Summary
Protokollet beskrivs här använder tredjeparts ett photolabeling tillvägagångssätt i nyfödda möss att specifikt identifiera immunceller som emigrerar från tjocktarmen till extra intestinal platser. Denna strategi kommer att vara användbart att studera värd-mikrobiomet interaktioner tidigt i livet.
Abstract
Enteriska bakteriesamhällen etableras tidigt i livet och påverka immunceller utveckling och funktion. Den neonatala bakterieflora är mottagliga för många yttre påverkan inklusive antibiotika användning och kost, vilket påverkar mottagligheten för autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar. Störningar såsom inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD) kännetecknas av en massiv tillströmning av immunceller till tarmen. Immunceller som betingas av bakterieflora kan dock dessutom utvandra ur tarmarna att påverka immunsvaret på extra intestinal platser. Således finns det ett behov av att identifiera och karaktärisera celler som kan bära mikrobiell meddelanden från tarmarna till distala platser. Här, beskriver vi en metod att etiketten cellerna i tjocktarmen av nyfödda möss i vivo som gör deras identifiering på extra intestinal platser efter migreringen.
Introduction
Däggdjur magtarmkanalen hamnar hundratals arter av bakterier som finns i ett symbiotiskt förhållande med värd1. Immuncellerna finns i den lokala miljön upprätthålla en fredlig samexistens med dessa mikrober och upprätta en skyddande barriär mot patogener invasioner. Dubbelriktad interaktioner mellan immuncellerna och bakterieflora är således avgörande att inrätta en kommensaler gemenskap som utbildar värd immunsystemet och anger tröskelvärdet för immun reaktivitet till patogener. Förändringar i mikrobiell komposition eller dysbios, kan störa immun homeostas och stör reglerande kretsar som hindrar intestinala inflammationer leder till immunmedierade sjukdomar som typ 1 Diabetes och IBD2,3 .
Perioden omedelbart efter födseln är en unik utvecklingsmässiga fönster under vilken de intestinala mikrobiella samhällena börjar upprätta samtidigt immunförsvaret mognar4. Den postnatala bakterieflora är inte stabil, med förändringar i gemenskapens sammansättning förekommer naturligt och ofta5. De immunceller som samverkar med bakterieflora bosatta i två skilda anatomiska platser i tarmen - i lamina propria och intestinal epitel6. Många typer av immunceller är närvarande i tarmen, inklusive lymfocyter (som T-celler, B-celler och medfödda lymfoida celler) samt myeloida celler (som inkluderar dendritiska celler, monocyter och makrofager). Dessa celler, även känd som hematopoetiska celler, utföra en mängd funktioner som bevarar tarmbarriären och upprätthålla homeostas.
Förutom deras reglerande funktioner på intestinal platser, kan immunceller i slemhinnan också bära mikrobiell meddelanden till extra intestinal platser att reglera systemisk immunitet7,8,9. Detta är ett område av växande forskningsintresse och belyser behovet av metoder för att identifiera immunceller som migrerar av intestinal vävnader för att undersöka deras funktion. Det protokoll som redovisas här använder tredjeparts en kommersiellt tillgänglig musmodell där en photoconvertible fluorescerande protein utnyttjas till etikett celler. PhAMcensurerade möss express ubiquitously ett grönt fluorescerande Dendra2 protein som är oåterkalleligt bytte till röd fluorescens vid aktivering av ultraviolett (UV) ljus10. Använda en fiber optic kanyl för att leverera 405 nm ljus in i tjocktarmen av nyfödda möss, visar vi att photoconverted hematopoetiska celler, som har sitt ursprung i eller transiterat genom tjocktarmen kan hittas i mjälten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes med godkännande och i enlighet med de institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Massachusetts General Hospital.
Varning: Detta protokoll innebär användning av en klass 3b laser (LG3). LG3 laser skyddsglasögon måste alltid användas när du använder denna laser. Lämplig utbildning och säkerhet riktlinjer måste följas för att undvika risken för skador.
1. design och montering av Laser
- Anslut lysdiod (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fiber-kopplade) den LED drivrutin via 4-pin M8 kontakt kabeln som kommer kopplad till LED. Dra åt skruven för att fästa anslutningen.
