Summary
Här beskriver vi ett protokoll för multiplex fluorescerande immunhistokemisk färgning och tänkbar för samtidiga localizationen av flera cancer-associerade antigener i lymfom. Detta protokoll kan utvidgas till en colocalization analys av biomarkörer inom alla vävnadssnitt.
Abstract
Immunhistokemisk (IHC) metoder för in situ - analys av proteinuttryck av ljusmikroskop är ett kraftfullt verktyg för både forskning och diagnostiska ändamål. Men är den visualisering och kvantifiering av flera antigener i en enda vävnad avsnittet använda konventionella kromogen IHC utmanande. Multiplexade imaging är särskilt relevant i lymfom forskning och diagnostik, där markörer måste tolkas i samband med en komplex tumör mikromiljö. Här beskriver vi ett protokoll för multiplexering fluorescerande IHC färgning för att möjliggöra kvantitativa bedömningen av flera mål i specifika celltyper intresset för lymfom. Metoden omfattar aspekter av antikropp validering, antikropp optimering, multiplex optimering med markörer av lymfom subtyper, färgningen av vävnad microarray (TMA) diabilder, och skanning av bilderna, följt av analys, med särskild hänvisning till lymfom. Noter för båda genomsnittliga intensiteten av en markör av intresse och det procentuella positivitet skapas för att underlätta ytterligare kvantitativ analys och använder den här metoden. Multiplexing minimerar prov utnyttjande och tillhandahåller geografisk information för varje markör av intresse.
Introduction
Lymfoida tumörer orsakas av okontrollerad maligna spridningen av lymfocyter. Dessa celler är viktiga komponenter i immunsystemet och lokalisera till de primära och sekundära immun organ, såsom benmärg, lymfkörtlar, mjälte och andra slemhinnor-associerade lymfoida systemet. Lymfoida tumörer är en heterogen grupp av sjukdomar som klassificeras baserat på en konstellation av funktioner, inklusive morfologi, immunophenotype, genetiska särdrag och klinisk presentation. Varje parameter spelar en del, härstamning förblir en definierande funktion och utgör grunden för det WHO klassificeringssystem som erkänner tumörer härrör från B-celler, T-celler och naturliga killer (NK) celler1.
Nyckeln till klassificering av lymfom har varit karakterisering av antikroppar mot leukocyt yta markörer av olika undertyper av lymfocyter2. Immunhistokemi (IHC) har traditionellt använts för analys av sådana markörer och bygger på principen om antigen-antikroppsreaktion erkännande att upptäcka cell - och tissue-baserade molekyler som kan visualiseras genom mikroskopet ljus 3. identifiering av flera mål i en enda bild av konventionella ljusa fält kromogen multiplex IHC har dock begränsningar eftersom det är ofta svårt att skilja flera färg signaler på en enda vävnad avsnitt tillförlitligt — särskilt för antigen med en mycket låg uttryck4. Visuell bedömning och kvantifiering av färgning kan också vara subjektivt, orsakar variationer i analys och tolkning5.
Konventionella IHC på formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) prover är därför inte möjligt för samtidiga detektion av flera mål i immunologiskt olika sjukdomar som lymfom. Dessutom är skilja neoplastiska lymfocyter från omgivande immuncellerna ofta otydliga. Detta hindrar studier tittar på relevansen av nya biomarkörer i lymfom. I detta sammanhang multiplex fluorescerande IHC (mf-IHC) erbjuder ett lovande alternativ eftersom det tillåter den kvantitativa bedömningen av antigen coexpression och en rumslig relation med högre precision medan bevara begränsade prover6,7. När denna bildteknik är samarbetar med digital bild analys programvara, data tolkningen görs effektivare och underlättar studier av tumör och mikromiljö heterogenitet8,9. I detta protokoll, en tyramide-baserade immunofluorescens (om) multiplexing metod används för att förstärka signalen och är kompatibel med alla IHC-validerade antikroppar från någon värdarter, även de som utvecklats i samma arter5,7 , 10. tyramide-baserade protokollet möjliggör direkt konjugationen av fluorophore i vävnad av intresse så att de primära och sekundära antikroppen kan demonteras efter varje steg, vilket möjliggör sekventiell tillämpningen av flera fläckar utan antikropp korsreaktivitet.
En multiplexade strategi kommer att vara användbart för att förutsäga utfall prognos och behandling genom att identifiera mål och deras variant immunologiska mönster i lymfkörtelcancer. Multiplex fluorescerande IHC har tillämpats i vårt labb för studien av en panel av T- och B-lymfocyter markörer och T-follikulär helper markörer i angioimmunoblastic T-cells lymfom (AITL), en undertyp till en perifert T-cellslymfom kännetecknas av aggressiv klinisk beteende och tumör heterogenitet11. Nyttan av denna metod illustreras också i diffusa stora B-cellslymfom (DLBCL) där den ökad signalering av en B-cells receptor med samtidiga C-MYC och BCL-2 uttryck föreslår den potentiella terapeutiska användningen av Brutons tyrosin Kinas hämning 12 .
