Summary
여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.
Abstract
장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6장 상피에서 상주 합니다. 수많은 종류의 면역 세포 (수지상 세포, monocytes, 대 식 세포 등) 골수성 세포 뿐만 아니라 림프 톨 (T 세포, B 세포, 타고 난 림프 세포 등)을 포함 한 소장에 있습니다. 이러한 세포, 조 혈 모 세포로 알려진 다양 한 장 벽을 유지 하 고 항상성 유지 기능을 수행 합니다.
그들의 규정 하는 기능 장의 사이트에서 뿐만 아니라 점 막의 면역 세포 조직의 면역7,,89규제 미생물 메시지 여분 장 사이트를 반입할 수 있습니다. 성장 연구 관심 분야 이며 그들의 기능을 조사 하기 위해 장 조직을 마이그레이션할 면역 세포를 식별 하는 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기 보고 프로토콜 레이블 셀에 photoconvertible 형광 단백질은 악용 상용 마우스 모델을 이용 한다. 팜과excised 쥐 편은 레스터 전환 활성화 시 빨간색 형광 자외선 (UV) 빛10녹색 형광 Dendra2 단백질을 표현 한다. 섬유 광섬유 정을 사용 하 여 신생아 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 제공 하는에서 유래 했거나 콜론 통해 통과할 photoconverted 조 혈 모 세포는 비장에서 찾을 수 있습니다 설명 합니다.
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Protocol
모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다.
주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다.
1. 디자인 및 레이저
- 라이트-발광 다이오드 (LED)를 연결 (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, 섬유 결합) 하는 LED 드라이버를 통해 오는 4 핀 M8 커넥터 케이블 LED에 연결. 조심 스럽게 연결 고정 하는 나사를 조입니다.
- Optogenetics 패치 케이블 LED를 연결 하기 전에 커넥터를 잡고 LED의 최대 개방 거기 있도록 빛은 볼 수 없는 장애물. 필요한 경우 이물질을 제거 하 여 optogenetics 패치 케이블을 삽입 구멍에 불어.
- 커넥터 슬리브의 한쪽 끝에는 정을 삽입 하 여 섬유 광섬유 정 optogenetics 패치 케이블을 연결 합니다. 패치 케이블을 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 연결을 보호 하지만 구부리거나 광섬유를 정 맥에 휴식을 조심 하는 충분 한 압력을 적용 합니다.
참고: 연약한 섬유 광섬유 정 맥으로 덮여 있다 보호 모자 때마다 레이저 사용 되지 않습니다. - 0과 1.2 A. 설정 전류 제한에 지속적인 조정 손잡이와 연속파 (CW) 모드를 설정 하는 LED 드라이버
2입니다. 결 장에서 세포의 Photoconversion
참고: 남성 및 여성 쥐 intracolonic 405 nm 빛에 드러낸 그들의 출생 후 1-2 일 및 나이의 1 주 전에 희생 되었다.
- 전원 콘센트에 대 한 액세스와 함께 어두운 위치를 확보. LED 드라이버를 콘센트에 꽂습니다.
참고:이 절차에서에서 수행 됩니다 최소한의 하얀 빛으로 주위 빛에 쥐의 긴 노출 셀의 원치 않는 photoconversion를 발생할 수 있습니다. 레드 빛 대신 사용 됩니다.
주의: 다음 단계는 동물 마 취의 사용을 포함 한다. 마 취의 관리 클래스 II 후드에서 또는 다른 적절 한 청소 시스템을 사용 하 여 일어난다. 현기증, 졸음, 또는 심지어 무 의식 흡입 마 취의 발생할 수 있습니다. - 4-5 %isoflurane 유도 상자에 100% o 2에 노출에 의해 마우스를 anesthetize. 단단히 꼬 집는 뒷 발 (응답) 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 약 2 %isoflurane 코 콘을 통해 마 취를 유지 합니다. 적절 한 후드 또는 마 취 청소 장치를 사용 하 여 처리기 isoflurane 노출을 방지 합니다.
- 위치 1을 사용 하 여 intracolonic 노출에 대 한 마 취 마우스 손을 아저씨는 검지 손가락과 엄지손가락으로 부드럽게 마우스의 뒷면. 복 부를 노출 하는 마우스를 넘겨. 마우스의 핑크 색상을 잃고 시작 하는 경우 또는 호흡 속도 천천히 시작 하는 경우는 그립을 풉니다. 반지와 작은 손가락 사이의 마우스의 꼬리를 보호 합니다.
