Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.
Abstract
בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים התפשטות בתוך הגוף, שם התגובות החיסונית מולדים יכול להתחבר עם חסינות אדפטיבית. למעשה, LNs הם משולבת אסטרטגית בנתיב של כלי הלימפה, המאפשר מגע אינטימי של אנטיגנים רקמות עם כל התאים החיסוניים הקבועים ב-LN. כך, הבנת הרכב הסלולר, הפצה, מיקום ואינטראקציה באמצעות לשעבר vivo הדמיה מלאה יוסיף לידע על איך הגוף מתאם תגובות החיסון המקומי מערכתית. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיה הדמיה vivo ex בעקבות בניהול vivo של נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט המאפשר מתודולוגיה מאוד מאוד וקלה לביצוע באמצעות קונפוקלית יקרוסקופים קונבנציונאלי ו ריאגנטים מניות. באמצעות הזרקה תת עורית של נוגדנים, ניתן לתייג אוכלוסיות תאים שונות בניקוז LNs מבלי להשפיע על מבני רקמות שעלולים להיפגע על ידי טכניקה מיקרוסקופית החיסונית קונבנציונאלי.
Introduction
בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים בצורת ovoid הנוכחי ברחבי הגוף עם הפונקציה הקריטית של גישור התגובות החיסונית מולדים ואדפטיבית. LNs לסנן את הלימפה כדי לזהות חלקיקים זרים ותאים סרטניים כדי לטעון תגובה חיסונית נגדם1. אנטיגן הצגת תאים (APCs), תאים T ו-B תאים לעבוד לצד ליצור אנטיגן ספציפי נוגדנים (חסינות הומאתית) ו ציטוטוקסיקס לימפוציטים (חסינות הסלולר) כדי לחסל את החלקיקים הזר תאים סרטניים2. כך, הבנת הדינמיקה של התאים החיסוניים נוכח במערכת הלימפה יהיו השלכות חשובות על פיתוח החיסון וחיסוני סרטן.
הופעתו של מיקרוסקופים חזק-כולל קונפוקלית וקד חדש ומיקרוסקופים רזולוציה סופר-אפשרה התקדמות יוצאת דופן בהבנת איך אוכלוסיות שונות תאים החיסונית להתנהג בסביבה הטבעית שלהם3. עכשיו זה אפשרי תמונה מספר סוגי תאים בו באמצעות שילוב של רגשים עם עכברים מהונדסים גנטית לבטא חלבונים פלורסנט תחת שליטה של יעדים ספציפיים4,5. למעשה, טכניקות ממדיות גבוהות, כולל cy, המוני וניתוחי זרימה רב-פרמטרית היו חיוניים להרחבת הידע שלנו על מידור תאים חיסוניים שונה ופונקציונליות בבריאות ובמחלות6, 7. עם זאת, כדי להכין דגימות עבור טכניקות אלה, רקמות צריך עיכול ותאים מופרדים מתוך הסביבה הטבעית שלהם להיות מנותח בתא השבולים. כדי להתעלות על מגבלות אלה ולאפשר תרגום טוב יותר בביולוגיה, המטרה של הפרוטוקול המוצע כאן היא להחיל מתודולוגיה ישירה על התמונה לשעבר vivo בלוטות הלימפה כולו באמצעות קונפוקלית מניות מיקרוסקופים עם היתרון של מהירות משופרת, רקמה שימור המבנה והכדאיות התאית בהשוואה למספר החיסונית הקונבנציונלי. באמצעות גישה זו, הצלחנו להראות כי עכברים לקוי עבור γδ T תאים, סוג של לימפוציטים T מעורב ההגנה המוקדמת מוקדם נגד פתוגנים4, יש להתפשר זקיקי ו תא T אזורי לעומת עכברים סוג פראי. ממצאים אלה אפשרו לנו להמשיך במחקר שבו הדגמנו כי תאים γδ T לשחק תפקיד קריטי הומאוסטזיס של איברי הלימפה ותגובה חיסונית ומוראלית4. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק מסלול פיזיולוגי עבור הבדיקות והנוגדנים כדי להגיע לצומת הלימפה, כפי שהם מנוהלים תת-עורי ומתפזר באמצעות זרימת הלימפה ברקמות, בנייה על דוחות הקודם המשמשים באתרו תיוג עם נוגדנים כדי להמחיש מבנים הקשורים לימפטי8,9, מרכז מונ, דינמיקה10,11,12, ומטרות נגישים בקלות כדי זרימת הדם13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול אושר על ידי ועדת העמידה על בעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד ובריגהם ובית החולים לנשים, פרוטוקול 2016N000230.
