نظام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لدراسة الغزو وتقييم المداواة في سرطان المثانة
Summary
وتمثل العمليات التي تحكم غزو سرطان المثانة فرصاً للعلامات البيولوجية والتنمية العلاجية. هنا نقدم نموذجا غزو سرطان مثانة الذي يتضمن الثقافة ثلاثي الأبعاد من الماغنيسيوم الورم والوقت الفاصل بين التصوير والفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الأسلوب مفيد لتحديد ملامح عملية الغازية وفحص العوامل العلاجية.
Abstract
سرطان المثانة مشكلة صحية كبيرة. ويقدر أن أكثر من 000 16 شخص سيموتون هذا العام في الولايات المتحدة من سرطان المثانة. بينما 75% سرطان المثانة غير الغازية ومن غير المرجح أن السرطاني، تقدم حوالي 25% إلى نمط نمو الغازية. وسيضع يصل إلى النصف من المرضى الذين يعانون من حالات السرطان الغازية الانتكاس المنتشر الفتاكة. ومن ثم، فهم إليه تطور سرطان المثانة الغازية أمر حاسم للتنبؤ بنتائج المرضى ومنع الانبثاث قاتلة. في هذه المقالة، نحن نقدم نموذجا غزو سرطان ثلاثية الأبعاد التي تتيح إدراج الخلايا السرطانية ومكونات stromal لتقليد في فيفو الظروف التي تحدث في المثانة وورم المكروية. هذا النموذج يوفر الفرصة لمراقبة عملية الغازية في الوقت الحقيقي باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير، واستجواب المسارات الجزيئية المعنية باستخدام مركبات التصوير والشاشة إيممونوفلوريسسينت [كنفوكل] مع إمكانية غزو كتلة. وبينما يركز هذا البروتوكول على سرطان المثانة، فمن المرجح أنه يمكن استخدام طرق مماثلة لبحث الغزو وحركية في أنواع أخرى من الأورام، وكذلك.
Introduction
الغزو هو خطوة حاسمة في تطور السرطان، مما هو مطلوب لورم خبيث، ويرتبط مع بقاء أقل وسوء التشخيص في المرضى. في سرطان المثانة البشرية، خبيثة الأكثر شيوعاً للمسالك البولية الذي يتسبب في وفاة حوالي 165,000 سنوياً في جميع أنحاء العالم، ترتبط مباشرة مرحلة السرطان والعلاج والتشخيص على وجود أو عدم وجود الغزو1. حوالي 75% حالات سرطان المثانة غير العضلات الغازية، وهي تدار ببتر المحلية. وفي المقابل، سرطان المثانة العضلات الغازية (حوالي 25 في المائة من جميع الحالات) هي الأورام العدوانية مع ارتفاع معدلات المنتشر ويتم التعامل مع العدوانية موقفية العلاج2،3. ولذلك، فهم المسارات الجزيئية التي تؤدي إلى غزو ضروري لتوصيف مخاطر تطور الغازية أفضل وتطوير التدخلات العلاجية التي يمكن أن تحول دون تطور الغازية.
تطور الورم الغازية يحدث في بيئة (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد معقدة وتتضمن ورم الخلية التفاعل مع سائر الخلايا السرطانية وسدى والغشاء وأنواع أخرى من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المناعية، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات والأوعية الدموية خلايا بطانية. دعم نفاذية (مثلاً، ترانسويل) نظم التحليل وتستخدم عادة كوانتيتاتي سرطان الخلية غزو4، ولكن هذه النظم محدودة نظراً لأنها لا تتيح الرصد المجهري لعملية الغزو في الوقت الحقيقي استرجاع العينات لتلطيخ المزيد والتحليل الجزيئي التحدي. تطوير نظام كروي ورم المثانة ثلاثي الأبعاد لدراسة الغزو المرغوب فيه لأنه يسمح بإدماج مكونات ميكرونفيرونمينتال المعرفة مع توفير الراحة للنظم في المختبر .
في هذا البروتوكول، يصف لنا نظام استجواب العمليات الغازية من خلايا سرطان المثانة البشرية باستخدام مقايسة غزو كروي ثلاثي الأبعاد إدراج مصفوفات جل المستندة إلى الكولاجين والفحص المجهري [كنفوكل] للسماح لمحققين لرصد حركية الخلية و الغزو في الوقت الحقيقي (الشكل 1أ). هذا النظام هو تنوعاً ويمكن تعديلها لاستجواب مختلف ورم stromal/إعدادات. أنها تتضمن معظم خطوط خلايا سرطان المثانة أو أورام المثانة الأولية والخلايا اللحمية إضافية مثل السرطان المرتبطة الليفية والخلايا المناعية5،،من67. هذا البروتوكول توضح مصفوفة تتكون من الكولاجين 1 نوع، ولكن يمكن تعديلها لإدراج جزيئات أخرى مثل فيبرونيكتين أو لامينين أو بروتينات الكولاجين الأخرى. يمكن أن تتبع العمليات الغازية ح 72 أو أكثر اعتماداً على قدرة النظام المستخدمة والمجهر. التثبيت وتلطيخ الفلورة الورم جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ثلاثية الأبعاد قبل وأثناء وبعد غزو يسمح استجواب upregulated البروتينات في الخلايا الغازية، وبالتالي توفير المعلومات الحاسمة التي عادة ما تكون غائبة أو صعوبة في جمع استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد من ثقافة أخرى. ويمكن استخدام هذا النظام أيضا مركبات الشاشة التي منع الغزو، وتحدد مسارات إشارات المتضررين من هذه المركبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا نموذج كروي ورم ثلاثية الأبعاد التي تتيح المراقبة في الوقت الحقيقي من غزو سرطان المثانة هو أمر حاسم لتقدم وتطور سرطان خبيث. وهذا النظام قابلة لإدماج مختلف مكونات stromal والخلوية السماح لمحققين بالخص أفضل المكروية الأنسجة التي تتم فيها غزو سرطان المثانة. الماغنيسيوم سرطان المثانة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر مختبر الدكتور هوارد كراوفورد (جامعة ميشيغان) للدعم التقني وتوفير المواد والمعدات اللازمة لهذه الدراسة، والن كيلر للدعم التقني.
تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة مركز السرطان ميشيغان روجل الأساسية منحة CA046592 26S3، K08 المعاهد الوطنية للصحة CA201335-01A1 (حزب العمال التقدمي)، يا BCAN (حزب العمال التقدمي)، CA17483601A1 R01 المعاهد الوطنية للصحة (DMS).
Materials
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. . The Society. , (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
