Summary
Denne protokol beskriver en teknik til at afbilde forskellige cellepopulationer i dræne lymfeknuder uden ændringer i organ strukturen.
Abstract
Lymfeknuder (LNs) er organer spredt i kroppen, hvor den medfødte immunrespons kan forbinde med den adaptive immunitet. Faktisk er LNS strategisk indskudt i vejen for lymfe skibene, så intim kontakt af vævs antigener med alle residente immunceller i LN. Således, forstå den cellulære sammensætning, fordeling, placering og interaktion ved hjælp af ex vivo hele LN Imaging vil tilføje til viden om, hvordan kroppen koordinerer lokale og systemiske immunrespons. Denne protokol viser en ex vivo-billedbehandlings strategi efter en in vivo-administration af fluorescerende-mærkede antistoffer, der muliggør en meget reproducerbar og let-at-udføre metodologi ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskoper og lager reagenser. Ved subkutan injektion af antistoffer er det muligt at mærke forskellige cellepopulationer i dræne LNs uden at påvirke vævsstrukturer, der potentielt kan blive beskadiget af en konventionel immunofluorescens mikroskopi teknik.
Introduction
Lymfeknuder (LNs) er ovoid-formede organer bredt til stede i hele kroppen med den afgørende funktion af bridging den medfødte og adaptive immunrespons. LNs filtrerer lymfeknuder for at identificere fremmede partikler og kræftceller til at montere en immunrespons mod dem1. Antigen præsenterer celler (APCs), T-celler og B-celler arbejde sammen for at generere antigen-specifikke antistoffer (humoral immunitet) og cytotoksiske lymfocytter (cellulære immunitet) for at eliminere fremmede partikler og kræftceller2. Således, forstå dynamikken i immuncellerne til stede i lymfesystemet vil have vigtige konsekvenser for vaccine udvikling og kræft immunterapi.
Fremkomsten af kraftfulde mikroskoper-herunder nye konfokale og super resolution mikroskoper-har tilladt en ekstraordinær avancement i forståelsen af, hvordan forskellige immuncelle populationer opfører sig i deres oprindelige miljø3. Det er nu muligt at afbilde flere samtidige celle-undertyper ved hjælp af en kombination af sonder med genetisk modificerede mus, som udtrykker fluorescerende proteiner under kontrol af specifikke mål4,5. Faktisk, høje dimensionelle teknikker, herunder massecytometri og multi-parametrisk flow analyse har været afgørende for at udvide vores viden om forskellige immuncelle opdeling og funktionalitet i sundhed og sygdom6, 7. men for at forberede prøverne til disse teknikker, væv har brug for fordøjelsen og celler adskilles fra deres naturlige miljø, der skal analyseres i celle suspensioner. For at overgå disse begrænsninger og tillade en bedre oversættelse i biologi, er målet med den foreslåede protokol at anvende en enkel metode til at afbilde ex vivo hele lymfeknuder ved hjælp af lager konfokale mikroskoper med fordel for forbedret hastighed, vævs og cellernes levedygtighed i forhold til den konventionelle immunofluorescens farvning. Ved at bruge denne fremgangsmåde, vi var i stand til at vise, at mus mangelfuld for γδ T celler, en under type af T lymfocyt involveret i vært tidligt forsvar mod patogener4, har kompromitteret follikler og T celle zoner i forhold til vildtype mus. Disse fund gjorde det muligt for os at forfølge en undersøgelse, hvor vi påviste, at γδ T-celler spiller en afgørende rolle i homøostase af lymfoide organer og humorale immunrespons4. Endvidere, denne protokol giver en fysiologisk vej for sonder og antistoffer til at nå lymfeknude, da de administreres subkutant og sprede gennem vævs lymfe kredsløb, bygger på tidligere rapporter, der anvendes in situ mærkning med antistoffer til at visualisere lymfe-associerede strukturer8,9, avlsmateriale Center Dynamics10,11,12, og mål let tilgængelige for blodgennemstrømningen13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev godkendt af den stående Komité for dyr på Harvard Medical School og Brigham and Women's Hospital, protokol 2016N000230.
1. mus, der anvendes til eksperimentet
- Brug 8-ugers gamle mandlige og hunmus på B6-baggrund til administration af antistof blandingen.
- Brug CX3CR1Gfp/WTCCR2RFP/WT -mus til at afgøre, om ex vivo-hele LN-billeddannelse også kan anvendes på reporter-mus uden at administrere antistofmix samt undersøge tilstedeværelsen af mononukleale celler, herunder antigen, der præsenterer celler og phagocytter, og deres fordeling i LN.
