dendra2-rot (Dendra-R) Protein Anregung und Emission Maxima bei 507 und 573 nm hat bzw. und kann in der PE-Kanal von einem Durchflusszytometer erkannt werden. Sobald irreversibel zu seiner roten Form gewechselt haben, ist Dendra2 sehr Photostabil und nützlich für langfristige Tracking-Anwendungen.
Keine Dendra-R+ -Zellen wurden bei unlasered Mäusen (Abbildung 1B Links) erkannt. 405 nm Belichtung führte jedoch deutliche Dendra-R+ -Zell-Populationen in den CD45Neg und CD45+ Zell-Fächer (Abbildung 1B Rechts). Um festzustellen, ob das Kolon Ladungszustand Protokoll geführt in der Hintergrund-Etikettierung von Zellen an extra Darm Standorten, wir geerntet Milz von neu Photoconverted Mäusen (T = 0) und für Dendra-R+ durch Durchflusszytometrie Zellen untersucht. Keine Dendra-R+ -Zellen erkannt wurden, in das CD45Neg oder CD45+ Zell-Fächer (Abbildung 1C), was darauf hindeutet, dass die Intra-Kolon Laserstrahl genug, um Photolabel Zellen in der Milz nicht durchdringen. Somit keine Dendra-R+ -Zellen in der Milz nach so dass genügend Zeit für die Migration erkannt (T = 3d, 5D) sollte aus dem Dickdarm stammen.
Abbildung 1 : In vivo Ladungszustand des Kolon Gewebes. Zellen des Dickdarms aus 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Welpen wurden ausgesetzt, Intra-Kolon 405 nm-Licht für 30 s wie beschrieben. Der Ladungszustand und Kennzeichnung der Zellen wurden unmittelbar nach dem Eingriff bestimmt (T = 0) von einer durchflusszytometrischen Analyse von einzelligen Vorbereitungen des Kolon Gewebe und Milz. (A) diese repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Dot Plot zeigt die Expression von CD45 (X-Achse) und die Färbung des lebenden Toten Farbstoffs (y-Achse) in einzellige Zubereitungen aus der Doppelpunkte Kontroll-und gelaserten Mäuse. Platten B und C sind repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Dot Plot Overlays, die die Expression des Proteins Dendra2-grün zeigen (Dendra2-g, horizontaler Achse) und Dendra2 rot-Protein (Dendra2-R, vertikale Achse) in Kontrolle Oberflächenausführung und CD45 ausgesetzt+ (blutbildenden) und CD45Neg (nicht blutbildenden) Zellen (B) der Doppelpunkt und (C) die Milz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Daten von einem typischen Ladungszustand Experiment, wandernden Zellen in der Milz zu identifizieren sind in Abbildung 2dargestellt. Der Ladungszustand der Zellen in die Doppelpunkte von 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Mäusen wurde wie in Abbildung 1aufgeführt. Mäuse wurden eingeschläfert, 3 und 5 Tage nach der Exposition und das Vorhandensein von Dendra-R+ Zellen in der Milz wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Es gab keine Dendra-R+ in der CD45Neg Zelle Teilmenge, Einklang mit der Auffassung, dass die CD45Neg in erster Linie epithelialen Zellen und andere strukturelle Zellen des Darms. Einige CD45+ hämatopoetische Zellen ausgedrückt Dendra-R, was darauf hindeutet, dass sie Photoconverted in den Dickdarm und in die Milz wanderten.
