Summary
Detta protokoll beskriver en teknik för att avbilda olika cellpopulationer i dränerande lymfkörtlar utan förändringar i orgel strukturen.
Abstract
Lymfkörtlar (LNs) är organ spridda i kroppen, där den medfödda immunsvaret kan ansluta med den adaptiva immunitet. I själva verket, LNS är strategiskt inföll i vägen för lymfkärlen, så intim kontakt av vävnad antigen med alla bosatta immunceller i LN. Sålunda, förstå den cellulära sammansättning, distribution, plats och interaktion med ex vivo hela LN Imaging kommer att lägga till kunskap om hur kroppen samordnar lokala och systemiska immunsvar. Detta protokoll visar en ex vivo Imaging strategi efter en in vivo administrering av fluorescerande-märkta antikroppar som möjliggör en mycket reproducerbar och lätt att utföra metodik med hjälp av konventionella konfokala Mikroskop och lager reagenser. Genom subkutan injektion av antikroppar, är det möjligt att märka olika cellpopulationer i dränering LNs utan att påverka vävnads strukturer som kan potentiellt skadas av en konventionell immunofluorescensmikroskopi teknik.
Introduction
Lymfkörtlar (LNs) är ovoid-formade organ brett närvarande i hela kroppen med den avgörande funktionen att överbrygga den medfödda och adaptiva immunsvar. LNs filtrera lymfa för att identifiera främmande partiklar och cancerceller att montera ett immunsvar mot dem1. Antigen presenterande celler (APCs), T-celler och B-celler fungerar parallellt för att generera antigen-specifika antikroppar (humorala immunitet) och cytotoxiska lymfocyter (cellulära immunitet) för att eliminera främmande partiklar och cancerceller2. Således, förstå dynamiken i immunceller som finns i lymfsystemet kommer att få viktiga konsekvenser för vaccinutveckling och cancer immunterapi.
Tillkomsten av kraftfulla Mikroskop-inklusive nya konfokala och super resolution Mikroskop-har tillåtit en extraordinär avancemang att förstå hur olika immunceller populationer beter sig i sin egen miljö3. Det är nu möjligt att avbilda flera samtidiga cell subtyper med hjälp av en kombination av sonder med genetiskt modifierade möss som uttrycker fluorescerande proteiner under kontroll av specifika mål4,5. I själva verket, hög dimensionell teknik, inklusive masscytometri och multi-parametriska Flödesanalys har varit avgörande för att utvidga vår kunskap om olika immun Celluppdelning och funktionalitet i hälsa och sjukdom6, 7. för att förbereda prover för dessa tekniker behöver vävnader dock matsmältningen och cellerna separeras från sin naturliga miljö för att analyseras i cellsuspensioner. För att överträffa dessa begränsningar och möjliggöra en bättre översättning i biologi, målet med det protokoll som föreslås här är att tillämpa en enkel metod för bild ex vivo hela lymfkörtlar med hjälp av lager konfokala Mikroskop med fördelen av förbättrad hastighet, vävnad struktur bevarande och cellviabilitet jämfört med konventionell immunofluorescensfärgning. Genom att använda denna metod, kunde vi visa att möss bristfällig för känner T-celler, en subtyp av T-lymfocyter inblandade i värd tidigt försvar mot patogener4, har komprometterat folliklar och T cell zoner jämfört med Wild typ möss. Dessa fynd tillät oss att fullfölja en studie där vi visade att känner T-celler spelar en avgörande roll i homeostasen av lymfoida organ och humorala immunsvar4. Dessutom ger detta protokoll en fysiologisk väg för sonder och antikroppar för att nå lymfkörtlarna, eftersom de administreras subkutant och försvinna genom vävnad lymfcirkulationen, bygger på tidigare rapporter som används i situ-märkning med antikroppar för att visualisera lymfatiska-associerade strukturer8,9, avelsmaterial Center Dynamics10,11,12, och mål lättillgängliga för blodflödet13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet godkändes av ständiga kommittén för djur vid Harvard Medical School och Brigham and Women ' s Hospital, protokoll 2016N000230.
1. möss som används för experimentet
- Använd 8-veckors gamla manliga och kvinnliga möss på B6 bakgrund för att administrera antikropps blandningen.
- Använd CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT- möss för att avgöra om ex vivo hela LN-avbildning också kan appliceras på rapportmöss utan att administrera antikropps blandningen samt för att undersöka närvaron av mononukleära celler, inklusive antigen som uppvisar celler och fagocyter, och deras utbredning i LN.