Bemærk: CX3CR1gfp/WTCCR2RFP/WT reporter mus har henholdsvis grønt fluorescerende protein (gfp) og rødt fluorescerende protein (RFP) under kontrol af CX3CR1 og CCR2 promotorer. Reporter-mus kan bruges med eller uden injektion af antistof blandingen. Se venligst reference4 for antistof-mix-injektion i en reporter-mus. Fortsæt til kirurgi, hvis ingen antistof vil blive injiceret.
2. præparat og injektion af antistof blanding
Bemærk: Udfør disse trin på mus, der er beskrevet i trin 1,1.
- Fortyndet 1:10 af Brilliant violet (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 af strålende blå (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) og 1:20 af phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) i PBS med den passende endelige volumen til injektion i det indre låret (til billede inguinal) eller i Paw pad (til billede popliteal) lymfeknuder.
Bemærk: brug som isotyper: BV421 Mouse IgG2b, k isotype Control (R35-38; 0,2 mg/mL); PE rotte IgG2a, κ isotype kontrol (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 rotte IgG2a, κ isotype kontrol (R35-95; 0,2 mg/mL). Hvis du ændrer farvnings antistoffet, skal du bruge den korrekte isotype. - Til billede af lyske LN indsprøjtes 100 μl af antistof blandingen subkutant i det indre lår (figur 1a). Alternativt indsprøjtes 50 μL subkutant af antistof blanding i pote blokken til billedet popliteale ln (figur 2a). Brug sarte 1 mL insulin sprøjter, (insulin U-100) med nål af størrelse 0,30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 tommer).
Bemærk: Sørg for, at injektionen for inginal LN-farvning er subkutan og ikke intramuskulær (i.m.), da antistofmix ikke vil blive tømt korrekt, hvis der udføres i.m.-administration. - Må ikke bedøve dyr før antistof mix injektion.
- Vent i mindst 3 timer (inguinal dLN) og 12 timer (popliteal dLN) efter injektion for at fjerne organerne.
- Hvis LN celle mærkning ikke er helt observeret ved hjælp af store polymer fluorescerende farvestoffer såsom strålende violet eller strålende blå, bruge mindre fluorophorer, herunder fluorescein isothiocyanat (FITC), PE og allophycocyanin (APC) som et alternativ.
3. kirurgi procedure for at fjerne den lyske dræning lymfeknude
- Euthanize mus ved hjælp af CO2 kvælning efterfulgt af livmoderhals dislokation.
- Immobilize mus på akryl scenen med tape og anvende mineralolie med en vatpind til abdominal huden for at forhindre pels aflejring omkring snittet (figur 1b). Fjernelse af pels er ikke nødvendig.
- Udfør en mellemlinje indsnit ved hjælp af mikrokirurgi buet saks (11,5 cm) og mikrokirurgi buede pincet (12,5 cm) i maven fra pubis til xiphoid proces (figur 1c).
- Dissociere den abdominale muskulatur fra huden (figur 1d).
- Lav horisontale hudindsnit i toppen og bunden af den lodrette indsnit linje for at oprette hudflapper på side af interesse (i henhold til den side af antistof mix injektion) og klap huden for at visualisere lymfeknude (figur 1E).
- Tape hudklappen på akryl pladen (figur 1f).
- Fjern den lyske drænende lymfeknude ved hjælp af mikrokirurgi buede pincet (figur 1f). Lymfeknude vil fremstå som en translucid, normalt bilobulær, sfære under huden.
4. kirurgi procedure for at fjerne den popliteale dræning lymfeknude
- Euthanize mus ved hjælp af CO2 kvælning efterfulgt af livmoderhals dislokation.
- Immobilize mus ved en udsat position på akryl Stage med tape og anvende mineralolie med en vatpind i læggen og knæet (figur 2a-D).
- Udfør en mellemlinje indsnit i læggen fra hælen til knæet (figur 2E, F).
- Du dissocierer kalve muskulaturen fra huden (figur 2F, G).
- Udsæt popliteale fossa (figur 2g). Popliteale lymfeknude vil fremstå som en gennemsigtigt sfære i popliteale fossa.
- Fjern den popliteale lymfeknude ved hjælp af mikrokirurgi buede pincet (figur 2g).
- Alternativt, drej musen over på liggende position, og nærme sig den popliteale fossa mellem biceps rectus og semitendinosus for popliteale LN fjernelse ved at udføre en midterlinje indsnit i læggen fra hælen til knæet efterfulgt af dissociation af læggen muskulatur fra huden.
