Summary
Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.
Abstract
Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes répartis dans le corps, où les réponses immunitaires innées peuvent se connecter à l'immunité adaptative. En fait, les LN sont stratégiquement interposés dans le chemin des vaisseaux lymphatiques, permettant le contact intime des antigènes de tissu avec toutes les cellules immunitaires résidentes dans le LN. Ainsi, la compréhension de la composition cellulaire, de la distribution, de l'emplacement et de l'interaction à l'aide de l'imagerie LN complète ex vivo permettra d'ajouter à la connaissance sur la façon dont le corps coordonne les réponses immunitaires locales et systémiques. Ce protocole montre une stratégie d'imagerie ex vivo à la suite d'une administration in vivo d'anticorps fluorescents qui permet une méthodologie très reproductible et facile à réaliser en utilisant des microscopes confocals conventionnels et des réactifs. Grâce à l'injection sous-cutanée d'anticorps, il est possible d'étiqueter différentes populations cellulaires dans le drainage des LN sans affecter les structures tissulaires qui peuvent être potentiellement endommagées par une technique conventionnelle de microscopie d'immunofluorescence.
Introduction
Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes en forme d'ovoïde largement présents dans tout le corps avec la fonction cruciale de combler les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les LN filtrent la lymphe afin d'identifier les particules étrangères et les cellules cancéreuses pour monter une réponse immunitaire contre eux1. Les cellules de présentation d'antigènes (APC), les lymphocytes T et les cellules B travaillent aux côtés pour générer des anticorps spécifiques à l'antigène (immunité humoristique) et des lymphocytes cytotoxiques (immunité cellulaire) pour éliminer les particules étrangères et les cellules cancéreuses2. Ainsi, la compréhension de la dynamique des cellules immunitaires présentes dans le système lymphatique aura des implications importantes pour le développement du vaccin et l'immunothérapie contre le cancer.
L'avènement de microscopes puissants - y compris de nouveaux microscopes confocal et super résolution - a permis un progrès extraordinaire dans la compréhension de la façon dont les différentes populations de cellules immunitaires se comportent dans leur environnement indigène3. Il est maintenant possible d'imager plusieurs sous-types cellulaires simultanés à l'aide d'une combinaison de sondes avec des souris génétiquement modifiées qui expriment des protéines fluorescentes sous contrôle de cibles spécifiques4,5. En fait, les techniques de haute dimension, y compris la cytométrie de masse et l'analyse multi-paramétrique de flux ont été cruciales pour élargir nos connaissances sur la compartimentation et la fonctionnalité de cellules immunitaires différentes dans la santé et la maladie6, 7. Cependant, pour préparer des échantillons pour ces techniques, les tissus ont besoin de digestion et les cellules sont séparées de leur milieu naturel pour être analysées dans des suspensions cellulaires. Pour dépasser ces limitations et permettre une meilleure traduction en biologie, l'objectif du protocole proposé ici est d'appliquer une méthodologie simple pour l'image ex vivo ganglions lymphatiques entiers en utilisant des microscopes confocal stock avec l'avantage d'une vitesse améliorée, tissu la préservation de la structure et la viabilité cellulaire par rapport à la coloration immunofluorescence conventionnelle. En utilisant cette approche, nous avons pu montrer que les souris déficientes pour les lymphocytes T, un sous-type de lymphocyte T impliqué dans la défense précoce de l'hôte contre les agents pathogènes4, ont compromis les follicules et les zones de cellules T par rapport aux souris de type sauvage. Ces résultats nous ont permis de poursuivre une étude dans laquelle nous avons démontré que les lymphocytes T jouent un rôle critique dans l'homéostasie des organes lymphoïdes et la réponse immunitaire humoristique4. En outre, ce protocole fournit une voie physiologique pour que les sondes et les anticorps atteignent le ganglion lymphatique, car ils sont administrés sous-cutanée et se dissipent par la circulation lymphatique de tissu, s'appuyant sur les rapports précédents qui ont employé l'étiquetage in situ avec des anticorps pour visualiser les structures lymphatiques-associées8,9, dynamique germinale centre10,11,12, et les cibles facilement accessibles à la circulation sanguine13 ,14,15.