- Innan du kopplar den optogenetik patch-kabeln till lampan, håll kontakten öppnar LED upp till ljuset så det är inga synliga hinder. Blås på hålet för att eliminera alla hinder om det behövs och infoga den optogenetik patch-kabeln i öppningen.
- Anslut fiber optic kanylen till optogenetik patchkabel genom att sätta kanylen i vardera änden av kontakten hylsan. Fäst den andra änden av kontakten hylsan till patchkabel. Applicera tillräckligt tryck att säkra anslutningen men var försiktig att inte böja eller bryta den optiska fibern i kanylen.
Obs: Bräcklig fiber optic kanylen är täckt med skyddslocket när lasern inte är i bruk. - Ställa in LED-drivern på kontinuerlig våg (CW) läget med kontinuerlig justerskruven vid 0 och den nuvarande tidsfristen till 1,2 A.
2. Photoconversion av cellerna i tjocktarmen
Obs: Manliga och kvinnliga möss utsattes för intracolonic 405 nm ljus 1-2 dagar efter födseln och offrades före 1 veckas ålder.
- Säkra ett mörkt läge med tillgång till ett eluttag. Koppla LED-drivern i vägguttaget.
Obs: Denna procedur utförs i det minimala vita ljuset som en lång exponering av möss för omgivande ljus kan orsaka en oönskad photoconversion av celler. Rött ljus används som ett alternativ.
Varning: Följande steg innebär användning av djurets narkos. Administrationen av bedövningsmedlet sker i en klass II-huva eller använda ett annat lämpligt rensning system. Inandning av bedövningsmedlet kan orsaka yrsel, dåsighet eller ens medvetslöshet. - Söva musen av exponering för 4-5% isofluran i 100% O2 i en kartong för induktion. Verifiera korrekt djup anestesi genom att nypa fast en hind tass (inget svar). Underhålla anestesi via en Kona på cirka 2% isofluran. Förhindra handler exponering för isofluran genom användning av en lämplig huva eller bedövningsmedel rensning enhet.
- Placera sövda musen för intracolonic exponering med 1 hand till kragen baksidan av musen försiktigt med pekfinger och tumme. Vänd på musen för att exponera buken. Lossa greppet om musen börjar förlora sin rosa färg eller om dess andning börjar sakta. Säkra svansen av musen mellan ringen och små fingrar.
- Med den andra handen, ta bort skyddshylsan från kanylen. Samtidigt som den långa axeln av kanylen parallellt musens mittlinjen, försiktigt in fiber optic kanylen genom anus i tjocktarmen så att alla 5 mm av optisk fiber är inuti musen.
Obs: Denna procedur utförs långsamt och med omsorg inte perforera i kolon väggen. Minut vickar och vridning av kanylen hjälpmedel befordran i tjocktarmen. - Don skyddsglasögon och öka laser nuvarande till det högsta värdet (ända medurs). Bekräfta förekomsten av UV-ljus genom att titta på genomskinlig buken av musen.
Obs: De LG3 laser skyddsglasögon dramatiskt minska synligheten. Har en kollega (bär skyddsutrustning) hjälpa påtagning glasögon och slå på lasern. - Exponera tjocktarmen att laserljuset för sammanlagt 2 min. uttag kanylen ca 1 mm varje 30 s att maximera luminala området utsätts för ljus. I slutet av 2 min, stänga av lasern.
- Ta långsamt bort kanylen från musen. Efter att återhämta sig från anestesi i en tomma varm bur, återgå musen till buren.
3. isolering av Intestinal lymfocyter
- Förbereda 1 L av den Hank's Balanced Salt lösning/kalv serum (HBSS/CS) buffert, 200 mL epitelial strip buffert, 500 mL wash media och 200 mL av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)-gratis wash media.
Obs: Reagens volymerna beräknas för en stickprovsstorlek på 9.- Göra den HBSS/CS buffert (HBSS; 5% CS) genom att lägga 50 mL CS till 950 mL HBSS. Förvara den på is.
- Förbereda epitelial strip bufferten [HBSS 5% CS 1 mM Ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syra (HEPES) (pH 7,2-7,5)] genom att tillsätta 10 mL CS, 200 µL 1 M DTT, 2 mL 0,5 M EDTA och 3 mL 1 M HEPES buffert till 185 mL av HBSS. Placera epitelial strip bufferten i 37 ° C vattenbad.