Beskriver här vi hela protokollet från antikropp validering till valet av lämplig kontroll vävnader och vävnader, med en eventuell analys av färgade bilder med hjälp av en skanning multiplexing använder lymfom FFPE och automatiserade kvantitativa patologi imaging systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla vävnader som används i detta protokoll erhölls under det Singapore NHG domän specifika Review Board B studera 2014/00693.
1. urval och validering av antikroppar
Obs: Innan med etableringen av någon multiplexade panel, se till att alla antikroppar fläcken kraftfullt, att identifiera endast målet antigen av intresse. Syftet är att välja antikroppar som specifikt känner igen antigenet sevärdheter i vävnadssnitt.
- För en antikropp med en väl etablerad forskning användning eller rutinmässig klinisk användning i IHC, bekräfta villkor såsom epitop hämtning och antikropp utspädning genom att utföra konventionell IHC5,13 på positiv och negativ kontroll vävnad sektioner. För vävnadssnitt av mänskligt ursprung, se till att lämpliga etik spelen på plats innan experiment.
Obs: Positiva kontroller är vävnader som förväntas express antigenet sevärdheter och negativa kontroller är de som inte gör. Godartade tonsill vävnad har valts som en bra vävnadskontroll lymfom antigener för eftersom den innehåller en blandning av immunceller inklusive B-celler, T-celler, och antigen-presenterande celler, samt stromal och epitelial celler. Den senare tjäna som användbar negativa interna kontroller. - För okända mål eller kommersiella antikroppar med otillräckliga publicerade data, utföra antikropp validering genom att skapa matchade positiv och negativ kontroll FFPE cell block14, använda CRISPR knock-out eller siRNA knock-down av antigenet sevärdheter i en lämplig cellinje genom standard molekylärbiologiska tekniker. Använd dessa FFPE cell block i stället för positiva och negativa kontrollen vävnader för konventionella IHC enligt steg 1,1.
Obs: HeLa eller 293T celler används ofta för antigener som inte celltyp specifika, som lymfom cellinjer är svåra att transfect. För antigener som är lymfocyter specifika, kan lymfom cellinjer användas med viral transduktion eller elektroporation som gen leveranssättet (om än med låg effekt).
2. planering sekvensen av antikroppar och Fluorophores för Multiplex-panelen
- Planera sekvensen av reagenser för den slutliga multiplex färgning. Exempelvis planerades här sekvensen för multiplex protokollet ursprungligen som först, Bcl-6; andra, Bcl-2; tredje, C-Myc; fjärde, CD20; femte, Ki67.
Obs: För att besluta om sekvensen, antikroppar med en svag affinitet som kräver högre koncentrationer bör färgas först i det slutliga multiplex färgning. Hög affinitet antikroppar som sannolikt är resistenta mot flera rundor av mikrovågsugn strippar tillämpas senast i multiplex protokollet att undvika ospecifik färgning. - Planera en fluorophore partner för varje antikropp på panelen. Se tabell 1 och Tabell av material för val som i det här exemplet.
Obs: För att besluta om den fluorophore partnern för varje antikropp, välja spektralt distinkta fluorophores för antikroppar med liknande mönster av lokalisering inom cellen och vävnad. Detta minimerar spektrala överlappning och svårigheter med minoriteter.
3. Monoplex Tyramide-baserade om i en simulerad 5-plex Multiplex Panel
Obs: I det här exemplet protokollet för CD20 diskuteras, som planeras som fjärde antikroppen i en multiplex sekvens som beskrivs ovan. Skiljer sig antalet ytterligare stripp steg för antikroppen position i sekvensen.
- Skär 3 µm-tunna sektioner av positiv och negativ kontroll vävnad med hjälp av en mikrotom och placera avsnitten på poly-L-lysin-belagda glas objektglas.
- Dewax avsnitten med en lämplig röjning lösning 3 x 4 min varje. Rehydrera objektglasen i 100% alkohol, 90% alkohol och 70% alkohol, 4 min varje. Lägg bilderna i destillerat vatten för 2-3 min.
- Placera glasen i en mikrovågsugn-safe glasburk i en standardantigenet hämtning buffert (kommersiellt tillgängligt) för att fördjupa bilderna. Utför värme-inducerad epitop hämtning (HIER) med en lämplig mikrovågsugn, i pH9 antigen retrieval lösning vid 98 ° C i 25 min.