- 다른 한편으로는 정 맥에서 보호 캡을 제거 합니다. 유지 하면서 정 마우스의 중간에 평행의 긴 축 부드럽게 삽입 항문을 통해 섬유 광섬유 정 콜론으로 광섬유의 모든 5 m m 마우스 안에 있습니다.
참고:이 절차는 천천히, 그리고 신중 하지 저 승 벽 구멍을 수행 됩니다. 분은 정의 왜곡 하 고 방도 에이즈 콜론으로 발전. - 안전 고글을 착용 하 고 최대 값 (모든 방법 시계 방향으로) 현재 레이저를 증가. 마우스의 반투명 복 부에 보고 하 여 UV 빛의 존재를 확인 합니다.
참고: LG3 레이저 안전 고글은 극적으로 가시성을 감소. 동료 (입고 보호 장비) 레이저에서 고글을 donning 및 도움이 있다. - 노출 2 분 철수 정 약 1 m m의 총 빛 레이저에 콜론 모든 30의 빛에 노출 luminal 영역을 최대화 하기 위해. 2 분의 끝에, 해제 레이저.
- 천천히 마우스에서은 정을 제거 합니다. 빈 따뜻한 케이지 마 취에서 회복 후, 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
3입니다. 창 자 세포의 고립
- 행 크의 균형 소금 솔루션/송아지 혈 청 (HBSS/CS) 버퍼의 1 L, 상피 스트립 버퍼의 200 mL, 500 mL의 세척 미디어, 그리고 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 200 mL를 준비-무료 세척 미디어.
참고: 시 약 볼륨 9의 샘플 크기에 대 한 계산 됩니다.- HBSS 950 mL에 CS의 50 mL를 추가 하 여 (HBSS; 5 %CS) HBSS/CS 버퍼를 확인 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.
- CS, 1 M DTT, 0.5 M EDTA의 2 mL 및 1 M HEPES 버퍼의 3 mL 200 µ L의 10ml 185 mL을 추가 하 여 상피 스트립 버퍼 [HBSS, 5 %CS, 1 m m dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) (pH 7.2-7.5)]를 준비 HBSS의. 37 ° C 물 욕조에 상피 스트립 버퍼를 놓습니다.
- HBSS 494 mL에 CS의 5 mL 및 0.5 M EDTA의 1 mL을 추가 하 여 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA)를 확인 합니다. 실 온에서 보관 합니다.
- HBSS 195 mL에 2 mL의 CS와 1 m HEPES 3 mL를 추가 하 여 EDTA 무료 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES)를 준비 합니다. 실 온에서 보관 합니다.
- FACS 버퍼 만들기 [버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 (pH 7.2 =); 2 %CS] CS의 10 mL PBS의 490 mL에 추가 하 여. 얼음에 그것을 저장 합니다.
- 60 x 10 m m 문화 접시 안에 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 여 조직 컬렉션 접시를 준비 합니다. 접시에 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된)의 10 mL를 추가 하 고 얼음에 그것을 배치.
- 마우스를 통해 적절 한 마 취의 청소를 사용 하 여 흡입된 isoflurane의 과다를 안락사 (에 약 3 분 노출 > 4% isoflurane 100% O2또는 방 공기에서). 호흡의 명백한 중단 후 반사 운동, 뒷 발을 확고 하 게 곤란 하 여 깊은 고통의 부재를 확인 (집게를 사용 하는 것이 좋습니다). 수술가 위 또는 새로운 면도칼을 사용 하 여 잘린 통해 안락사 확인 합니다.
참고: 자 궁 경부 전위 크기와 동물의 나이 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 이러한 방법은 안락사에 AVMA 지침을 2013와 일치 되며 MGH IACUC에 의해 승인. - 복 부를 열고 깨끗 한 집게와가 위를 사용 하 여 콜론을 수확. 마우스의 복 부를 노출 콜론의 1 측에 내장을 반영 합니다. 먼저 그것은 단지 (항문)으로 원심 transecting에 의해 전체 콜론 제거 맹 하. 그런 다음 집게와 콜론을 단단히 잡고, 항문에 요도 통해 잘라가 위를 사용 합니다. 최대한 항문 주변으로 콜론을 잘라. 콜론을 제거 후 비장 수확 (4.1-4.2 아래 단계를 참조).