1. עכברים המשמשים לניסוי
- שימוש 8-שבוע עכברים זכר ונקבה על רקע B6 לניהול תערובת נוגדן.
- השתמש CX3CR1Gfp/wtCCR2rfp/wt עכברים כדי לקבוע אם לשעבר vivo שלם הדמיה בתוך יכול להיות גם להחיל על עכברי כתבת ללא מתן שילוב נוגדן, כמו גם כדי לחקור את הנוכחות של תאים mon, כולל אנטיגן הצגת תאים ו phagocytes, ואת התפוצה שלהם ב-LN.
הערה: CX3CR1Gfp/wtCCR2RFP/wt לעכברים כתבת יש חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ו חלבון פלורסנט אדום (rfp) הוכנס תחת השליטה של CX3CR1 ו CCR2 יזמים, בהתאמה. עכברים עיתונאי ניתן להשתמש עם או בלי ההזרקה של ערבוב הנוגדן. אנא ראה התייחסות4 להזרקה לערבב נוגדן בעכבר עיתונאי. המשך לניתוח אם לא ייזרקו נוגדן.
2. הכנה לערבוב הנוגדן והזרקה
הערה: בצע את השלבים הבאים על עכברים שתוארו בשלב 1.1.
- לדלל 1:10 של סגול מבריק (BV) 421 anti-CD4 (gk 1.5; 0.2 mg/ml), 1:10 של כחול מבריק (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0.2 mg/mL) ו-1:20 של phycoארימתרין (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) ב PBS עם הנפח הסופי המתאים להזריק לתוך הירך הפנימית (כדי ל התמונה אינרינרית) או לתוך משטח כף היד (כדי התמונה popliteal) הלימפה.
הערה: השתמש בתור איזוסוגים: BV421 Mouse IgG2b, k בקרת Isotypes (R35-38; 0.2 mg/mL); PE עכברוש IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 מ"ג/mL). אם שינוי הנוגדן מכתים, השתמש בסוג isotype נכון. - כדי להפוך את התמונה בפנים, להזריק 100 μL של שילוב הנוגדן תת-עורי לתוך הירך הפנימית (איור 1A). לחילופין, הכנס 50 μL תת-עורי של מיקס נוגדן לתוך משטח כף היד לתמונה popliteal LN (איור 2A). השתמש עדין 1 mL מזרקים אינסולין, (אינסולין U-100) עם מחט של גודל 0.30 mm × 13 מ"מ (30 מד × 1/2 אינץ).
הערה: ודא שהזריקה לצביעת הפנים היא תת-עורית ולא מתוך שרירי (הודעה), כמו ערבוב נוגדנים לא יירוקנו כראוי אם מנהל הודעה מבוצע. - אל להרדמה בעלי חיים לפני הזרקת נוגדן ערבוב.
- המתן עד למינימום של 3 שעות (משנה dLN) ו-12 h (popliteal dLN) הזרקת הודעה כדי להסיר את האיברים.
- אם התיוג בתא אינו נצפה לחלוטין באמצעות צבעי פלורסנט גדולים כגון סגול מבריק או כחול מבריק, השתמש fluorophores קטן יותר, כולל fluorescein isothiocyanate (FITC), PE ו allophycocyanin (APC) כחלופה.
3. הליך הניתוח כדי להסיר את הצומת הלימפה הניקוז
- המתת חסד באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- לשתק עכברים על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מספוגית כותנה לעור הבטן כדי למנוע התצהיר פרווה סביב החתך (איור 1B). אין צורך בהסרת פרווה.
- לבצע חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים מעוקל מיקרו (11.5 ס מ) ו מלקחיים מעוקל מיקרו (12.5 ס מ) בבטן מן הערווה לתהליך xiphoid (איור 1C).
- הנתק את השרירים הבטני מהעור (איור 1D).
- הפוך את העור חתכים אופקיים בחלק העליון והתחתון של קו החתך האנכי כדי ליצור מדפים העור בצד של עניין (על פי הצד של הזרקת הנוגדן לערבב) והכנף את העור כדי להמחיש את הצומת לימפה (איור 1E).
- מקליט את העור על צלחת אקריליק (איור 1F).
- להסיר את הצומת הלימפה הניקוז להסרת המוח באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1F). הלימפה יופיע כמו בצבע, בדרך כלל בלהה, כדור מתחת לעור.