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Protocol
Le protocole a été approuvé par le Comité permanent des animaux de la Harvard Medical School et du Brigham and Women's Hospital, protocole 2016N000230.
1. Souris utilisées pour l'expérience
- Utilisez des souris mâles et femelles de 8 semaines sur le fond B6 pour administrer le mélange d'anticorps.
- Utilisez des souris CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT pour déterminer si l'imagerie LN entière ex vivo peut également être appliquée à des souris reporters sans administrer de mélange d'anticorps ainsi que pour étudier la présence de cellules mononucléaires, y compris la présentation d'antigènes cellules et phagocytes, et leur distribution dans le LN.
REMARQUE : Les sourisjournaliste CX3CR1GFP/WTCCR2 ont des protéines fluorescentes vertes (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (DP) insérées sous le contrôle des promoteurs CX3CR1 et CCR2, respectivement. Les souris reporter peuvent être utilisées avec ou sans l'injection du mélange d'anticorps. S'il vous plaît voir la référence4 pour l'injection de mélange d'anticorps dans une souris journaliste. Passez à la chirurgie si aucun anticorps ne sera injecté.
2. Préparation et injection de mélange d'anticorps
REMARQUE : Effectuez ces étapes sur des souris décrites à l'étape 1.1.
- Diluer 1:10 de violette brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 de bleu brillant (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) et 1:20 de phycoérythrine (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) en PBS avec le volume final approprié à injecter dans la cuisse intérieure (à l'image inguinal) ou dans la patte pad (à l'image popliteal) lymphe.
REMARQUE: Utiliser comme isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, contrôle de l'isotype (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, contrôle isotype (R35-95; 0,2 mg/mL). Si vous modifiez l'anticorps de coloration, utilisez un isotype correct. - Pour l'image inguinal LN, injecter 100 L du mélange d'anticorps sous-cutané dans la cuisse intérieure (Figure 1A). Alternativement, injectez 50 L sous-cutané de mélange d'anticorps dans le tampon de patte pour image popliteal LN (Figure 2A). Utilisez des seringues délicates d'insuline de 1 ml (insuline U-100) avec l'aiguille de taille 0,30 mm et 13 mm (30 jauge et 1/2 pouce).
REMARQUE : Assurez-vous que l'injection pour la coloration inguinale de LN est sous-cutanée et non intramusculaire (i.m.), car le mélange d'anticorps ne sera pas correctement drainé si i.m. administration est exécutée. - Ne pas anesthésier les animaux avant l'injection de mélange d'anticorps.
- Attendez un minimum de 3 h (inguinal dLN) et 12 h (popliteal dLN) après injection pour enlever les organes.
- Si l'étiquetage des cellules LN n'est pas complètement observé à l'aide de grands colorants fluorescents polymères tels que le violet brillant ou le bleu brillant, utilisez de plus petits fluorophores, y compris l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), PE et allophycocyanin (APC) comme alternative.
3. Procédure chirurgicale pour enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal
- Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.
- Immobiliser les souris sur le stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige sur la peau abdominale pour empêcher le dépôt de fourrure autour de l'incision (Figure 1B). L'enlèvement de la fourrure n'est pas nécessaire.
- Effectuer une incision de la ligne médiane à l'aide de ciseaux courbés par microchirurgie (11,5 cm) et de forceps courbés microchirurgie (12,5 cm) dans l'abdomen, du pubis au processus de xiphoïde (figure 1C).
- Dissocier la musculature abdominale de la peau (Figure 1D).
- Faire des incisions horizontales de la peau en haut et en bas de la ligne d'incision verticale pour créer des rabats de la peau sur le côté de l'intérêt (selon le côté de l'injection de mélange d'anticorps) et battre la peau pour visualiser le ganglion lymphatique (Figure 1E).
- Tapez le rabat cutané sur la plaque acrylique (Figure 1F).
- Enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (figure 1F). Le ganglion lymphatique apparaîtra comme une sphère translucide, habituellement bilobulaire, sous la peau.
4. Procédure de chirurgie pour enlever le ganglion lymphatique drainant popliteal
- Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.
- Immobiliser les souris en position couchée sur un stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige dans le mollet et le genou (Figure 2A-D).
- Effectuer une incision de la ligne médiane dans le mollet du talon au genou (Figure 2E,F).
- Dissocier la musculature du veau de la peau (Figure 2F,G).
- Exposer la fossa popliteal (Figure 2G). Le ganglion lymphatique popliteal apparaîtra comme une sphère translucide dans la fossa popliteal.
- Enlever le ganglion lymphatique popliteal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (Figure 2G).
- Alternativement, retournez la souris sur la position de supine, et approchez la fossa popliteal entre le femoris de biceps et le semitendinosus pour l'enlèvement popliteal de LN en effectuant une incision de midline dans le veau du talon au genou suivie de la dissociation du veau musculature de la peau.
REMARQUE: Popliteal fossa est une dépression superficielle située à l'arrière de l'articulation du genou. Ouvrez soigneusement pour voir le ganglion lymphatique popliteal.
5. Préparation des ganglions lymphatiques
- Placer l'organe entier dans un plat de culture avec fond de verre (35 mm x 10 mm) et enlever la graisse qui entoure l'organe à l'aide de forceps incurvés microchirurgie (Figure1G-I et Figure 2H).
- Centraliser l'orgue au milieu du plat (figure1J et figure 2H).
- Couvrir l'organe d'un fragment d'essuie-glaces délicats et le garder imbibé de température ambiante saline de 0,9 % ou de phosphate buffer Solution (figure1K-M et figure 2H).
REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de laver les ganglions lymphatiques après l'ablation ou d'effectuer l'extraction des ganglions lymphatiques dans le capot.
6. Microscopie confocale ex-vivo (imagerie)
- Placez le plat Petri dans la fente de microscope confocaline inversée (figure1N et figure 2H).
- Image LNs sous un microscope confocal (Figure1O et Figure 2H).
- Tout d'abord, obtenir la mise au point correcte en utilisant la lumière conventionnelle du microscope confocal avec objectif 4x ou 10x. Ensuite, passer de la fonction de lumière au mode laser.
REMARQUE : Si le microscope confocal ne contient pas d'objectif 4x, la mise au point peut être parfaitement obtenue en utilisant l'objectif 10x. - Ajuster la puissance laser, compenser et gagner à l'aide d'un échantillon isotype, non taché ou non fluorescent (tableau 1) pour éliminer l'autofluorescence et la coloration non spécifique des anticorps fluorescents tels que ceux utilisés dans les images montrées dans ce manuscrit (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 et PE anti-F4/80).
- Ajustez les positions Z et XY, en utilisant respectivement le micrométrique et le char sur la zone d'intérêt dans le ganglion lymphatique.
- Acquérir des images dans le cadre d'objectifs 4x, 10x et 20x axés sur la structure LN et la distribution cellulaire. Utilisez la définition 1024 x 1024 pixels.
REMARQUE : Acquérez un minimum de cinq images dans différents champs par objectif et par animal. - Analysez les images à l'aide d'un logiciel d'image pour séparer les canaux, ajouter de l'échelle et des couleurs d'intérêt, et reconstruire la vue 3D.
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Representative Results
Ce manuscrit présente des techniques pour enlever les ganglions lymphatiques inguinaux et popliteal sans endommager leur structure à la suite de l'injection d'anticorps fluorescents pour tacher des populations cellulaires spécifiques dans ces organes (figure1 et figure 2 ).