참고: photoconversion 프로토콜만 신생아의 콜론 (섬유 광섬유 정 5 m m)의 25%를 대상으로, 하는 동안 전체 콜론 셀 격리에 도움이 수확 이다. - 결 장 그리고 건조 종이 타월에 내용을 밀어 집게를 사용 하 여 콜론을 청소. 조직 문화 접시의 커버에 붙여넣기 콜론 잘게 잘라를 다음 페 트리 접시에 셀 스 트레이너를이 붙여넣기를 전송 면도날을 사용 하 여 균질.
- 깨끗 한 8 m m 긴 자기 저 어 바는 여과기를 추가 하 고 9 위치 자력 접시에 접시를 놓고. 800 rpm에 자석 볶음 바 속도 설정 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 셀을 품 어. 버퍼를 삭제 하 고 HBSS/cs (는 HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된) 10 mL를 사용 하 여 세척을 반복 합니다. 세척 후에 버퍼를 삭제 합니다.
- 셀 스 트레이너를 prewarmed 상피 스트립 버퍼 (는 HBSS, 5 %CS, 1mm DTT; 5 mM EDTA, 15 mM HEPES [pH 7.2-7.5] 버퍼 하 단계 3.1.2에서 37 ° C 물 욕조에 저장)의 10 mL를 추가 하 여 상피 세포를 분리 하 고 800 rpm는 3에서 30 분 저 어 7 ° C 인큐베이터입니다. 보육의 끝에, 깨끗 한 15 mL 튜브에 상피 분수에서 풍성 하 게 하는 버퍼를 전송 합니다.
참고: 상피와 관련 된 셀 (장 상피 세포 및 장 상피 세포)는 발표는 버퍼에 그대로 lamina propria 에 셀11단계 동안 셀 스 트레이너에서 남아 있는 동안.- 실 온에서 5 분 동안 700 x g에서 농축된 장 상피 분수 (IELs) 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 3.15 단계에서 사용 하기 위해 얼음에 그것을 저장 합니다.
- 셀 스 트레이너 2 내 lamina propria 분수를 씻어 HBSS/CS와 x. 이렇게 하려면 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 솔루션 (HBSS, 얼음에 저장 된 단계 3.1.1에서에서 만들어진 5 %CS 버퍼) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.
- 샘플 2 세척 세척 미디어에 x. 셀 스 트레이너를 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼를 단계 3.1.3에서 실내 온도에 저장) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 15 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.
- 사용 후 세척 미디어, 단계 3.14에서에서 사용에 대 한 얼음에 저장 합니다.
- 샘플 2 세척 HBSS x/CS. 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 얼음에 저장 되어 있는)의 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.
- EDTA 무료 워시 버퍼에서 조직 품 어. 셀 스 트레이너를 EDTA 무료 워시 버퍼 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES 버퍼를 단계 3.1.4에서 실내 온도에 저장)의 10 mL를 추가 하 고 교 반 하지 않고 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어. 이 단계의 끝에 버퍼를 삭제 합니다.
- 워시 샘플 2 x HBSS/CS 효소 솔루션을 준비 하 고. HBSS/cs (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1 얼음에 저장 된에서) 10 mL를 추가할 셀 스 트레이너를 버퍼링 하 고 37 ° C 배양 기에서 10 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.
- 효소 솔루션 준비 (씻고 EDTA 무료 버퍼; 0.1 mg/mL DNase 나; 167 mg/mL 콜라) 두 번째 세척 기간 동안: 9 밀리 그램을 추가 DNase의 나, EDTA 무료의 90 mL을 동결 건조 된 콜라의 15 mg 세척 버퍼. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다.
- Lamina propria 분수 lamina propria 림프 톨 (LPLs)을 얻기 위해 셀 여과기에 포함 된 소화. 효소 솔루션의 10 mL를 추가 (EDTA 무료 워시 버퍼; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL 콜라 버퍼 3.12.1 단계에서 만든 및 실내 온도에 저장) 셀 스 트레이너를 37 ° C 배양 기에서 45 분 800 rpm에서 그것을 저 어.
참고: LPLs 효소 소화 후 솔루션으로 해제 됩니다.- 셀을 포함 하는 효소 솔루션을 수집 하 고 50 mL 원뿔 관으로 새로운 셀 스 트레이너를 통해 필터링.
- 효소 솔루션에서 콜라 활동을 차단 하는 필터링 된 셀에 차가운 세척 미디어 (는 HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼링 단계 3.1.3에서에서 만들어지고 저장 단계 3.9.1에서에서 얼음에) 20 mL를 추가 합니다. 실 온에서 6 분 700 x g에서 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 1 mL에 LPLs를 포함 하는 펠 릿.