- Gör wash media (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA) genom att lägga till CS 5 mL och 1 mL 0,5 M EDTA 494 mL HBSS. Förvara det i rumstemperatur.
- Förbered EDTA-fri tvätt (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES) genom att lägga till 2 mL CS och 3 mL 1 m HEPES 195 mL HBSS. Förvara det i rumstemperatur.
- Göra en FACS buffert [1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] genom att tillsätta 10 mL CS till 490 mL PBS. Förvara den på is.
- Förbereda vävnad samling skålen genom att placera en 70 µm cell SIL inuti en 60 x 10 mm kultur maträtt. Tillsätt 10 mL av HBSS/CS buffert (HBSS; 5% CS buffert i steg 3.1.1 och lagras på is) till skålen och placera den på isen.
- Avliva den mus via en överdos av inhalerade isofluran använder lämpliga rensning av bedövningsmedel (cirka 3 min exponering mot > 4% isofluran i luften eller i 100% O2). Efter uppenbara andningsstopp och reflex rörelse, verifiera avsaknad av djup smärta genom att nypa fast en hind tass (använda pincett rekommenderas). Säkerställa den dödshjälp via en halshuggning antingen ett par kirurgisk sax eller en ny rakkniv.
Obs: Cervikal dislokation rekommenderas inte för det här steget beror på storlek och ålder av djuret. Dessa metoder är förenlig med de 2013 AVMA riktlinjer om dödshjälp och godkänts av den MGH IACUC. - Skörda tjocktarmen med ren pincett och sax för att öppna buken. Återspegla tarmar till 1 sida av musens buken att exponera kolon. Ta bort hela tjocktarmen genom första transecting det precis distalt (mot anus) till blindtarmen. Sedan samtidigt stadigt gripa tjocktarmen med pincett, använda sax för att klippa genom urinröret till ändtarmen. Skär tjocktarmen som nära anus som möjligt. Skörda mjälten efter avlägsnande av tjocktarmen (se steg 4.1-4.2 nedan).
Obs: Medan protokollet photoconversion mål endast ~ 25% av nyföddas kolon (5 mm av fiber optic kanylen), skördas hela tjocktarmen stöd i cell isolering. - Rengöra tjocktarmen med pincett för att driva innehållet av tjocktarmen och på en torr pappershandduk. Homogenisera vävnaderna med hjälp av rakblad att finhacka tjocktarmen till en pasta på omslaget till en kultur maträtt och sedan överföra denna pasta till cell silen i petriskål.
- Lägga till en ren 8 mm lång magnetiska rör silen och placera skålen på en 9-position magnetomrörare tallrik. Som magnetiska rör bar hastigheten till 800 rpm och inkubera cellerna för 5 min i rumstemperatur. Kassera bufferten och upprepa tvätten med 10 mL HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffert i steg 3.1.1 och lagras på is). Kassera buffert i slutet av tvätten.
- Separera epitelceller genom att tillsätta 10 mL förvärmd epitelial strip buffert (HBSS 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] buffert som gjordes i steg 3.1.2 och lagras i 37 ° C vattenbad) till cell silen och rör vid 800 rpm i 30 min i en 3 7 ° C inkubator. I slutet av ruvning, överföra bufferten berikad i epitelial fraktionen till en ren 15 mL tub.
Obs: De epitel och associerade celler (tarmepitelceller och intestinal epitelial lymfocyter) släpps in i bufferten, medan celler i intakt lamina propria kvar på cell silen under detta steg11.- Centrifugera det berikade intestinal epiteliala bråket (IELs) vid 700 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL FACS buffert. Förvara den på isen för användning i steg 3.15.
- Tvätta den lamina propria fraktionen inom cellen silen 2 x med HBSS/CS. Att göra det, tillsätt 10 mL av HBSS/CS lösning (HBSS; 5% CS buffert som gjordes i steg 3.1.1 som har lagrats på is) till cell silen och rör ned det i 800 rpm för 5 min i en 37 ° C inkubator. Kassera bufferten efter varje tvätt.
- Tvätta provet 2 x i wash media. Tillsätt 10 mL av wash media (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA buffert som gjordes i steg 3.1.3 och förvaras i rumstemperatur) till cell silen och rör ned det i 800 rpm i 15 min i en 37 ° C inkubator. Kassera bufferten efter varje tvätt.