La combinaison puissante de l'immunolabeling des cellules de LN avec BV421 anti-CD4 et BB515 anti-CD19 et l'analyse de formation image confocale a défini la localisation des cellules T (CD4MD) et des cellules DeB (CD19MD) dans les LN inguinal et popliteal. Dans les deux organes, les follicules cellulaires B étaient entourés de populations de lymphocytes T (Figure 3, Figure 4 et vidéo 1), une caractéristique de la structure LN1. Pour exclure la possibilité que les phagocytes qui tapissent les sinus lymphatiques puissent capturer les anticorps fluorescents injectés et entraîner un étiquetage non spécifique des marqueurs cellulaires, PE anti-F4/80 a été inclus dans le mélange d'anticorps. Comme le montre la figure 5, les phagocytes n'ont pas intériorisé les anticorps injectés, ce qui indique que la coloration des cellules B et T était spécifique. De plus,la vidéo 1 montre que la coloration des cellules T et B ne s'est pas chevauchiste, ce qui confirme la spécificité de la coloration.
Pour étudier la localisation spatiale des cellules mononucléaires phagocytiques dans le LN, des LN inguinal et popliteal de CX3CR1GFP/MD CCR2RFP/MD ont été photographiés. Des cellules mononucléaires ont été trouvées dans tout le LN inguinal, y compris le sinus subcapsulaire. La majorité de ces cellules étaient CX3CR1GFP/MD, suivies de laDP CCR2/ et des cellules double ment positives (jaune) (figure 6A-F). Le même modèle de distribution cellulaire et de phénotypes cellulaires a été observé dans le LN popliteal (figure7A-I). Les LN inguinalet et popliteal ont montré des régions noires sans CX3CR1GFP/MD CCR2RFP/MD, qui sont occupés par des lymphocytes. De plus, les cellules CX3CR1MD et CCR2MD étaient rares dans la zone intérieure des LN et concentrées dans la zone externe, ce qui indique que ces cellules occupent principalement le sinus sous-capsulaire LN (figure6G-I et figure 7J-L). Ainsi, le protocole proposé peut définir clairement les principales populations cellulaires présentes dans les ganglions lymphatiques.
Figure 1 : Préparation des ganglions lymphatiques inguinaux.
(A) Injection sous-cutanée de mélange de maître d'anticorps FACS dans la cuisse intérieure. (B) 3 h après l'injection, euthanasier la souris, immobiliser la souris sur une plaque acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale sur la peau abdominale pour empêcher le dépôt de fourrure autour de l'incision. (C) Effectuer une incision de ligne médiane dans l'abdomen du pubis au processus de xiphoïde. (D) Dissocier la musculature abdominale de la peau et faire un skin-flap. (E) Tapez la peau-flap sur la plaque acrylique. (F) Enlevez le ganglion lymphatique inguinal à l'aide d'un forceps incurvés par microchirurgie. (G-H) Placer l'orgue dans un plat de culture (G) et enlever la graisse qui entoure l'organe (H). (I) Image illustrative montrant la taille de l'organe après le nettoyage. J-M) Centraliser l'organe au milieu d'un plat de pétri (J), couvrir l'organe avec un morceau d'essuie-glaces délicates (K) et garder trempé avec chaud 0,9% salin ou 1x PBS (L, M). (N) Placer le plat Petri dans la fente de microscope. (O) Scanner l'organe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Préparation des ganglions lymphatiques popliteal.
(A, B) Injection sous-cutanée du mélange maître d'anticorps FACS dans le coussinet de patte. (C, D) 3 h après l'injection, euthanasier la souris, immobiliser la souris sur une plaque acrylique avec du ruban adhésif (C) et appliquer de l'huile minérale sur la peau abdominale pour empêcher le dépôt de fourrure autour de l'incision (D). (E) Effectuer une incision de milieu de la ligne dans le mollet du talon au genou. (F) Exposer la fossa popliteal. (G) Enlevez le ganglion lymphatique popliteal à l'aide de forceps courbés par microchirurgie. (H) Placez l'organe dans un plat de pétri et retirez la graisse qui entoure l'organe, centralisez l'organe au milieu du plat Petri, couvrez l'organe d'un morceau d'essuie-glaces délicats et conservez-les imbibés de salin chaud de 0,9 % ou 1x PBS. Placez le plat Petri dans la fente du microscope et numériser l'organe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images de microscopie confocales représentatives de ganglions lymphatiques inguinaux entiers de souris naïves non immunisées.