Anmärkning: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter möss har grönt fluorescerande protein (GFP) och rött fluorescerande protein (RFP) införas under kontroll av CX3CR1 och CCR2 initiativtagare, respektive. Reporter möss kan användas med eller utan injektion av antikropps blandningen. Se referens4 för injektion av antikropps blandningen i en reporter-mus. Gå vidare till kirurgi om ingen antikropp kommer att injiceras.
2. beredning och injektion av antikropps blandningen
Anmärkning: utför dessa steg på möss som beskrivs i steg 1,1.
- Späd 1:10 av lysande violett (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 av briljantblått (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) och 1:20 av phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) i PBS med lämplig slutlig volym att injicera i det inre låret (för att bild inguinal) eller i Paw pad (till bild Poplietallymfknutor) lymfa.
Anmärkning: användning som isotyper: BV421 mus IgG2b, k Isotype-kontroll (R35-38; 0,2 mg/mL); PE råtta IgG2a, κ isotyp kontroll (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 råtta IgG2a, κ isotyp kontroll (R35-95; 0,2 mg/mL). Om du ändrar färg antikroppen, Använd korrekt isotyp. - För att avbilda ljumsk LN, injicera 100 μl av antikropps blandningen subkutant i det inre låret (figur 1a). Alternativt, injicera 50 μL subkutant av antikropps blandningen i Paw pad till bild popliteal LN (figur 2A). Använd ömtåliga 1 mL insulin sprutor, (insulin U-100) med nålen i storlek 0,30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 tum).
Obs: se till att injektionen för ljumsk LN-färgning är subkutan och inte intramuskulär (i.m.), eftersom antikropps blandningen inte kommer att tömmas ordentligt om i.m.-administrering utförs. - Inte söva djur före antikropps blandning injektion.
- Vänta minst 3 h (inguinal dLN) och 12 h (popliteal dLN) efter injektion för att ta bort organ.
- Om LN cell märkning inte är helt observeras med hjälp av stora polymer fluorescerande färgämnen såsom lysande violett eller lysande blå, använda mindre fluoroforer, inklusive fluorescein isotiocyanat (FITC), PE och allophycocyanin (APC) som ett alternativ.
3. kirurgi förfarande för att ta bort ljumsk dränering lymfkörtel
- Euthanize möss som använder CO2 kvävning följt av cervikal dislokation.
- Immobilisera möss på akryl scenen med tejp och applicera mineralolja med en bomullstuss till buk huden för att förhindra päls avsättning runt snittet (figur 1b). Päls avlägsnande är inte nödvändigt.
- Utför en mittlinjen snitt med hjälp av mikrokirurgi böjda sax (11,5 cm) och mikrokirurgi böjda Pinkett (12,5 cm) i buken från pubis till xiphoid processen (figur 1c).
- Separera bukmuskulaturen från huden (figur 1d).
- Gör horisontella hud snitt på toppen och botten av den vertikala snitt linjen för att skapa hudflikar på sidan av intresse (enligt sidan av antikropp blandningen injektion) och vifta med huden för att visualisera lymfkörtel (figur 1e).
- Tejpa upp huden-luckan på akryl plattan (figur 1f).
- Ta bort ljumsk dränering lymfkörtel med hjälp av mikrokirurgi böjda tång (figur 1f). Lymfkörtel kommer att visas som en translucid, vanligen bilobular, sfär under huden.
4. kirurgi förfarande för att ta bort Poplietallymfknutor dränering lymfkörteln
- Euthanize möss som använder CO2 kvävning följt av cervikal dislokation.
- Immobilisera möss på en liggande position på akryl scenen med tejp och applicera mineralolja med en bomullstuss i vaden och knäet (figur 2a-D).
- Utför en mittlinje snitt i kalven från hälen till knäet (figur 2E, F).
- Separera kalvmuskulaturn från huden (figur 2F, G).
- Exponera popliteal fossa (figur 2g). Popliteal lymfkörtel kommer att visas som en translucid sfär i popliteal fossa.
- Ta bort Poplietallymfknutor lymfkörteln med hjälp av mikrokirurgi böjda tång (figur 2g).
- Alternativt, vrid musen över på rygg position, och närma sig popliteal fossa mellan biceps femoris och semitendinosus för popliteal LN avlägsnande genom att utföra en mittlinjen snitt i kalven från hälen till knäet följt av dissociation av kalven muskulatur från huden.
Anmärkning: popliteal fossa är en grund depression ligger på bak i knäleden. Öppna försiktigt för att se Poplietallymfknutor lymfkörteln.