Obs: Någon mikrovågsugn med ett tryck som sträcker sig från 800-1100 watt kan användas och HIER kan optimeras med detta. I detta fall användes en multifunktionell mikrovågsugn vävnadsprocessor (öppen till luft) för HIER och strippar. De inledande inställningarna för hämtning av en viss epitop är baserade på tidigare kunskap från konventionella IHC. - Utföra ytterligare rundor av mikrovågsugn strippar (tre i detta fall, för den fjärde antikroppen i en panel), varje omgång med 100% till 98 ° C och 20% makten för 10 min att upprätthålla vid samma temperatur. Kyla ner bilderna i destillerat vatten i minst 10 min.
Obs: Utföra flera rundor av mikrovågsugn strippar under monoplex om steget att exponera det mål antigenen som samma antal värme steg som i den föreslagna multiplex. Eftersom CD20 planeras som fjärde antikroppen, mikrovågsugn strippar 3 x före och en gång efter gör primär antikropp ruvning. - Kontrollera och fylla bufferten efter varje 5 min under ytterligare mikrovågsugn strippar. Viktigast av allt, låt inte diabilder torka ut under de flera strippa förfarandena. När du tar bilderna ur mikrovågsugnen, Använd pincett och värmetåliga handskar för att placera dem i en separat burk destillerat vatten. Vänta på antigen retrieval lösningen svalna naturligt.
- Blockera den vävnad peroxidasaktiviteten med hjälp av ett kommersiellt peroxidas block i 10 min (3% väteperoxid kan användas som ett alternativ reagens). Tvätta med Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) och en Nonjonaktivt rengöringsmedel för 5 min.
Obs: TBS består av 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 och 150 mM NaCl.TBS att göra TBS-D. - Block med antikropp spädningsvätska eller bovint serumalbumin för 15 min följt av inkubation med primära antikroppen av intresse (t.ex., CD20, 1:2,000 spädning i antikropp spädmedel, se Tabell för material) i rumstemperatur i 30 min. Tvätta 3 x med TBS-D buffert för 5 min varje gång. Det bör finnas tillräckligt TBS-D buffert att fördjupa bilden helt på alla tvätt steg.
Obs: Bovint serum albumin kan användas som en alternativ antikropp som spädningsvätska. Volymen av antikropp spädningsvätska beror på storleken av vävnad, alltifrån 50 µL (för biopsiprover) till 400 µL (för excision prover eller vävnad microarray prover). - Inkubera med en lämplig pepparrotsperoxidas (HRP)-märkta sekundär antikropp, väljs på grundval av ursprungsarter av primär antikropp under 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta 3 x med TBS-D buffert för 5 min varje gång.
- Applicera ett lämpligt tyramide-baserade fluorescerande reagens (1: 100 i förstärkning spädningsvätska) och odla i rumstemperatur i 5 min, för att tillåta fluorophore konjugation till vävnadsprov på platser av primär antikropp bindande. Tvätta 3 x med TBS-D buffert för 5 min varje gång.
- Utföra en ytterligare mikrovågsugn-baserade strippar för att ta bort den primära och sekundära antikroppen. Upprepa efter behov baserat på antikroppen position i sekvensen.
- Placera bilden i destillerat vatten för att kyla ner. Inkubera med DAPI (1: 100 utspädning i antikropp spädningsvätska) i 10 min, följt av tvätta 3 x med TBS-D buffert för 5 min varje gång. Torra området i bilden utan vävnaden med våtservetter och montera bilden med passande fästmaterial media.
- Bild i bilden (se avsnitt 6 och 7 i detta protokoll) och avgöra lämpligheten i färgningen (enligt definitionen av uppenbar diskriminering av positiv och negativ kontroll vävnad).
Obs: Om färgning mönstret är felaktiga, gör om den monoplex färgning efter justering en eller flera av följande parametrar: antalet värme hämtning stegen, mängden värme hämtning, inkubation period/koncentrationen av antikroppar (primära och sekundär) antikropp position i sekvensen, och valet av fluorophore. Den monoplex färgning steg normalt kräver flera rundor optimering för att erhålla en lämplig uppsättning parametrar för lämpliga färgning. Det är tillrådligt att testa en rad fluorophores med varje primär antikropp, eftersom detta kommer att ge flexibilitet för att avgöra den slutliga multiplex uppsättningen.
4. repetition av Monoplex för varje antikropp i protokollet Multiplex
- Upprepa den monoplex färgning för de andra antikropparna på ett liknande sätt genom att justera antalet mikrovågsugn strippar steg, baserat på antikroppen position i sekvensen. Till exempel, när du utför monoplex färgning för tredje antikroppen i en sex-plex multiplex panel, utföra två mikrovågsugn stripp steg före och tre mikrovågsugn stripp steg efter primär antikropp ruvning.
Obs: Det är viktigt att uppskatta att den mikrovågsugn-baserade strippar av antikroppar också visar provet till HIER. Om en specifik antikropp kräver en strategi för hämtning av olika epitop, måste detta beaktas vid planeringen av multiplex sekvensen. I det här exemplet kräver Ki67 epitop hämtning pH 9, för 30 min. Eftersom 25 min av HIER kommer att ske före KI67 färgning i sekventiella protokollet, endast en extra 5 min i HIER behövs.