(A-C) Les lymphocytes LN B et T ont été tachés à l'aide de CD4 (vert; t cellules) et CD19 (rouge; cellules B); barre d'échelle de 50 m. (D-I) Amplification d'une zone spécifique avec objectif 10x; barre d'échelle de 30 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images de microscopie confocales représentatives de ganglions lymphatiques popliteal entiers de souris naïves non immunisées.
(A-C) Les lymphocytes LN B et T ont été tachés à l'aide de CD4 (vert; t cellules) et CD19 (rouge; cellules B); barre d'échelle de 60 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Images de microscopie confocales représentatives de ganglions lymphatiques inguinaux entiers de souris naïves non immunisées montrant des phagocytes.
(A-C) Les cellules LN B et phagocytic ont été souillées utilisant CD19 (vert ; cellules B) et F4/80 (bleu; phagocytes); barre d'échelle de 100 m; (D-F) LN T et les cellules phagocytiques ont été tachées à l'aide de CD3 (vert; lymphocytes T) et F4/80 (blancs; phagocytes); barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Images de microscopie confocales de ganglions lymphatiques inguinaux entiers du CX3CR1 génétiquement modifié GFP / CCR2 (en) DP/ souris sans injection de mélange maître d'anticorps.
(A-C) La distribution des cellules LN a été évaluée avec CX3CR1 (vert) et CCR2 (rouge); barre d'échelle de 100 m. (D-F) Amplification d'une zone spécifique avec objectif 20x; barre d'échelle de 50 m. (G-I) Répartition des cellules LN dans le plancher des ganglions lymphatiques sinus; barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Images de microscopie confocales de ganglions lymphatiques popliteal entiers du CX3CR1 génétiquement modifié GFP / CCR2 (en) DP/ souris sans injection de mélange maître d'anticorps.
(A-C) La distribution des cellules LN a été évaluée avec CX3CR1 (vert) et CCR2 (rouge); barre d'échelle de 200 m. (D-F) Amplification de l'organe entier avec l'objectif 10x ; barre d'échelle de 100 m. (G-I) Amplification d'une zone spécifique avec objectif 20x; barre d'échelle de 50 m. (J-L) Répartition des cellules LN dans le plancher des ganglions lymphatiques sinus; barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1 : La spécificité de la coloration des cellules T et B (Clic droit pour télécharger).
| laser | Puissance laser | gagner | compenser | trou |
| 406nm (en) | 20% | 65 | -5 | 60 m |
| 488nm (en) | 25% | 50 | -5 | 60 m |
| 561nm 561nm | 25% | 65 | -10 | 60 m |
Tableau 1 : Paramètres d'acquisition d'images.
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Discussion
La combinaison de l'imagerie avec d'autres techniques, y compris la biologie moléculaire et l'immunophénotypage de haute dimension a amélioré notre capacité d'étudier les cellules immunitaires dans leur contexte natif. En fait, alors que d'autres approches peuvent nécessiter la digestion des tissus et l'isolement cellulaire - ce qui peut conduire à la perte de l'intégrité des tissus - l'utilisation de l'imagerie in vivo ou ex vivo accorde un grand avantage dans l'étude de différents sous-types cellulaires d'une manière géographique3 , 16. Il n'est pas surprenant que la disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées dans lesquelles les cellules sont spécifiquement ciblées pour exprimer différents fluorophores augmente rapidement. Fait important, la combinaison de souris reporter et l'injection du mélange d'anticorps est un outil puissant pour tacher les différentes populations cellulaires in vivo dans le même organe4. En outre, la vulgarisation des outils d'édition de gènes comme CRISPR/Cas9 a permis à différents groupes de personnaliser leurs souches de souris d'une manière que pratiquement n'importe quel type de cellule peut maintenant être représenté dans leur emplacement de bonne foi17. En utilisant cette approche, la relation spatiale et fonctionnelle entre les différents types de cellules peut être évaluée en détail. Cependant, si l'imagerie du mouvement cellulaire ou des événements dynamiques in vivo ne sont pas obligatoires, une approche expérimentale moins complexe peut être utilisée. Dans ce cas, les anticorps et les sondes sont livrés in vivo, et l'organe (ou un échantillon) est directement visualisé au microscope.