5. beredning av lymfkörteln
- Placera hela orgeln i en kultur rätt med glasbotten (35 mm x 10 mm) och ta bort fettet som omger orgeln med hjälp av mikrokirurgi böjda pinpett (figur 1G-I och figur 2H).
- Centralisera orgeln i mitten av skålen (figur 1J och figur 2H).
- Täck orgeln med ett fragment av känsliga uppgift vindrutetorkare och hålla den blöt med rumstemperatur saltlösning 0,9% eller fosfatbuffert lösning (figur 1K-M och siffra 2H).
Anmärkning: det är inte nödvändigt att tvätta lymfkörtlar efter avlägsnande eller att utföra lymfkörteln utvinning i huven.
6. ex-vivo-konfokalmikroskopi (avbildning)
- Placera petriskål i det inverterade konfokala Mikroskop facket (figur 1N och figur 2H).
- Bild LNs under ett konfokalmikroskop (figur 1O och figur 2H).
- Först, få rätt fokus genom att använda det konventionella ljuset i det konfokala mikroskopet med 4x eller 10X mål. Byt sedan från ljus funktionen till laser läget.
Obs: om konfokalmikroskopet inte innehåller ett 4x-objektiv kan fokus uppnås perfekt med hjälp av 10X-målet. - Justera lasereffekten, offset och förstärkning med ett isotypmålat, icke-färgat eller icke-fluorescerande prov (tabell 1) för att ta bort autofluorescens och ospecifik färgning från fluorescerande-märkta antikroppar såsom de som används i bilderna visade i denna manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 och PE anti-F4/80).
- Justera Z och XY positioner, med hjälp av mikrometriska och Chariot, respektive, på området av intresse i lymfkörtel.
- Hämta bilder under 4x-, 10X-och 20x-mål med fokus på LN-strukturen och mobil distributionen. Använd 1024 x 1024-pixel definition.
Obs: förvärva minst fem bilder inom olika områden per mål per djur. - Analysera bilder med hjälp av en bildprogram vara för att separera kanaler, lägga till skala och färger av intresse, och att rekonstruera 3D-vy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta manuskript visar tekniker för att ta bort ljumsk och popliteal lymfkörtlar utan att skada deras struktur efter injektion av fluorescerande-märkta antikroppar för att färga specifika cellpopulationer i dessa organ (figur 1 och figur 2 ).
Den kraftfulla kombinationen av immunolabeling av LN celler med BV421 anti-CD4 och BB515 anti-CD19 och konfokalmikroskopi Imaging analys definierade lokalisering av T-celler (CD4 +) och B-celler (CD19 +) i ljumsk och Poplietallymfknutor LNS. I båda organen, B cell folliklar var omgiven av T cellpopulationer (figur 3, figur 4 och video 1), ett kännetecken för LN struktur1. För att utesluta möjligheten att fagocyter som kantar lymf bihålorna kan fånga de injicerade fluorescerande antikropparna och resultera i icke-specifik märkning av cell markörer, PE anti-F4/80 ingick i antikropps blandningen. Som visas i figur 5, fagocyter inte internalisera injiceras antikroppar, vilket tyder på att B och T cell färgning var specifik. Dessutom visarvideo 1 att T-och B-cellsfärgning inte överlappar varandra, vilket bekräftar färgspecificitet.
För att undersöka den rumsliga lokalisering av fagocytiska mononukleära celler i LN, ljumsk och Poplietallymfknutor LNS från CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+ var avbildade. Mononukleära celler hittades i hela ljumsk LN, inklusive subkapsulär sinus. Majoriteten av dessa celler var CX3CR1GFP/+, följt av CCR2RFP/+ och dubbla positiva celler (gul) (figur 6A-F). Samma mönster av cell distribution och cell fenotyper observerades i popliteal LN (figur 7A-I). Både ljumsk och knä skals LNS visade svarta regioner utan CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, som upptas av lymfocyter. Dessutom var CX3CR1 + och CCR2 + celler knappa i det inre området av LNs och koncentrerade i det yttre området, vilket indikerar att dessa celler främst upptar LN subkapsulär sinus (figur 6G-I och figur 7J-L). Således kan det föreslagna protokollet tydligt definiera stora cellpopulationer som finns i lymfkörtlar.
Figur 1: ljumsk lymfkörtel beredning.