Abbildung 2 : CD45+ hämatopoetische Zellen Wandern aus dem Dickdarm zur Milz. Neugeborenen (Tag 0 - 2) PhAMherausgeschnitten Mäuse wurden 405 nm Licht Photoconvert Dendra2 Protein von Intra-Kolon Exposition ausgesetzt. Die repräsentative Flow Cytometry Diagramme zeigen die Expression des Proteins Dendra2-grün (Dendra2-g, horizontaler Achse) und Dendra2 rot-Protein (Dendra2-R, vertikale Achse) in CD45Neg und CD45+ milzzellen unbelichteten 5 Tage alte Mäuse und Mäusen analysiert mit 3 und 5 Tagen ausgesetzt (T = 3d, 5D) nach den Ladungszustand. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Identifizierung und Charakterisierung von Zellen, die Interaktion mit und sind beeinflusst durch die Mikrobiota im Dickdarm sind wichtig und sollten erleichtern Überblick darüber, wie Informationen aus der Schleimhaut Mikroumgebung für den Rest des Körpers weitergeleitet wird. Eine Methode zur Untersuchung im Zusammenhang mit dem Darm Zellwanderung erfordert die Isolierung des Darm-assoziierten Zellen, gefolgt von einen Adoptiv-Transfer in Empfänger Mäuse zu bestimmen, ihre Gewebe-Homing-Muster und12,13zu funktionieren. Dieser Ansatz ist begrenzt, da nur bestimmte Zelltypen, die übertragen wurden verfolgt werden können. Darüber hinaus können Artefakte aus der Isolation der Zellen aus dem Gewebe und den Reinigungsprozess der Migrationsprozess in Vivo behindern. Vor kurzem war ein endoskopische Ladungszustand Protokoll Darmzellen mit Kaede Mäusen beschriften gemeldeten14. Diese Studie ergab eine breite Menschenhandel der Leukozyten, und aus dem Darm Erwachsener Mäuse.
Unser Bericht beschreibt eine Methode, um beschriftungszellen im Dickdarm von Neugeborenen Mäusen und verfolgen Sie ihre Migration zu Extra Darm Sehenswürdigkeiten wie die Milz. PhAMherausgeschnitten Maus drückt ubiquitär ein Photoconvertible grün fluoreszierendes Dendra2 Protein, das irreversibel in rote Fluoreszenz bei seiner Aktivierung durch UV-Licht geschaltet wird. Die Lichteinwirkung von Doppelpunkte von Neugeborenen Mäusen 405 nm beschriftet beide CD45+ hämatopoetischen und CD45Neg nicht blutbildenden Zellen. CD45+Dendra2-rote+ Zellen in der Milz 3 bis 5 Tage nach der Ladungszustand, unter Angabe der extra Darm Migration von hämatopoetischen Zellen erkannt wurden.
Der Rate-limiting Schritt für diesen Test ist der Anteil des Kolon Bereichs 405 nm Licht ausgesetzt wird. Die Zerbrechlichkeit des Neugeborenen Dickdarms und das Vorhandensein von Hocker, beschränken wenn auch minimal in diesem frühen Alter die Länge der Faser Optik Kanüle, die eingefügt werden können. In bisherigen Experimenten konnte eine längere Kanüle nicht erfolgreich mehr als 5 mm eingefügt werden. Schmierstoffe wurden wegen des Risikos einer Variable Lichtbrechung des Laserstrahls vermieden. Die Bewegung der Kanüle nach außen alle 30 s half den Kolon Bereich das Laserlicht ausgesetzt zu maximieren. Wichtig ist, eine Kanüle mit einem großen Wert NA (NA = 0,5) wurde verwendet, um einem breiten Lichtkegel im Dickdarm zu generieren.
Dieses Protokoll wurde für Neugeborene (Tag 0 - 2) standardisiert PhAMherausgeschnitten Welpen. Angesichts der Veränderungen in Inhalt und Länge des Dickdarms mit dem Alter der Mäuse, müssen die Technik entsprechend optimiert werden, wenn Sie ältere Welpen verwenden. Änderungen an der Gesamtdauer der Ladungszustand und die Länge der Einfügung der Fiber optic Kanüle werden in erster Linie notwendig sein.
Dieser Ansatz zum Verständnis das Wanderungsverhalten von Zellen im Darm wird durch durchflusszytometrischen Analyse erleichtert. Multiparameter Durchflusszytometrie kann weiter verwendet werden, um zu identifizieren und Phänotyp der Migranten Immunzelle Typen innerhalb der CD45+ Zelle Teilmenge. Dendra2-R+ Zellen können auch durch FACS für downstream-Anwendungen wie z. B. Profilierung oder Proteomics Genexpressionsanalysen sortiert werden. Während für das Verständnis der blutbildenden Zelle Teilmengen im Dickdarm in dieser Studie gerichtet, kann die Methode studieren zellulare Migration von zusätzlichen Gewebe Websites einschließlich des Gehirns und der Haut angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Nitya Jain wurde durch ein NIH/NIAID Career Transition Award-1K22AI116661-01 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