- Efter användande wash media, lagra den på isen för användning i steg 3,14.
- Tvätta provet 2 x med HBSS/CS. Tillsätt 10 mL av HBSS/CS buffert (HBSS; 5% CS buffert i steg 3.1.1 som har lagrats på is) till cell silen och rör ned det i 800 rpm för 5 min i en 37 ° C inkubator. Kassera bufferten efter varje tvätt.
- Inkubera vävnaden i EDTA-fria tvättbuffert. Tillsätt 10 mL av EDTA-fria tvättbuffert (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES buffert som gjordes i steg 3.1.4 och förvaras i rumstemperatur) till cell silen och inkubera plattan för 10 min i rumstemperatur utan omrörning. Kassera buffert i slutet av detta steg.
- Tvätta provet 2 x med HBSS/CS och förbereda enzym lösningen. Tillsätt 10 mL av HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffert i steg 3.1.1 som har lagrats på is) buffert till cell silen och rör ned det i 800 rpm i 10 min i en 37 ° C inkubator. Kassera bufferten efter varje tvätt.
- Bered det enzym (EDTA-fria tvätta buffert; 0,1 mg/mL DNAS I; 167 mg/mL kollagenas) under perioden andra tvätt: lägga till 9 mg av DNAS jag och 15 mg frystorkade kollagenas till 90 mL EDTA-fria tvätta buffert. Förvara lösningen i rumstemperatur.
- Smälta den lamina propria fraktionen i cell silen att erhålla lamina propria lymfocyter (LPLs). Tillsätt 10 mL av enzymet lösningen (den EDTA-fria tvättbuffert; 0,1 mg/mL DNAS I; 167 mg/mL kollagenas buffert i steg 3.12.1 och förvaras i rumstemperatur) till cell silen och rör ned det i 800 rpm för 45 min i en 37 ° C inkubator.
Obs: LPLs släpps ut i lösningen efter enzymatisk nedbrytning.- Samla enzym lösningen som innehåller celler och filtrera det genom en ny cell SIL till en 50 mL konisk tub.
- Tillsätt 20 mL kall wash media (HBSS; 1% CS; 1mM EDTA buffert görs i steg 3.1.3 och lagrade på is i steg 3.9.1) till filtrerade celler att blockera aktiviteten kollagenas i enzymet lösningen. Centrifugera röret vid 700 x g i 6 min i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten innehållande LPLs i 1 mL FACS buffert.
- Kombinera IEL (från steg 3.7.1) och LPL (från steg 3.14) fraktioner och färga dem med lysrör-konjugerade antikroppar för flöde flödescytometrisk analys (se steg 5).
Obs: IEL och LPL fraktioner kan färgas separat om facket information önskas.
4. isolering av lymfocyter från mjälte
- Förbereda samling röret genom att lägga till 500 µL av FACS buffert i en mikrocentrifug rör. Förvara den på isen.
- Efter avlägsnande av tjocktarmen (steg 3,4), skörd hela mjälten och placera det i samling röret. Lagra vävnaden på is.
- Med hjälp av en elektrisk vävnad Homogenisatorer, homogenisera mjälte i en mikrocentrifug rör för ca 1 min. Centrifugera provet vid 300 x g [micro centrifug] för 5 min i rumstemperatur och aspirera av supernatanten.
- Utföra den röd blod cell lysis genom omblandning provet i 500 µL av ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringsbuffert att initiera celldöd genom osmotisk Lys. Låt provet Inkubera 1-2 min i rumstemperatur och sedan blandas det i 725 µL FACS buffert.
- Centrifugera provet vid 300 x g [micro centrifug] för 5 min i rumstemperatur och aspirera av supernatanten. Återsuspendera pelleten i 500 µL av FACS buffert och filtrera den genom en sil med 40 µm i cellen till en ny mikrocentrifug rör. Överför hela provet till ett nytt mikrocentrifug rör och färga det med lysrör-konjugerade antikroppar för flöde flödescytometrisk analys (se steg 5).
5. identifiering av Kalopsida-r+ celler med hjälp av Flow flödescytometri
- Centrifugera IEL/LPL och mjälte proverna vid 300 x g [micro centrifug] för 5 min i rumstemperatur och aspirera av supernatanten.