- (3.7.1 단계)에서 IEL과 (3.14 단계)에서 LPL 분수 결합 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 그들을 얼룩 (단계 5 참조).
참고: IEL와 LPL 분수 수 있습니다 얼룩이 질 별도로 구획 정보를 원하는 경우.
4입니다. 비장에서 세포의 고립
- Microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.
- 콜론 (3.4 단계)를 제거한 후 전체 비장을 수확 하 고 컬렉션 튜브에 배치 합니다. 얼음에 조직을 저장 합니다.
- 실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 약 1 분 원심 분리기에 대 한 microcentrifuge 튜브에 비장 균질 전기 조직 균질 화기를 사용 하 여.
- 삼투성 세포에 의해 세포 죽음을 시작 하려면 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에서 샘플을 resuspending 하 여 적혈구 세포를 수행 합니다. 실 온에서 1-2 분을 품 어 다음 FACS 버퍼의 725 µ L에서 resuspend을 샘플을 수 있습니다.
- 실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 원심 FACS 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 새로운 microcentrifuge 튜브 전체 샘플 전송 및 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 얼룩 (단계 5 참조).
5. Dendra-r+ 세포를 사용 하 여 흐름 Cytometry 식별
- 실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 IEL/LPL, 비장 샘플 원심
- 믹스를 얼룩이 지는 항 체의 100 µ L에 산 탄을 resuspend. 샘플 당 FACS 버퍼의 100 µ L를 붙일 활용 된 안티 CD45 항 체의 1 µ L을 추가 하 여 혼합을 얼룩이 지는 항 체를 준비 합니다.
참고: 적정 항 체 사용 실험 전에 cytometry 최적 농도 결정 하기 위해 채도 바인딩 발생 합니다 중요 하다. - (어두운 곳)에 얼음에 35 분 샘플을 품 어.
- FACS 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 원심. 발음은 상쾌한 고 FACS 버퍼의 325 µ L에서 샘플을 resuspend. 교류 cytometer에 샘플을 분석 합니다.
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Representative Results
광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀의 photoconversion 결정 했다. 총 결 장 조직의 단일 셀 준비 했다 형광 활용 된 안티 CD45 항 체로 얼룩진 고 흐름 cytometric 분석 photoconversion를 검출 하기 위하여 수행 되었다. 비전향 Dendra2-그린 (Dendra-g) 각각 490 553 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 단백질과 photoconverted Dendra2-레드 (Dendra-r) 단백질 507 573 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 반면 FITC 채널에서 검출 될 수 있다 각각의 교류 cytometer PE 채널에 검출 될 수 있습니다. 레스터 빨간 형태로 전환, 일단 Dendra2은 높은 photostable 및 장기 추적 응용 프로그램에 유용.
Dendra-r+ 셀 unlasered 마우스 (그림 1B 왼쪽)에서 발견 되었다. 그러나, 405 nm 빛 노출 귀착되 었 다 CD45neg CD45에 뚜렷한 Dendra-r+ 세포 인구+ 세포 구획 (그림 1B 오른쪽). 저 승 photoconversion 프로토콜 장 외 사이트에서 셀의 배경 라벨에 한 경우, 우리가 수확 spleens 새로 photoconverted 쥐에서 확인 하려면 (T = 0) cytometry에 의해 Dendra-r+ 세포에 대 한 분석 및. Dendra-r+ 셀 CD45neg 또는 CD45에서 발견 된+ 세포 구획그림 1(C), 내 저 승 레이저 빔 photolabel 셀 비장에 충분히 침투 하지 않았다 제안. 따라서, 비장에는 마이그레이션에 대 한 시간 후 감지 Dendra-r+ 셀 (T = 3d, 5d) 콜론에서 유래 한다.
그림 1 : Vivo에서 저 승 조직 photoconversion. 2 일 오래 된 팜과excised 새끼에서 콜론의 세포 30에 대 한 내 저 승 405 nm 빛에 드러낸 s 설명. photoconversion와 셀 라벨 절차 후 즉시 결정 되었다 (T = 0) 저 승 조직과 비장의 단일 셀 준비의 흐름 cytometric 분석에 의해. (A)이 대표적인 흐름 cytometric 점 줄거리의 CD45 식을 보여 줍니다 (x-축) 살고 죽은 염료의 얼룩이 지 고 (y-축) 제어와 레이저 마우스의 콜론에서 단일 셀 준비에. 패널 B 와 C 는 Dendra2-그린 단백질의 표현을 표시 하는 대표적인 흐름 cytometric 점 플롯 오버레이 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) 제어 unexposed에 CD45 노출+ (조 혈) 및 CD45neg (조 혈 비) 셀 (B)에 결 장 및 (C)는 비장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비장에 철새 셀을 식별 하는 전형적인 photoconversion 실험에서 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 셀의 photoconversion는 그림 1과 같이 수행 되었다. 마우스는 노출 후 3 ~ 5 일 안락사 했다 고 비장에 Dendra-r+ 세포의 존재는 cytometry에 의해 결정 되었다. CD45neg 셀 하위 집합, CD45neg 셀은 주로 상피 보기과 일치에 Dendra-r+ 셀 및 내장의 다른 구조 세포가 있었습니다. 일부 CD45+ 조 혈 모 세포 표현 Dendra-r, 그들은 결에 photoconverted 되어 졌고 비장을 마이그레이션 제안.