5. multiplex färgning protokoll
Obs: Fortsätt med den multiplex färgning protokollet endast när alla komponenter har optimerats med monoplex om färgning. Granska resultaten av monoplex färgningen och designa en tabell som visar den slutliga layouten storleksordningen multiplex och valet av fluorophore för varje antikropp. Detaljerna för antikroppskoncentration, varaktigheten av färgning, och den sekvens och typ av hämtning av värme för varje antikropp som används här finns i tabell 1.
- Snitt 3 µm-tunna sektioner av positiv och negativ kontroll vävnad, samt som målvävnaden sevärdheter (här, FFPE prover av lymfom), använder en mikrotom, och placera avsnitten på poly-L-lysin-belagda glas objektglas (se Tabell för material).
Obs: Införande av de positiva och negativa kontrollerna för varje antikropp i panelen är tillrådligt, tillsammans med de riktiga proverna för multiplex. Detta möjliggör en bekräftelse att protokollet färgning utfördes korrekt. - Dewax, utföra värme-inducerad epitop hämtning (HIER) och blockera vävnad peroxidasaktiviteten liksom monoplex protokollstegen 3,3-3,5.
- Inkubera med den första primär antikroppen av optimerad multiplex sekvensen, som tidigare fastställs med hjälp av det monoplex om steget. I det här exemplet BCL-6, en 1:30 spädning i antikropp spädningsvätska i rumstemperatur i 60 min (se Tabell för material), var det första steget av protokollet multiplex. Tvätta med TBS-D buffert för 5 min.
- Inkubera med en lämplig HRP-märkt sekundär antikropp baserat på arterna av primär antikropp används i föregående steg (se Tabell för material) i rumstemperatur i 10 min. Tvätta med TBS-D buffert för 5 min.
- Tillämpa optimerad tyramide-baserade fluorescerande reagens (Cy5 i detta exempel 1: 100 i förstärkning spädmedel, se Tabell för material) med inkubation vid rumstemperatur i 5 min. Efter inkubering, tvätta med TBS-D buffert för 5 min.
Obs: Valet av tyramide-baserade fluorescerande reagens är baserad på den optimerade monoplex om. - Kontrollera effektiviteten i färgning av den första antikroppen använder ett lämpligt Mikroskop (se Tabell för material).
Obs: Interim imaging kontroller kan göras med lätthet om provet är en TMA eller enstaka bild. Om, emellertid fläcken utförs på flera bilder, detta kan vara opraktiskt och detta steg kan utelämnas. - Utföra mikrovågsugn strippar för andra antikroppen i protokollet, med villkor optimerad i monoplex steg. Fortsätt sedan med färgningen av andra primära antikropp (här, BCL2) med HRP-märkt sekundära antikroppar och tyramide-baserade fluorescerande reagens (här, 520, se Tabell för material). Kontrollera effektiviteten i färgning i fluorescerande Mikroskop efter slutförandet av den andra omgången av färgning.
- Likaså, upprepa proceduren med tredje, fjärde och femte antikroppar i sekvensen (här, c-Myc, CD20 och ki67, respektive, med fluorophores 570, 540 och 620, respektive). Utföra bildbehandling kontroller mellan varje steg om möjligt.
- Lägga till en nukleär motfärg (DAPI, 1: 100 utspädning i antikropp spädningsvätska) i 10 min och tvätta sedan, 2 x i TBS-D 5 minuter varje.
- Montera bilder med hjälp av ett passande fästmaterial reagens.
6. beredning av spektrala bibliotek diabilder
Anm.: Avsnitt 6-8 i detta protokoll är unika för multiplexade experiment som är avbildad med en spektral kamera.
- Skapa biblioteket bilder (singel-fläcken referensbilder) för varje fluorophore, DAPI och autofluorescens på samma kontroll vävnad, som ska användas för Multispektrala bildanalys.
- Skär 2 x 3 µm-tunna sektioner av vävnadstyp av intresse (här, ett lymfom prov eller en tonsill som kontroll) med en mikrotom och placera avsnitten på poly-L-lysin-belagda glas objektglas.
- Processen både glider använda protokollet monoplex (med alla strippar och tvätt steg), men utan antikropp eller fluorophore tillägg.
- Fläcken en bild med DAPI enligt steg 5,9 och lämna en bild ofärgade (för generering av vävnad autofluorescens spektrumet).
Obs: Optimerad monoplex bilder (med ett enda fluorescens färgämne, utan DAPI) kan användas som spektrala bibliotek diabilder för att generera spektra av varje fluorescens färgämne.
- Skanna dessa uppsättning bilder med hjälp av lämpliga filter och överföra dem till bild Analysbiblioteket.