- Återsuspendera pellets i 100 µL av antikroppen färgning mix. Förbereda antikroppen färgning mix genom att lägga till 1 µL av fluorescently-konjugerad anti-CD45 antikroppen 100 µL av FACS buffert per prov.
Obs: Det är viktigt att titrera de antikroppar som används för flödescytometri före experimentet för att bestämma den optimala koncentrationen var bindande mättnad uppstår. - Inkubera proverna för 35 min på is (på ett mörkt ställe).
- Återsuspendera proverna i 300 µL av FACS buffert och centrifugera dem 300 x g [micro centrifug] för 5 min i rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återsuspendera proverna i 325 µL av FACS buffert. Analysera proverna på en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fiberoptisk kabel användes att leverera 405 nm ljus in kolon av 2 - dag-gammal PhAMcensurerade möss. I tidigare experiment fastställdes en 30 s exponering att ge en maximal photoconversion av kolon celler med minimal cytotoxicitet (figur 1A). Sekventiell 30 s exponeringar av olika segment av kolon utfördes därför som beskrivs i protokollet. Efter laser exponering, mössen var omedelbart avlivas och photoconversion av cellerna bestämdes. Encelliga preparat av totala colonic vävnad var målat med lysrör-konjugerad anti-CD45 antikropp och flöde flödescytometrisk analys utfördes för att identifiera photoconversion. Oomvända Dendra2-green (Kalopsida-g) protein har excitation och utsläpp maxima vid 490 och 553 nm respektive och kan upptäckas i FITC-kanalen, medan photoconverted Dendra2-röd (Kalopsida-r) protein har excitation och utsläpp maxima vid 507 och 573 nm respektive och kan upptäckas i PE kanalen av en flödescytometer. När irreversibelt bytte till dess röda form, Dendra2 är mycket fotostabilt och användbart för långsiktiga tracking program.
Inga Kalopsida-r+ celler upptäcktes i unlasered möss (figur 1B vänster). 405 nm ljus exponering resulterade dock i distinkta Kalopsida-r+ cellpopulationer i både CD45neg och CD45+ cell fack (figur 1B höger). Att avgöra om protokollet colonic photoconversion resulterade i bakgrunden märkning av celler vid extra intestinal platser, vi avverkat mjälte från nyligen photoconverted möss (T = 0) och analyseras för Kalopsida-r+ celler av flödescytometri. Inga Kalopsida-r+ celler upptäcktes i CD45neg eller CD45+ cell fack (figur 1C), vilket tyder på att intra-colonic laserstrålen inte tränga tillräckligt för att photolabel celler i mjälten. Således Kalopsida-r+ celler upptäckts i mjälten efter ger tid för migreringen (T = 3d, 5d) ska ha sitt ursprung från tjocktarmen.
Figur 1 : In vivo photoconversion colonic vävnad. Cellerna i tjocktarmen från 2 - dag-gammal PhAMcensurerade pups utsattes för intra-colonic 405 nm ljus för 30 s som beskrivs. Photoconversion och märkning av cellerna bestämdes omedelbart efter ingreppet (T = 0) genom ett flöde flödescytometrisk analys av encelliga preparat colonic vävnad och mjältens. (A) denna representativa flöde flödescytometrisk dot tomt visar uttrycket av CD45 (x-axeln) och färgningen av levande döda färgämnet (y-axeln) i encelliga preparat från kolon av kontroll och lasered möss. Paneler B och C är representativa flöde flödescytometrisk dot tomt överlägg som visar uttrycket av proteinet Dendra2-gröna (Dendra2-g, horisontell-axel) och Dendra2-röd protein (Dendra2-r, vertikal axel) i kontroll-oexponerade och exponerade CD45+ (hematopoetiska) och CD45neg (icke-hematopoetiska) celler i (B) kolon och ()C) mjälte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Data från en typisk photoconversion experiment att identifiera flyttande celler i mjälten visas i figur 2. Photoconversion av cellerna i kolon av 2 - dag-gammal PhAMcensurerade möss utfördes enligt figur 1. Möss var euthanized 3 och 5 dagar efter exponeringen och förekomsten av Kalopsida-r+ celler i mjälten bestämdes av flödescytometri. Det fanns ingen Kalopsida-r+ i CD45neg cell delmängden, konsekvent med att CD45neg cellerna är främst epiteliala och andra strukturella celler i tarmen. Vissa CD45+ hematopoetiska celler uttrycks Kalopsida-r, vilket tyder på att de hade varit photoconverted i kolon och migrerat till mjälten.