Bemærk: popliteal fossa er en lavvandet depression placeret på bagsiden af knæleddet. Åben omhyggeligt for at se den popliteale lymfeknude.
5. klargøring af lymfeknude
- Placer hele organet i en kulturret med glasbund (35 mm x 10 mm) og fjern det fedt, der omgiver organet ved hjælp af mikrokirurgi buede pincet (figur 1G-I og figur 2H).
- Centraliserer orgel i midten af skålen (figur 1J og figur 2H).
- Dække orgel med et fragment af sarte opgave VISKERE og holde det gennemblødt med stuetemperatur saltvand 0,9% eller fosfat buffer opløsning (figur 1K-M og figur 2H).
Bemærk: det er ikke nødvendigt at vaske lymfeknuder efter fjernelse eller at udføre lymfeknude ekstraktion i hætten.
6. ex vivo-Konfokal mikroskopi (billeddannelse)
- Placer Petri skålen i det inverterede confokale mikroskop slot (figur 1N og figur 2H).
- Billede LNs under et Konfokal mikroskop (figur 1o og figur 2H).
- For det første, opnå den korrekte fokus ved hjælp af det konventionelle lys af konfokale mikroskop med 4X eller 10x objektiv. Skift derefter fra lysfunktionen til laser tilstanden.
Bemærk: Hvis Konfokal mikroskop ikke indeholder et 4X-mål, kan fokus opnås perfekt ved hjælp af 10x-målsætningen. - Juster laser strømmen, offset og Gain ved hjælp af en isotype-plettet, ikke-plettet eller ikke-fluorescerende prøve (tabel 1) for at fjerne Auto luorescens og uspecifik farvning fra fluorescerende-mærkede antistoffer som dem, der anvendes i billederne viste i denne manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 og PE anti-F4/80).
- Juster Z og XY positioner, ved hjælp af henholdsvis micrometric og Chariot, på det område af interesse i lymfeknude.
- Erhverve billeder under 4X, 10x og 20x mål med fokus på LN struktur og cellulære fordeling. Brug 1024 x 1024-pixel definition.
Bemærk: Hent mindst fem billeder i forskellige felter pr. mål pr. dyr. - Analysere billeder ved hjælp af en billedsoftware til at adskille kanaler, tilføje skala og farver af interesse, og at rekonstruere 3D-visning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette manuskript viser teknikker til at fjerne lyske og popliteale lymfeknuder uden at beskadige deres struktur efter injektion af fluorescerende-mærkede antistoffer til at plette specifikke cellepopulationer i disse organer (figur 1 og figur 2 ).
Den kraftfulde kombination af immunolabeling af LN celler med BV421 anti-CD4 og BB515 anti-CD19 og konfokale Imaging analyse defineret lokalisering af T-celler (CD4 +) og B-celler (CD19 +) i lyske og popliteale LNS. I begge organer var B-celle follikler omgivet af T-cellepopulationer (figur 3, figur 4 og video 1), et kendetegn for ln-strukturen1. For at udelukke muligheden for, at fagocytter foring af lymfe bider kunne fange de injicerede fluorescerende antistoffer og resultere i ikke-specifik mærkning af celle markører, var PE anti-F4/80 inkluderet i antistof blandingen. Som vist i figur 5internaliserer phagocytter ikke injicerede antistoffer, hvilket indikerer, at B-og T-celle farvning var specifik. Desuden, video 1 viser, at T og B celle farvning ikke overlapper, bekræfter farvning specificitet.
For at undersøge den rumlige lokalisering af fagocytiske mononukleale celler i LN, lyske og popliteale LNS fra CX3CR1gfp/+ CCR2RFP/+ blev imaged. Mononukleære celler blev fundet i hele lyske LN, herunder subkapsulær sinus. Størstedelen af disse celler var CX3CR1Gfp/+efterfulgt af CCR2RFP/+ og dobbelte positive celler (gul) (figur 6A-F). Det samme mønster af celle fordeling og celle fænotyper blev observeret i popliteale ln (figur 7A-i). Både lyske og popliteale LNS viste sorte regioner uden CX3CR1gfp/+ CCR2RFP/+, som er besat af lymfocytter. Desuden var CX3CR1 + og CCR2 + celler knappe i det indre område af LNS og koncentreret i det ydre område, hvilket indikerer, at disse celler primært indtager LN subkapsulær katarakt sinus (figur 6G-I og figur 7J-L). Således kan den foreslåede protokol klart definere store cellepopulationer til stede i lymfeknuder.