4. הליך ניתוח כדי להסיר את הצומת ניקוז לימפה popliteal
- המתת חסד באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- לשתק עכברים במצב נוטה על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מבער כותנה בעגל ובברך (איור 2א-ד).
- לבצע חתך באמצע קו בעגל מן העקב אל הברך (איור 2E, F).
- הנתק את שרירי השרירים של העגל מהעור (איור 2F, G).
- לחשוף את הפוסות פוקליטיל (איור 2G). בלוטות הלימפה של פופטיל. תופיע ככדור שחור בפוסות הפויבטיל
- הסר את הצומת הלימפה popliteal באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 2G).
- לחילופין, להפוך את העכבר מעל מיקום פרקדן, ולהתקרב לפוסה popliteal בין שרירי הזרוע והsemitendinosus עבור הסרת popliteal ב ידי ביצוע חתך באמצע הדרך בעגל מן העקב אל הברך ואחריו הדיסוציאציה של העגל שרירים מהעור
הערה: פוליטיל פוסות הוא דיכאון רדוד הממוקם בחלק האחורי של מפרק הברך. פתח בקפידה כדי לראות את הצומת לימפה popliteal.
5. הכנת צומת לימפה
- מניחים את כל האיבר בצלחת תרבות עם תחתון זכוכית (35 מ"מ x 10 מ"מ) ולהסיר את השומן המקיף את האיבר באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1G-I ואיור 2h).
- מרכז את האיבר באמצע המנה (איור 1J ואיור 2h).
- כסו את העוגב בחלק מחלונות המשימה העדינים ושמרו אותו רטוב עם טמפרטורת החדר מלוחים 0.9% או תמיסת פוספט מאגר (איור 1K-M ואיור 2h).
הערה: אין צורך לשטוף בלוטות הלימפה לאחר ההסרה או לבצע את החילוץ הלימפה במכסה המנוע.
6. vivo לשעבר-מיקרוסקופ קונסקופיה (הדמיה)
- מקמו את צלחת פטרי בחריץ המיקרוסקופ ההפוך הפוך (איור 1N ואיור 2h).
- Lns תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1o ואיור 2h).
- ראשית, לקבל את המוקד הנכון באמצעות אור קונבנציונאלי של המיקרוסקופ קונפוקלית עם המטרה 4x או 10x. לאחר מכן לשנות מפונקציית האור למצב לייזר.
הערה: אם המיקרוסקופ קונפוקלית לא מכיל מטרה 4x, המוקד יכול להיות מושגת באופן מושלם באמצעות המטרה 10x. - כוונן את כוח הלייזר, היסט והרווח באמצעות מדגם isotype, שאינו מוכתם או שאינו פלורסנט (טבלה 1) כדי להסיר מכתמים אוטומטיים וכתמים לא ספציפיים מנוגדנים המסומנים ב-פלורסנט כגון אלה המשמשים בתמונות הראו ב כתב יד (BV-421 anti-CD4, BB515 אנטי-CD19 ו-PE anti-F4/80).
- כוונן את מיקומי ה- Z ו- XY , באמצעות מיקרומד ומרכבה, בהתאמה, על אזור העניין בצומת הלימפה.
- לרכוש תמונות תחת 4 x, 10x ו 20x מטרות התמקדות מבנה LN והפצה סלולרית. השתמש בהגדרה 1024 x 1024-פיקסלים.
הערה: השיגו חמש תמונות לפחות בתחומים שונים לכל מטרה לכל חיה. - לנתח תמונות באמצעות תוכנת תמונה כדי להפריד בין ערוצים, להוסיף קנה מידה וצבעים של עניין, ולשחזר תצוגה תלת-ממדית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב יד זה מראה טכניקות כדי להסיר בלוטות לימפה ומבלי לפגוע במבנה שלהם בעקבות הזרקת נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט כדי להכתים אוכלוסיות תאים מסוימות באיברים אלה (איור 1 ואיור 2 ).