7. spectral Imaging
-
Skanna monoplex diapositiv
- Välj filter från tillgängliga standard påljusfluorescens filter (DAPI, FITC, CY3, Texas Red och CY5) lämplig för sysselsatta fluorophore.
Obs: Rekommenderade filter kuber för specifika fluorophores används i det här exemplet visas i tabell 215. - Undersöka varje markör i dess motsvarande fluorescens kanal att identifiera en lämplig exponeringstid att erhålla en ren signal. Fokusera på komponenten vävnad som är tänkt för att ha den starkaste signalen för markören.
- Bestämma en fast exponeringstid för varje analyt (antikropp-fluorophore kombination), att tillåta cross-prov jämförelse av pixel intensitet (även om vissa kommersiella plattformar har normalisering strategier att ta hänsyn till skillnader i exponering).
- För att besluta om en fast exponeringstid för en viss kanal, Använd en live kamera inställning för att justera exponeringstiden tills det finns inga överexponerade områden i kamerabilden live, och upprepa detta för alla kanaler.
- Efter skanning monoplex bilderna, generera simulerade brightfield bilder (om funktionen är tillgänglig i den programvara som används) att visuellt jämföra med normala IHC mönster och avgöra om färgning mönstret är korrekt (figur 1 och figur 2 ).
- Välj filter från tillgängliga standard påljusfluorescens filter (DAPI, FITC, CY3, Texas Red och CY5) lämplig för sysselsatta fluorophore.
-
Scanning multiplex prover (TMA diabilder / flera prover)
- Ställa de optiska parametrarna som beskrivs för skanning av monoplex bilder (steg 6.1). Börja med att justera fokus manuellt eller automatiskt (följ instruktionerna av den specifika bilden skanning maskinen). För det andra, justera exponeringstiden för varje fluorescerande kanal för att säkerställa att alla kärnor på en TMA eller alla områden i en bild, är korrekt exponerade.
Obs: Området valt att justera exponeringstiden är viktigt. Förbrukaren behov till välja den starkaste signal regionen för varje filter (dvsKi67 signalen är starkare i tonsill germinal center regionen än i regionen nongerminal center, därav, användare bör använda regionen germinal center ligger vid en lämplig exponering tid). Användare kan även anta en oversaturation korrigeringsfunktionen av bildgivande systemet om tillgängligt. - Skanna TMA diabilder under TMA skanningsläge om tillgängliga i imaging-systemet, med en lämplig autofokus algoritm.
- För hela-vävnaden avsnitt diabilder, få bilderna granskas av en kvalificerad patolog att välja optimala bilder från de mest representativa tumör-områdena.
Obs: Det protokoll som beskrivs här baseras på en definierad Mikroskopbilden / analyssystem (se Tabell för material). Det finns andra maskiner och bild analys programvara som kan skanna och analysera multiplex IHC bilder7.
- Ställa de optiska parametrarna som beskrivs för skanning av monoplex bilder (steg 6.1). Börja med att justera fokus manuellt eller automatiskt (följ instruktionerna av den specifika bilden skanning maskinen). För det andra, justera exponeringstiden för varje fluorescerande kanal för att säkerställa att alla kärnor på en TMA eller alla områden i en bild, är korrekt exponerade.
8. dataanalys
-
Preanalysis utvärdering och planering
- Använd referens bilden för autofluorescens att subtrahera autofluorescens från bilderna skannas för analys.
- Granska bilderna innan analys för att säkerställa att de är i fokus och utan färgning artefakter.
- Använda en tumör-markör (t.ex., CD20 i det här exemplet) för att identifiera celler av intresse och för att fortsätta med cell segmentering, scoring och batch analys metoder. Välj CD20-positiva celler för analys.
Obs: till exempel i DLBCL prover analyseras här, inställningen och parametrar som är definierade för cell segmentering är baserad på kärnkraft storlek och intensitet men är specifika för bild analys programvara som används (t.ex., en DAPI menar pixel intensitet på minst 0,05; storlek mellan 80-320 pixlar, med en uppdelning känslighet vid 2 [Detta är en programvara-specifik parameter som är starkt beroende av tumören morfologi: för små tumörceller, uppdelning av 0,7 - 1 är lämpliga; för stora tumörceller, uppdelning kan justeras upp till 4]). - Begäran om kvalificerad patolog att granska enskilda bilder och besluta om vävnad segmentering krävs att välja tumör cell berikad och Uteslut regioner med nekros arearegion orand riklig reaktiva celler. Om det krävs ytterligare vävnad segmentering, sedan välja lämplig kontroll områden (t ex tumör celler/stroma/nekros) och kontrollera att analys bildbehandlingsprogram korrekt kan identifiera sådana regioner
- Fortsätt med cell segmentering efter vävnad segmentering (om någon), begäran en kvalificerad patolog att granska cell segmentering karta för att säkerställa trohet i avsedda segmenteringen närmar5.