(A) subkutan injektion av FACS antikropp Master Mix i det inre låret. (B) 3 h efter injektionen, euthanize musen, immobilisera musen på en akrylplatta med tejp och tillämpa mineralolja på buken huden för att förhindra päls deposition runt snittet. (C) utföra en mittlinjen snitt i buken från pubis till xiphoid processen. (D) separera bukmuskulaturen från huden och gör en hudflik. (E) tejpa upp hud luckan på akryl plattan. (F) ta bort ljumsk lymfkörtel med en mikrokirurgi böjda tång. (G-H) Placera orgeln i en kultur rätt (G) och ta bort fettet som omger orgeln (H). (I) illustrativ bild som visar orgel storlek efter rengöring. J-M) centralisera orgeln i mitten av en petriskål (j), täck orgeln med en bit delikat uppgift vindrutetorkare (K) och hålla blöt med varma 0,9% SALTLÖSNING eller 1x PBS (L, M). (N) Placera petriskål i Mikroskop facket. (O) skanna orgeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: popliteal lymfkörtel förberedelse.
(a, B) Subkutan injektion av FACS antikropp Master Mix i Paw pad. (C, D) 3 h efter injektionen, euthanize musen, immobilisera musen på en akrylplatta med tejp (c) och tillämpa mineralolja på buken huden för att förhindra päls avsättning runt snittet (D). (E) utför en mittlinje snitt i kalven från hälen till knäet. (F) exponera pop lie tal lymf muskeln fossa. (G) ta bort Poplietallymfknutor lymfkörteln med hjälp av mikrokirurgi-böjda tång. (H) Placera orgeln i en petriskål och ta bort fettet som omger orgeln, centralisera orgeln i mitten av petriskål, täck orgeln med en bit delikat uppgift vindrutetorkare och hålla blöt med varm saltlösning 0,9% eller 1x PBS. Placera petriskål i Mikroskop facket och skanna orgeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa konfokalmikroskopi bilder av hela ljumsk lymfkörtlar av icke-vaccinerade naiva möss.
(a-C) LN B och T-celler färgas med CD4 (grön; T-celler) och CD19 (röd; B-celler); skalstapel = 50 μm. (D-I) Amplifiering av specifika områden med 10X mål; skalstapel = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa konfokalmikroskopi bilder av hela popliteal lymfknutor av icke-immuniserade naiva möss.
(a-C) LN B och T-celler färgas med CD4 (grön; T-celler) och CD19 (röd; B-celler); skalstapel = 60 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa konfokala mikroskopi bilder av hela ljumsk lymfkörtel av icke-vaccinerade naiva möss som visar fagocyter.
(a-C) LN B och fagocyterande celler färgas med hjälp av CD19 (grön; B-celler) och F4/80 (blå; fagocyter); skalstapel = 100 μm; (D-F) LN T och fagocytos celler färgas med CD3 (grön; T-celler) och F4/80 (vita; fagocyter); skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: konfokala mikroskopi bilder av hela ljumsk lymfkörtlar av genetiskt modifierade CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ möss utan antikropp Master Mix injektion.
(a-C) LN-celldistributionen utvärderades med CX3CR1 (grön) och CCR2 (röd); skalstapel = 100 μm. (D-F) Amplifiering av specifikt område med 20x mål; skalstapel = 50 μm. (G-I) LN cell distribution i lymfkörtel sinus golvet; skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: konfokala mikroskopi bilder av hela popliteal lymfknutor av genetiskt modifierade CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ möss utan antikropp Master Mix injektion.
(a-C) LN-celldistributionen utvärderades med CX3CR1 (grön) och CCR2 (röd); skalstapel = 200 μm. (D-F) Amplifiering av hela orgeln med 10X mål; skalstapel = 100 μm. (G-I) Amplifiering av specifikt område med 20x mål; skalstapel = 50 μm. (J-L) LN cell distribution i lymfkörtel sinus golvet; skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: specificiteten hos T-och B-cellsfärgning (Högerklicka för att ladda ner).