Ici nous avons décrit un protocole simple qui a distribué l'utilisation de la cryoconservation de tissu et de cryosectioning qui peut potentiellement affecter des structures d'organe et a permis l'appréciation des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques suivant l'administration in vivo de anticorps fluorescents. Ces protocoles exigeaient des compétences techniques et chirurgicales minimales et pouvaient être adaptés pour visualiser pratiquement toutes les cellules immunitaires dans leur emplacement d'origine. Fait important, nous avons proposé que les anticorps soient administrés de manière à atteindre les ganglions lymphatiques en utilisant les mêmes voies que les antigènes et les cellules voyagent au cours d'une réponse immunitaire. En injectant des anticorps fluorescents dans l'espace sous-cutané, il était possible d'imiter tous les tissus et les barrières hémodynamiques trouvés in vivo et d'estimer la chronologie de la dissipation antigène. En plus de cette application, cette méthode pourrait être appliquée et utile pour la biodistribution de médicaments étiquetés florescents et les études de ciblage cellulaire des nanoparticules fluorescentes.
Cependant, il y a des limites à cette méthode. La quantité d'anticorps requis est plus élevée par rapport aux méthodes d'histologie conventionnelles; cependant, puisque la microscopie immunofluorescence conventionnelle nécessite plusieurs séries de préparation et de coloration des tissus afin d'optimiser la technique et d'obtenir de bonnes images, le coût de la microscopie conventionnelle peut potentiellement surmonter le coût de la haute concentration d'anticorps employée dans notre protocole. Ensuite, basé sur les propriétés connues du drainage de l'antigène lymphatique dans le ganglion lymphatique9,18, l'efficacité de l'étiquetage est susceptible de diminuer rapidement avec la distance à la vascularisation lymphatique en raison de la taille du réactif d'étiquetage Employé. En effet, les zones noires de certaines images peuvent résulter d'une mauvaise pénétration des tissus. Seulement 40-100 m de profondeur peuvent être atteints avec l'imagerie confocale de LN, et ainsi seulement les régions superficielles de LN peuvent être visualisées. Une façon au moins partiellement de surmonter ce problème est d'utiliser des fluorophores avec une meilleure excitation et la détection par le microscope. Une autre approche alternative consiste à utiliser la microscopie laser multiphoton avec une longueur d'onde d'excitation proche infrarouge qui a été la clé de l'imagerie des tissus profonds et a été montré pour contourner les problèmes graves de diffusion de la lumière observéeavec le laser photon unique confocal microscopie19. Dans le cas des cellules d'imagerie tachées par des anticorps qui ont été livrés in vivo, seuls les antigènes qui sont exprimés à la surface des cellules peuvent être ciblés. Si les anticorps utilisés n'ont pas encore été validés, il devient essentiel d'effectuer une coloration de contrôle de l'isotype correspondante pour exclure l'autofluorescence et valider l'étiquetage. Cela peut être effectué dans le même animal, c'est-à-dire, le mélange d'anticorps de ciblage cellulaire injecté ipsilaterally et mélange de contrôle d'isotype injecté contralaterally. En outre, la quantité d'anticorps nécessaires pour tacher efficacement une cellule in vivo peut varier entre les expériences et les lignées cellulaires et une autre approche pour cette limitation est d'utiliser l'expression de fluorescence ciblée par la génétique.
En conclusion, nous proposons un nouveau protocole pour l'imagerie de ganglion lymphatique entier qui maintient l'intégrité architecturale de tissu, est reproductible, facile-à-exécuter et emploient les microscopes confocal conventionnels. Cette technique démontre comment des méthodes simples peuvent permettre aux structures de laboratoire régulières de fonctionner comme des plates-formes polyfonctionnelles qui permettent des progrès majeurs dans l'investigation du système immunitaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH (R01 AI43458 à H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