- Fastställa den mest biologiskt/kliniskt lämplig analysmetod för en viss biomarkör av intresse (t.ex.procentandel positivitet eller genomsnittlig stödnivå per cell).
- Välj ett cut-off värde för varje markör (för procentandel positivitet).
- Fastställa optiska intensitet positiva cut-off värdet för varje markör i samband med en patolog. Generera histogram genom att analysera frekvens distribution av markör intensitet/cellen i lämpliga statistik-program (se Tabell för material).
Obs: En intensitet värde histogrammet kan erbjuda en översikt över fördelningen av stödnivåerna som signal. - Bestämma en ungefärlig cut-off från histogrammet och kontrollera detta med en patolog översyn, korrelera med manuellt beslutsamma cut-off på markerade bilder. I vissa situationer kan en enhetlig enda cut-off blir inte möjligt på grund av variationer i färgning och en manuell cut-off värde för varje prov kommer att krävas.
Anm.: Avsnitt 8.1 bör göras i bild analys programvara (se Tabell för material) om inte annat anges.
-
Märkning positiva och negativa celler
- För varje markör av intresse, enligt cut-off antalet bestäms (genom histogram eller manuellt), Använd en ”om” eller liknande logik formel att markera positiva och negativa celler med märkt värde: nummer 1 för positiva celler, nummer 0 för negativa celler.
- För positivitet av alla markörer, multiplicera det Markera värdet av varje markör (antingen 1 eller 0) med produkter i separata kolumner. Om produkten är lika med 1, innebär det att cellen är positivt för alla markörer. För positivitet och negativitet av en specifik markör, använda en om logik algoritm.
Anm.: Avsnitt 8.2 behöver göras i statistik-program (se Tabell för material).
-
Generera procentsats och numeriska data med hjälp av en pivottabell
- Generera procentandel data för specifika markörer av intresse, inom definierade celler (t.ex., CD20-positiva celler eller CD20-negativa celler) (figur 6).
- Infoga en pivottabell i databladet.
- För att beräkna positivitet procentandelen av en enda markör, såsom CD20, Välj funktionen Summa under den värde del av pivottabellen att räkna det totala antalet CD20-positiva celler med hjälp av summan av CD20+ celler dividerat med det antalet totala celler. Resultatet är CD20+ cell procenttalet inom en kärna eller en studienummer (beror på val av raden pivot tabell).
- Beräkna positivitet procentandelen av flera markörer med samma metod (figur 3),.
- Generera numeriska data. Extrahera det median normaliserade antalet för varje markör för varje borrkärna eller varje studienummer genom att erhålla medelvärdet intensiteten i varje markör sevärdheter i alla celler studerade inom ett prov (figur 4).
Obs: Medianvärdet kan inte härledas i pivottabellen direkt. Det kan härledas genom att använda denna formel: MEDIAN (IF (kolumn av studienummer = specifik studienummer, kolumn i normaliserat värde)).
-
Plotta data i en lämplig Graf
- Rita resultaten av den procentandel positivitet eller median intensitet per markör i en celltyp av intresse på ett lämpligt sätt för ytterligare statistiska tester och presentation.
- Skapa dot tomter att tillhandahålla en visualisering av siffror och distribution.
Obs: Som representerar data med stapeldiagram inte förmedla information om distribution. Uppskattning tomter också rekommenderas som en bra metod för datarepresentation, med betoning på omfattningen av skillnaden mellan prover16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: B-cell multiplexed immunofluorescens panelen bilder för en diffus stora B-cells lymfom (DLBCL) prov med C-MYC och CL2 gen ombildning (dubbel-hit lymfom). Magenta = CD20 (membran); vit = BCL2 (cytoplasman); gul = Ki67 (kärnkraft); grön = C-MYC (kärnkraft); röd = BCL6 (kärnkraft), blå = DAPI (nukleära kontrollfärg). CD20-positiva tumörcellerna visar ett högt uttryck för C-MYC (80%) och BCL2 (> 90%), och Ki67 spridning index är också hög (90%). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: simulerad ljusa fält immunhistokemisk bilder (genereras från figur 1) av samma DLBCL prov med C-MYC och BCL2 gen ombildning (dubbel-hit lymfom). CD20 visar membran färgning i tumörcellerna. BCL2 visar cytoplasman färgning i > 90% av tumörcellerna. C-MYC positivitet är ca 80%. BCL6 visar nukleär färgning hos cirka 20% av cellerna. Ki67 är positivt i 90% av cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Pivot-tabell som visar hur man generera procentandel data enligt studienummer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Diagram 4: medianvärde formel för det normaliserade Ki67 OD-värdet enligt studienummer. Programsatsen IF finner alla studie nummer som motsvarar en specifik studienummer (vilket är 52 i denna siffra). Sedan returnerar motsvarande Ki67 normaliserade värdet. CTRL + SKIFT + RETUR tangentkombinationer kan användas för att beräkna medianvärdet (Ki67 medianen) för dessa returnerade värden, vilket är 11,56 för studienummer 52. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Multiplexed immunofluorescens panelen bilder för en angioimmunoblastic T-cells lymfom (AITL) prov. (A) den sammansatta bilden visar en AITL provet cellulär heterogenitet. Magenta = CD20 (membran); gul = CD4 (membran); grön = PD1 (membran); röd = BCL6 (kärnkraft); Cyan = CD8 (membran); blå = DAPI (nukleära kontrollfärg). (B) den övre raden av bilder visar en förstorad bild av den region som har valts i den vita rutan i sidopanelen A. Den nedre raden av bilder visar motsvarande segmenterad cell masker: gul/röd/grön visar enda CD4/BCL6/PD1-positiva celler, respektive. Blå representerar negativa celler och vit anger dubbel-positiva celler. Bilderna visar att 50% av CD4+ celler är PD1+ (vänster, vit), medan 20% av CD4+ celler är också positivt för BCL6 (mellersta, vit). Dubbelrum positivitet är för PD1 och BCL6 ca 10% (höger, vit). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Multiplexed immunofluorescens optimering bilder för tonsill kontroll vävnad. (A) den sammansatta bilden visar området germinal center av tonsill kontrollprov. Gul = C-Myc (kärnkraft); röd = BCL6 (kärnkraft); Cyan = BCL2 (cytoplasman); Magenta = CD20 (membran); grön = Ki67 (kärnkraft); blå = DAPI (nukleära kontrollfärg). C-Myc är positiva endast i ett fåtal celler. BCL6 och Ki67 är positivt främst inom germinal center, medan BCL2 är positivt främst utanför germinal center. CD20 är diffust positivt inuti och utanför germinal center. (B), tabellen visar att germinal center CD20-positiva celler också positivt för BCL6 och Ki67 men negativa för BCL2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sekvens av antikropp färgning | Primär antikropp (se tabell material) | Totala HIER krävs | Faktiska pre fläcken HIER | Sekundära antikroppar | Fluorophore | Post-TSA antikropp strippar |
| 1 | Musen anti-Bcl6 (1:30, 60min RT) | 25minutes, Ph9 | 25minutes, Ph9 | HRP-konjugerad antimus, 1: 1000 ' för 10' | OPAL Cy5 på 1: 100 | 1 runda 100% effekt 1 min, 20% effekt i 10min |
| 2 | Musen anti-Bcl2(1:50,60 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerad antimus, 1: 1000 ' för 10' | OPAL 520 på 1: 100 | 1 runda 100% effekt 1 min, 20% effekt i 10min |
| 3 | Kanin anti-c-MYC(1:50,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerad anti-kanin, 1: 1000 ' för 10' | OPAL 570 på 1: 100 | 1 runda 100% effekt 1 min, 20% effekt i 10min |
| 4 | Musen anti-CD20(1:2000,30 min RT) | 25minutes, Ph9 | Ingen | HRP-konjugerad antimus, 1: 1000 ' för 10' | OPAL 540 på 1: 100 | 1 runda 100% effekt 1 min, 20% effekt i 10min |
| 5 | Musen anti-Ki-67(1:50,45 min RT) | 30minuter, Ph9 | 5 minuter pH9 | HRP-konjugerad antimus, 1: 1000 ' för 10' | OPAL 620 på 1: 100 | 1 runda 100% effekt 1 min, 20% effekt i 10min |
Tabell 1: exempel på en färdig layout för multiplex om färgning. Denna tabell innehåller ett exempel på hur du anger mängden HIER och mikrovågsugn-baserade strippar göras vid varje steg, när monoplex fläckar har optimerats.
Tabell 2: Guide mot filter markeringen för fluorophores. Denna tabell ger en grov guide mot lämpliga filter som kan användas på angiven utrustning, för att visualisera fluorophores av intresse. Det är rekommenderat att kontrollera filtret specifikationerna av mikroskopet som används i samband med utsläpp/magnetisering profilen för den fluorophores som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MF-IHC har potential att aktivera patologer att förfina diagnosticcriteria i lymfoida patologi och analysera rollen av biomarkörer i specifika celltyper mot en förutsägelse av kliniskt resultat. Som en ny forskningsmetod används alltmer mf-IHC kvantitativa och rumsliga identifiering av flera immun parametrar av tumör celler17. Påvisande av mf-IHC av samtidig uttryck för tumör biomarkörer har visat sig vara reproducerbara och pålitlig5. Tekniken är dock fortfarande begynnande och utsätts för variation uppkommer reagens - och/eller vävnad-relaterade faktorer, såsom de på grund av inkonsekvens i vävnad fixering och bearbetning.