השילוב החזק של האימונויניום של תאי LN עם BV421 anti-CD4 ו BB515 anti-CD19 ו הדמיה מיקוד ניתוח הגדיר את הלוקליזציה של תאי T (CD4 +) ו B תאים (CD19 +) ב אינלירינל ו popliteal LNs. בשני האברים, התאים מוקפים באוכלוסיית תאי T (איור 3, איור 4 ווידאו 1), סימן ההיכר של מבנה ה-LN1. כדי לא לכלול את האפשרות כי phagocytes רירית הסינוסים הלימפה יכול ללכוד את נוגדנים פלורסנט מוזרק ולגרום תיוג שאינו ספציפי של סמנים תא, PE anti-F4/80 נכלל בתמהיל נוגדן. כפי שמוצג באיור 5, phagocytes לא להפנים נוגדנים מוזרק, המציין כי B ו-T כתמים תא היה ספציפי. יתר על כן, Video 1 מראה כי כתמים תא T ו-B לא חופפים, אישור הצביעת ספציפיות.
כדי לחקור את הלוקליזציה המרחבית של התאים phagocytic מונוליטיים ב-LN, אינלירינזה ו popliteal LNs מ CX3CR1Gfp/+ CCR2rfp/+ היו תמונות. תאים מוננורורים נמצאו ברחבי העיר הזאת, כולל הסינוס הsubcapsular. רוב התאים האלה היו CX3CR1Gfp/+, ואחריו CCR2rfp/+ ו כפול תאים חיוביים (צהוב) (איור 6A-F). דפוס זהה של התפלגות התא ופנוטיפים לתא נצפתה ב-the popliteal בתוך (איור 7א-י). שני אינריניום ו popliteal LNs הראו אזורים שחורים ללא CX3CR1Gfp/+ CCR2rfp/+, אשר מאוכלס על ידי לימפוציטים. יתר על כן, CX3CR1 + ו CCR2 + תאים היו נדירים באזור הפנימי של LNs ומרוכזים באזור החיצוני, המציין כי תאים אלה בעיקר לכבוש את הסינוס subcapsular LN (איור 6G-I ואיור 7J-L). כך, הפרוטוקול המוצע יכול בבירור להגדיר אוכלוסיות תאים מרכזיים נוכח בלוטות הלימפה.
איור 1: הכנה לימפה אינרינרית.
(א) הזרקה תת-עורית של הרכב נוגדן facs לערבב לתוך הירך הפנימית. (ב) 3 h לאחר ההזרקה, המתת החסד העכבר, משתק את העכבר על צלחת אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי לעור הבטן כדי למנוע את התצהיר פרווה סביב החתך. (ג) לבצע חתך באמצע קו הבטן מן הערווה לתהליך xiphoid. (ד) הנתק את השרירים הבטני מהעור ולעשות כנף עור. (ה) קלטת את העור-דש על לוחית אקריליק. (ו) להסיר את הצומת הלימפה אינרינאלה באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרוניתוח. (G-H) מניחים את האיבר בתבשיל תרבות (G) ומסירים את השומן המקיף את העוגב (H). (I) המחשה תמונה המציגה את גודל האיבר לאחר הניקוי. J-M) לרכז את האיבר באמצע צלחת פטרי (j), לכסות את האיבר בעזרת פיסת חלונות משימה עדינה (K) ולשמור על ספוג עם חם 0.9% תמיסת מלח או 1X PBS (L, M). (N) מקמו את צלחת הפטרי בחריץ המיקרוסקופ. (O) לסרוק את העוגב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה לימפה פופטיל.
(א, ב) הזרקה תת-עורית של הרכב נוגדן FACS מיקס לתוך כרית כף היד. (ג, ד) 3 שעות לאחר ההזרקה, המתת החסד העכבר, משתק את העכבר על צלחת אקריליק עם דבק (C) ולהחיל שמן מינרלי על עור הבטן כדי למנוע התצהיר פרווה סביב החתך (ד). (ה) לבצע חיתוך קו ביניים בעגל מן העקב אל הברך. (ו) לחשוף את פוסות הפופטיל. (G) להסיר את הצומת לימפה popliteal באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו. (ח) מניחים את העוגב בצלחת פטרי ומסירים את השומן המקיף את האיבר, מרכז את האיבר באמצע צלחת פטרי, מכסים את האיבר בחתיכת מנקי משימות עדינים וממשיכים לספוג בתמיסת מלח חמה 0.9% או 1X PBS. הצב את צלחת פטרי בחריץ המיקרוסקופ וסרוק את האיבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנציג הקונמיקרוסקופיה מיקרוסקופית תמונות של בלוטות הלימפה שלמים של עכברים תמימים שאינם חיסונים.