그림 2 : CD45+ 조 혈 모 세포는 비장에 결에서 마이그레이션할. 신생아 (주 0-2) 팜과excised 쥐 내 저 승 노출 photoconvert Dendra2 단백질에 405 nm 빛에 노출 되었다. 대표적인 교류 cytometry 플롯 표시 Dendra2-그린 단백질의 표현 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) CD45neg 에 CD45+ unexposed 5 일 된 쥐의 비장 세포와 3 ~ 5 일에서 분석 하는 쥐를 노출 (T = 3d, 5d)는 photoconversion 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으로 전송 된 특정 셀 종류만을 추적할 수 있습니다. 또한, 조직 및 정화 과정에서 세포의 고립에서 발생 하는 아티팩트 vivo에서 철새 프로세스를 방해 수 있습니다. 더 많은 최근 내 시경 photoconversion 프로토콜 창 자 세포가 마우스를 사용 하 여 라벨을 보고14이었다. 이 연구는 성인 쥐에 백혈구는 소장에서의 광범위 한 매매 발견.
우리의 보고서 레이블 셀 신생아 쥐의 콜론에 메서드를 설명 하 고 비장 등 장 외 사이트에 그들의 이동 추적. 팜과excised 마우스 photoconvertible 그린 형광 Dendra2 단백질은 돌이킬 전환 정품 인증 시 빨간색 형광 UV 빛에 의해 표현 하는 편. 신생아 쥐의 콜론의 405 nm 빛에 노출 표시 모두 CD45+ 조 혈 및 CD45neg 비 조 혈 세포. CD45++ Dendra2-레드 셀 비장에 발견 된 photoconversion, 조 혈 모 세포의 여분 장 마이그레이션 나타내는 후 3 ~ 5 일.
이 분석 결과 대 한 속도 제한 단계는 저 승 지역 405 nm 빛에 노출 되는의 일부분 이다. 신생아 콜론의 취약성 및의 자의 존재 임에도 불구 하 고 최소한의이 이른 나이에 삽입할 수 있는 섬유 광섬유 정 맥의 길이 제한 합니다. 이전 실험에서 더 이상 정 수 없습니다 성공적으로 삽입 5 m m 이상. 윤활제는 레이저 광선의 변수 빛 굴절 될 위험이 피할 했다. 정 맥의 바깥쪽 움직임 모든 30의 레이저 빛에 노출 저 승 영역을 극대화 하는 데 도움이. 중요 한 것은, 큰 나 값으로 정 (NA = 0.5) 콜론에 빛의 넓은 콘을 생성 하는 데 사용 되었다.
이 프로토콜 신생아 (주 0-2)에 대 한 표준화는 팜과excised 새끼. 콘텐츠 및 쥐의 결 장의 길이에 변화를 주어, 기술 이전 새끼를 사용 하는 경우 그에 따라 최적화 되어야 할 것 이다. 주로, 섬유 광섬유 정 맥의 삽입 길이 photoconversion의 총 기간을 수정 해야 합니다.
결 장에서 세포의 철새 행동 이해에이 접근은 흐름 cytometric 분석에 의해 촉진 된다. 멀티 파라미터 cytometry를 더 사용할 수 있습니다 식별 하 고 형 이주 면역 세포는 CD45 내+ 세포 부분 집합. Dendra2-r+ 세포 유전자 식 프로 파일링 또는 proteomics 분석 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 FACS에 의해 정렬할 수 있습니다. 이 연구에서는 콜론 하위 집합 조 혈 세포의 이해로 이동 하는 동안 메서드는 두뇌와 피부를 포함 하 여 추가 조직 사이트에서 세포 이동 공부에 적응 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
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- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
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- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
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- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
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- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