Kritiska till tekniken är användningen av väl validerade antikroppar som är specifika, känslig och ger reproducerbara resultat. Det finns exempel i litteraturen av antikroppar beskrev ursprungligen för att vara specifik för deras antigener och senare visat för att erkänna orelaterade proteiner med hjälp av knock-out modeller14. Den knock-out / knock-down valideringsmetod i vilken vild-typen eller celler med överuttryckt antigener tjäna som positiva kontroller medan celler med målen utslagen eller pressade ned siRNA eller CRISPR metoder används som negativa kontroller.
Precis som de konventionella IHC har mf-IHC många kritiska variabler som behöver optimeras för varje experiment, för optimal färgning och resultat. Dessa inkluderar pH i antigen retrieval lösningen, antikropp utspädning, tilldelning av en fluorophore till varje markör, och koncentrationen av fluorophore. De vanliga antigen retrieval lösningarna är pH 6 och 9. Det är värt att testa vilka pH ger optimal färgning mönster och intensitet med mindre bakgrund.
Det finns inga särskilda riktlinjer besluta om sekvensen av antikropp ansökan i multiplex experimentet det beror inte bara på affinitet av antikroppen, men också på styrkan i opal fluorophores. I allmänhet antikroppar med en svag affinitet ofta kräver högre koncentrationer baserad på monoplex färgningen och tillämpas först i sekvensen multiplex. Stark affinitet antikroppar som kommer vara resistenta mot strippar tillämpas senast, för att undvika ospecifik färgning. När det gäller valet av en specifik fluorophore är det bättre att undvika att använda fluorophores med liknande spektrala våglängder för antigener som colocalize i de samma cellulära fack. Antigener med låg uttrycksnivåerna tilldelas med den ljusaste fluorophores och vice versa. Om signal intensiteten i studien urvalet, svag, kan justera opal TSA utspädningen göras för att uppnå den önskade signal18. I vissa fall kan försöker olika antigen retrieval metoder eller öka den primära antikroppskoncentrationen fungera. Den första spädningen av primär antikropp kan vara detsamma som fastställts i en konventionell IHC-experiment. Men om om signalen är inte klart, kommer testning av andra antikropp spädningar att krävas, som de villkor som optimerats för IHC inte översätter alltid till om. Signalintensitet påverkas av ordern eller sekvens av immunfärgning. Vissa epitoper är överexponerade efter två eller tre omgångar av MWT, medan vissa kan försämras på grund av överskott MWT. Vissa fluorophores kan också påverkas av MWT och måste testas för dämpning.
Detta protokoll fokuserar på colocalization och mätning av intensiteten av markörer inom grupper av celler i en maligna B-cellslymfom. De viktigaste utmaningarna i utvecklingen av det nuvarande protokollet omfatta genereringen av en optimerad multiplex panel för antigener som colocalize i de samma cellulära fack. Det måste finnas en korrekt minoriteter av fluorophores för exakt kvantifiering. När panelen multiplex är på plats, är avbildning av färgade glasen relativt okomplicerad. Nästa hinder innebär analys av den avbildade data. Till skillnad från i immun infiltration studier, där kvantitering av specifika immunceller typer inom en epitelial tumör är okomplicerad, är colocalization studier vid lymfom starkt beroende av definitionen av positivitet av en utbildad patolog för varje markör för intresse. Som följer på en lämpliga diagnostiska cut-off som kan tillämpas på rutinmässig klinisk praxis är fortfarande ett pågående arbete. Ytterligare förbättringar i metoder för datanormalisering och automatiserade cut-off triangulering kommer att krävas innan denna teknik kan integreras i rutinmässiga diagnostiken.
Trots nuvarande begränsningar gör de potentiella tillämpningarna av mf-IHC och den kunskap som kan härledas från studien av tumörceller och deras rumsliga relation med närmiljön det ett attraktivt verktyg, särskilt för utmanande histologiska cancerformer såsom lymfatisk malignitet. Ytterligare arbete krävs att upprätta protokoll i vävnad fixering och vävnad behandling som är optimal för den föreslagna arbetsflöden, liksom en förbättring i färgningsteknik, som möjliggör samtidig analys av ett ökat antal mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.D.J. har fått finansiering från PerkinElmer mot resor till användargruppen möten. Författarna har någon annan intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
S.-B.N. och A.D.J. stöds av Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskning rådet övergången Awards (NMRC/TA/0020/2013 och NMRC-TA-0052/2016). Författarna erkänner Yong Siew Yoon forskningsbidrag till A.D.J. från National University Cancer Institute of Singapore mot inköp av Vectra spectral imaging Mikroskop. Studien är godkänd av Singapore NHG domän specifika översyn styrelsens B (2014/00693).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , Saunders. (2010).
- Kim, S. -W., Roh, J., Park, C. -S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. Jones, D. , Humana Press. 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, É Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , Humana Press. (2011).
- Bordeaux, J., et al.
- PerkinElmer. Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , PerkinElmer, Inc. (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , PerkinElmer, Inc. (2017).