(א-ג) התאים LN B ו-T היו מוכתמים באמצעות CD4 (ירוק; תאי T) ו-CD19 (אדום; B תאים); סרגל בקנה מידה = 50 μm. (D-I) הגברה של שטח ספציפי עם מטרה 10x; סרגל בקנה מידה = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הנציג הקונמיקרוסקופיה מיקרוסקופית תמונות של בלוטות לימפה שלמות popliteal של עכברים תמימים שאינם חיסונים.
(א-ג) התאים LN B ו-T היו מוכתמים באמצעות CD4 (ירוק; תאי T) ו-CD19 (אדום; B תאים); סרגל בקנה מידה = 60 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הנציגה הייצוגית מיקרוסקופיה של הצומת הלימפה השלם של עכברים תמימים שאינם חיסונים מראה phagocytes.
(א-ג) תאים B ו phagocytic היו מוכתמים באמצעות CD19 (ירוק; B תאים) ו-F4/80 (כחול; phagocytes); סרגל בקנה מידה = 100 μm; (D-F) בתאי T ו phagocytic היו מוכתמים באמצעות CD3 (ירוק; תאי T) ו-F4/80 (לבן; phagocytes); סרגל בקנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות מיקרוסקופ confocal וקדי של בלוטות הלימפה שלמים של CX3CR1 גנטית שונה Gfp/+ CCR2 Rfp/+ עכברים ללא הזרקת נוגדנים הורים לערבב.
(א-ג) התפלגות תא בתוך התא הוערכו עם CX3CR1 (ירוק) ו-CCR2 (אדום); סרגל בקנה מידה = 100 μm. (D-F) הגברה של שטח ספציפי עם מטרה 20x; סרגל בקנה מידה = 50 μm. (G-I) בתוך תא הפצת בצומת לימפה ברצפה הסינוס; סרגל בקנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות מיקרוסקופית הקונסקופיה של בלוטות הלימפה של popliteal ששונו גנטית CX3CR1 Gfp/+ CCR2 Rfp/+ עכברים ללא הזרקת נוגדנים הורים לערבב.
(א-ג) התפלגות תא בתוך התא הוערכו עם CX3CR1 (ירוק) ו-CCR2 (אדום); סרגל בקנה מידה = 200 μm. (D-F) הגברה של איבר שלם עם מטרה 10x; סרגל בקנה מידה = 100 μm. (G-I) הגברה של שטח ספציפי עם מטרה 20x; סרגל בקנה מידה = 50 μm. (י-ל) בתוך תא הפצת בצומת לימפה ברצפה הסינוס; סרגל בקנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הספציפיות של מכתים תא T ו-B (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
| לייזר | לייזר כוח | קבל | יסט | חריר |
| 406nm | 20 | 65 | . חמש דקות | 60 μm |
| 488nm | 25 | 50 | . חמש דקות | 60 μm |
| 561nm | 25 | 65 | . עשר דקות | 60 μm |
טבלה 1: הגדרות רכישת תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השילוב של הדמיה עם טכניקות אחרות, כולל ביולוגיה מולקולרית מימדי החיסונית גבוהה החיסון הגדילו את היכולת שלנו לחקור את התאים החיסוניים בהקשר המקורי שלהם. למעשה, בעוד גישות אחרות עשויות לדרוש עיכול רקמות ובידוד התא – אשר יכול להוביל לאובדן שלמות רקמות-השימוש ב vivo או ex הדמיה vivo מעניקה יתרון גדול בחקירת תת סוגים שונים בצורה גיאוגרפית3 , 16. זה לא מפתיע כי הזמינות של זנים העכבר מהונדסים גנטית שבו תאים מיועדים במיוחד fluorophores שונים הוא גדל במהירות. חשוב מכך, שילוב של עכברים עיתונאי והזרקה של תערובת הנוגדן הוא כלי רב עוצמה כדי להכתים אוכלוסיות תאים שונות ב-vivo באותו איבר4. יתר על כן, הפופולריזציה של כלים לעריכת גנים כמו CRISPR/Cas9 אפשרה קבוצות שונות כדי להתאים אישית את זנים העכבר שלהם בדרך כי כמעט כל סוג תא יכול להיות התמונה כעת במיקום שלהם בתום מיקום17. באמצעות גישה זו, היחסים המרחבית והפונקציונליים בין סוגי תאים שונים ניתן להעריך בפרטים עמוקים. עם זאת, אם הדמיה של תנועת התא או אירועים דינאמיים ב vivo אינם חובה, ניתן להשתמש בגישה ניסיונית פחות מורכבת. במקרה זה, נוגדנים וזונדים מועברים בvivo, ואת האיבר (או מדגם) הוא הדמיין ישירות במיקרוסקופ.