| Laser | Laser effekt | Få | Förskjutning | Hål |
| 406nm | 20 | 65 | -5 | 60 μm |
| 488nm | 25 | 50 | -5 | 60 μm |
| 561nm | 25 | 65 | -10 | 60 μm |
Tabell 1: inställningar för bild anskaffning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen av avbildning med andra tekniker, inklusive molekylärbiologi och hög dimensionell immunophenotypning har förbättrat vår förmåga att undersöka immunceller i sitt eget sammanhang. I själva verket, medan andra metoder kan kräva vävnadsnedbrytning och cell isolering – vilket kan leda till förlust av vävnad integritet-användning av in vivo eller ex vivo avbildning ger en stor fördel i att undersöka olika cell subtyper på ett geografiskt sätt3 , 16. det är inte förvånande att tillgängligheten av genetiskt modifierade mus stammar där celler är specifikt riktade för att uttrycka olika fluorofotar snabbt ökar. Viktigt är att kombinationen av reporter möss och injektion av antikropps blandningen är ett kraftfullt verktyg för att färga olika cellpopulationer in-vivo i samma orgel4. Dessutom har popularisering av gen redigeringsverktyg som CRISPR/Cas9 tillåtit olika grupper att anpassa sina mus stammar på ett sätt som praktiskt taget alla celltyper kan nu avbildas i sin bona fide plats17. Med den här metoden kan den rumsliga och funktionella relationen mellan olika celltyper bedömas i djupa Detaljer. Men om avbildning av cellförflyttning eller dynamiska händelser in vivo inte är obligatoriska, kan ett mindre komplext experimentellt tillvägagångssätt användas. I detta fall, antikroppar och sonder levereras in vivo, och orgel (eller ett prov) är direkt visualiseras i mikroskopet.
Här beskrev vi ett enkelt protokoll som dispenseras användning av vävnad frysförvaring och kryosektionering som potentiellt kan påverka organ strukturer och tillät uppskattning av immunceller i lymfkörtlar efter in vivo administrering av fluorescerande-märkta antikroppar. Dessa protokoll krävde minimala tekniska och kirurgiska färdigheter och kunde anpassas för att visualisera praktiskt taget alla immunceller på deras ursprungliga plats. Viktigt, vi föreslog att antikroppar ska administreras på ett sätt som de kommer att nå lymfkörtlarna med samma vägar som antigener och celler färdas under ett immunsvar. Genom att injicera fluorescerande antikroppar i den subkutana rymden, var det möjligt att efterlikna alla vävnader och hemodynamiska barriärer som finns i vivo och uppskatta kronologi av antigen skingrande. Förutom denna ansökan, denna metod kan tillämpas och användbar för biodistribution av fluorescerande-märkta läkemedel och cell-inriktning studier av Lysrörs-märkta nanopartiklar.
Det finns dock begränsningar för denna metod. Mängden antikroppar som krävs är högre jämfört med konventionella histologiska metoder; men eftersom konventionell immunofluorescensmikroskopi kräver flera omgångar vävnads beredning och färgning för att optimera tekniken och få bra bilder, kan kostnaden för konventionell mikroskopi potentiellt övervinna kostnaden för den höga antikroppskoncentration som används i vårt protokoll. Nästa, baserat på de kända egenskaperna hos lymfatiska antigen dränering i lymfkörtel9,18, effektiviteten av märkning är sannolikt att snabbt minska med avståndet till den lymfatiska vaskulatur på grund av storleken på märkningen reagens Anställd. Faktum är att de svarta områdena i vissa av bilderna kan bero på dålig vävnads inträngning. Endast 40-100 μm på djupet kan uppnås med konfokal avbildning av LN, och därför kan endast ytliga LN-regioner visualiseras. Ett sätt att åtminstone delvis övervinna denna fråga är att använda fluoroforer med bättre excitation och detektering av mikroskopet. En annan alternativ metod är att använda multiphoton Lasermikroskopi med nästan infraröd excitation våglängd som har varit nyckeln till djup vävnad Imaging och visades att kringgå allvarliga ljusspridning problem observerats med konfokala Single Photon laser mikroskopi19. När det gäller bildceller som färgats av antikroppar som levererades in vivo kan endast antigener som uttrycks på cellytan riktas in. Om antikroppar som används inte har validerats ännu, det blir viktigt att utföra en motsvarande isotypen kontroll färgning att utesluta autofluorescence och validera märkningen. Detta kan utföras på samma djur, dvs cellinriktning antikropps blandning injiceras ipsilaterally och isotyp kontroll mix injiceras contralaterally. Dessutom kan den mängd antikroppar som behövs för att effektivt färga en cell in vivo variera mellan experiment och cellinjer och en alternativ metod för denna begränsning är att använda genetiskt målinriktat fluorescensuttryck.
Sammanfattningsvis föreslår vi ett nytt protokoll för hela lymfkörtel avbildning som upprätthåller vävnadens arkitektoniska integritet, är reproducerbar, lätt att utföra och använda konventionella konfokala Mikroskop. Denna teknik visar hur enkla metoder kan tillåta regelbundna laboratorie strukturer att fungera som Poly-funktionella plattformar som möjliggör stora framsteg i immunsystemet utredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH (R01 AI43458 till H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