Figur 2 : CD45+ hematopoetiska celler migrerar från tjocktarmen till mjälte. Nyfödda (dag 0 - 2) PhAMcensurerade möss utsattes för 405 nm ljus till photoconvert Dendra2 protein av intra-colonic exponering. Representativa flöde flödescytometri tomterna Visa uttrycket av proteinet Dendra2-gröna (Dendra2-g, kategoriaxeln) och Dendra2-röd protein (Dendra2-r, vertikal axel) i CD45neg och CD45+ mjältceller oexponerad 5-dagar gamla möss och utsatt möss analyseras på 3 och 5 dagar (T = 3d, 5d) efter photoconversion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiering och karakterisering av celler som interagerar med och påverkas av bakterieflora i tjocktarmen är viktiga och bör underlätta förståelse av hur information från de slemhinnor mikromiljö vidarebefordras till resten av kroppen. En metod för att studera gut-relaterade cellmigration kräver isolering av gut-associerade celler som följde av en överföring in i mottagarens möss att avgöra deras vävnad-homing mönster och funktion12,13. Detta tillvägagångssätt är begränsad, eftersom endast specifika celltyper som överförts kan spåras. Artefakter som följd av isoleringen av cellerna från vävnader och reningsprocessen kan dessutom hindra i vivo flyttande processen. Mer nyligen, en endoskopisk photoconversion protokollet att märka intestinala celler använder Kaede möss var rapporterade14. Denna studie fann en bred människohandel av leukocyter till och från tarmen vuxna möss.
Vår rapport beskriver en metod att etiketten cellerna i tjocktarmen av nyfödda möss och spåra deras migration till extra intestinal platser såsom mjälten. PhAMcensurerade musen uttrycker ubiquitously en photoconvertible grön fluorescerande Dendra2 protein som är oåterkalleligt bytte till röd fluorescens vid dess aktivering av UV-ljus. Exponering för kolon av nyfödda möss 405 nm ljus märkt både CD45+ hematopoetiska och CD45neg icke-hematopoetiska celler. CD45+Dendra2-röda+ celler upptäcktes i mjälten 3 till 5 dagar efter den photoconversion, som anger extra intestinal migration av hematopoetiska celler.
Det hastighetsbegränsande steget för denna analys är fraktionen av kolon området som utsätts för 405 nm ljus. Bräckligheten i det nyfödda kolonet och förekomsten av pall, begränsa om än minimal vid denna tidiga ålder, längden på fiber optic kanylen som kan infogas. I tidigare experiment, kunde en längre kanyl inte framgångsrikt infogas mer än 5 mm. Smörjmedel undveks på grund av den varierande ljusbrytning av laserstrålen. Den yttre rörelsen av kanylen varje 30 s hjälpt maximera colonic område utsätts för laserljuset. Ännu viktigare, en kanyl med en stor NA-värde (NA = 0,5) användes för att generera en bred kon av ljus i kolon.
Detta protokoll har standardiserats för nyfödda (dag 0 - 2) PhAMcensurerade pups. Eftersom ändringar i innehåll och längd i tjocktarmen med en ålder av möss, kommer tekniken ha optimeras med detta när du använder äldre valpar. I första hand blir ändringar till den totala varaktigheten av photoconversion och längden på införandet av fiber optic kanylen nödvändigt.
Detta sätt att förstå beteendet flyttande av cellerna i tjocktarmen underlättas av flöde flödescytometrisk analys. Multi-parameter flödescytometri kan ytterligare används för att identifiera och fenotyp den migrerande immunceller typer inom CD45+ cell delmängd. Dendra2-r+ celler kan också sorteras efter FACS för nedströms applikationer såsom gen uttryck profilering eller proteomik analyser. Regisserade till förståelsen av hematopoetiska celler delmängder i tjocktarmen i denna studie, medan metoden kan anpassas för att studera cellulära migration från ytterligare vävnad platser inklusive hjärnan och huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Nitya Jain stöddes av en NIH/NIAID karriär övergång Award 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