כאן תיארנו פרוטוקול פשוט שסיפק את השימוש הקריוגנית רקמות וקריוסיניות כי יכול להשפיע על מבנים איברים מותר להעריך את התאים החיסוניים בתוך בלוטות הלימפה בעקבות הממשל vivo של נוגדנים עם תוויות פלורסנט. פרוטוקולים אלה דורשים כישורים טכניים מינימלי כירורגי יכול להיות מותאם להמחיש כמעט כל התאים החיסוניים במיקום המקורי שלהם. חשוב מכך, הציעו כי נוגדנים צריך להיות מנוהל בדרך שהם יגיעו לבלוטות הלימפה באמצעות מסלולים אותם אנטיגנים ותאים לנסוע במהלך התגובה החיסונית. על ידי הזרקת נוגדנים פלורסנט בחלל תת עורית, זה היה אפשרי לחקות את כל הרקמות מחסומים הומודינמיקה שנמצאו vivo ולאמוד את הכרונולוגיה של פליטת אנטיגן. בנוסף ליישום זה, ניתן ליישם שיטה זו ושימושית עבור ביוהפצה של תרופות בעלי תוויות פלורסצנטי ומחקרים המכוונות לתאים של חלקיקי פלורסנט.
עם זאת, ישנן מגבלות לשיטה זו. כמות הנוגדן הנדרש הוא גבוה יותר לעומת שיטות קונבנציונאלי היסטולוגיה; עם זאת, מאז מיקרוסקופ immunofluorescence קונבנציונאלי הקונבנציונלי דורש מספר סיבובים של הכנת רקמות וכתמים על מנת לייעל את הטכניקה ולקבל תמונות טובות, העלות של מיקרוסקופ קונבנציונלי יכול להתגבר על העלות של גבוה הריכוז נוגדן המועסקים בפרוטוקול שלנו. הבא, מבוסס על המאפיינים הידועים של הניקוז הלימפה אנטיגן לתוך הצומת לימפה9,18, את היעילות של תיוג הוא עלול להקטין במהירות עם המרחק אל הלימפה ולימפתי בשל הגודל של תיוג מגיב ועסקים. אכן, האזורים השחורים בחלק מהתמונות עלולים לנבוע מחדירה לרקמות המסכנות. רק 40-100 יקרומטר לעומק ניתן להשיג עם הדמיה קונפוקלית וקד של LN, ולכן רק אזורים שטחיים ln ניתן לדמיין. אחת הדרכים להתגבר חלקית לפחות בעיה זו היא להשתמש fluorophores עם עירור טוב יותר זיהוי על ידי המיקרוסקופ. גישה חלופית אחרת היא להשתמש מיקרוסקופ לייזר רב מולטיפוטון עם הקרוב-אינפרא אדום עירור גל כי כבר המפתח הדמיה רקמות עמוק הוכח לעקוף בעיות חמורות פיזור אור שנצפתה עם קונפוקלית וקד לייזר פוטון יחיד מיקרוסקופיה19. במקרה של תאים הדמיה מוכתם על ידי נוגדנים שנמסרו בvivo, רק אנטיגנים כי מבוטא על פני השטח התא יכול להיות ממוקד. אם השימוש בנוגדנים לא אומת עדיין, זה הופך קריטי לבצע כתמים בקרת isotype המתאים כדי להוציא את הקרינה האוטומטית ולאמת את התיוג. זה יכול להתבצע באותה חיה, כלומר, תא מיקוד לערבב נוגדנים מוזרק ipsilaterally ו isotype לערבב בקרת contralaterally. בנוסף, כמות הנוגדן הנדרש כדי להכתים ביעילות תא בvivo עשוי להשתנות בין ניסויים וקווי תאים וגישה חלופית עבור מגבלה זו היא להשתמש גנטית ממוקד ביטוי פלואורסצנטית.
לסיכום, אנו מציעים פרוטוקול חדש עבור הלימפה לימפה שלמות הדמיה כי שומר על שלמות אדריכלית הרקמה, הוא לאפשר, קל לבצע ולהשתמש קונבנציונאלי קונפוקלית יקרוסקופים. טכניקה זו ממחישה כיצד שיטות פשוטות יכולות לאפשר למבני מעבדה רגילים לעבוד כפלטפורמות פולי-פונקציונלי המאפשרות התקדמות מרכזית בחקירת המערכת החיסונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH (R01 AI43458 to H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