Figur 1: forberedelse af Inginal lymfeknude.
(A) subkutan injektion af FACS-antistof Master Mix i det indre lår. (B) 3 h efter injektionen, aflive musen, immobilisere musen på en akrylplade med tape og anvende mineralolie til abdominal hud for at forhindre pels aflejring omkring incisionen. (C) udføre en mellemlinje indsnit i maven fra pubis til xiphoid proces. (D) dissocierer mave muskulaturen fra huden og gør en hudklap. (E) tape hudklappen på akryl pladen. F) fjerne den lyske lymfeknude ved hjælp af en mikrokirurgi buede pincet. (G-H) Placer orgelet i en kulturret (G), og fjern det fedt, der omgiver organet (H). I) illustrativt billede, der viser organ størrelsen efter rengøringen. J-M) centraliserer orgel i midten af en petriskål (j), dække organet med et stykke delikat opgave VISKERE (K) og holde gennemblødt med varm 0,9% saltvand eller 1x PBS (L, M). (N) Placer Petri skålen i mikroskop åbningen. O) scanne organet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forberedelse af popliteal lymfeknude.
(A, B) Subkutan injektion af FACS antistof Master Mix i Paw pad. (C, D) 3 h efter injektionen, aflive musen, immobilisere musen på en akrylplade med tape (c) og anvende mineralolie til abdominal hud for at forhindre pels aflejring omkring incisionen (D). (E) udføre en mellemlinje indsnit i læggen fra hælen til knæet. F) udsætter popliteale fossa. G) Fjern den popliteale lymfeknude ved hjælp af mikrokirurgi-buede pincet. H) Placer orgelet i en petriskål, og fjern det fedt, der omgiver orglet, centraliserer orgelet i midten af Petri skålen, dæk det med et stykke delikat opgave VISKERE og hold det i blød med varmt saltvand 0,9% eller 1x PBS. Placer Petri skålen i mikroskop åbningen, og Scan orgelet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative konfokale mikroskopi billeder af hele lyskelymfeknuder af ikke-immuniserede naive mus.
(A-C) LN B og T celler blev plettet ved hjælp af CD4 (grøn; T-celler) og CD19 (rød; B-celler); Scale bar = 50 μm. (D-I) Forstærkning af specifikt område med 10x mål; Scale bar = 30 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative Konfokal mikroskopi billeder af hele popliteale lymfeknuder af ikke-immuniserede naive mus.
(A-C) LN B og T celler blev plettet ved hjælp af CD4 (grøn; T-celler) og CD19 (rød; B-celler); Scale bar = 60 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ Konfokal mikroskopi billeder af hele lyske lymfeknude af ikke-immuniserede naive mus, der viser phagocytter.
(A-C) LN B og fagocytiske celler blev plettet ved hjælp af CD19 (grøn; B-celler) og F4/80 (blå; phagocytter); skala bar = 100 μm; (D-F) LN T og fagocytiske celler blev plettet ved hjælp af CD3 (grøn; T-celler) og F4/80 (hvide; phagocytter); Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: konfokale mikroskopi billeder af hele lyskelymfeknuder af genetisk modificerede CX3CR1 Gfp/+ CCR2 RFP/+ mus uden antistof-Master Mix-injektion.
(A-C) LN celle fordeling blev evalueret med CX3CR1 (grøn) og CCR2 (rød); Scale bar = 100 μm. (D-F) Forstærkning af specifikt område med 20x mål; Scale bar = 50 μm. (G-I) LN celle fordeling i lymfeknude sinus gulvet; Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Konfokal mikroskopi billeder af hele popliteale lymfeknuder af genetisk modificerede CX3CR1 Gfp/+ CCR2 RFP/+ mus uden antistof-Master Mix-injektion.
(A-C) LN celle fordeling blev evalueret med CX3CR1 (grøn) og CCR2 (rød); Scale bar = 200 μm. (D-F) Forstærkning af hele orgel med 10x mål; Scale bar = 100 μm. (G-I) Forstærkning af specifikt område med 20x mål; Scale bar = 50 μm. (J-L) LN celle fordeling i lymfeknude sinus gulvet; Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: specificiteten af T-og B-celle farvning (Højreklik for at downloade).
| Laser | Laser effekt | Få | Forskydning | Pinhole |
| 406nm | 20 | 65 | -5 | 60 μm |
| 488nm | 25 | 50 | -5 | 60 μm |
| 561nm | 25 | 65 | -10 | 60 μm |
Tabel 1: indstillinger for billed anskaffelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen af billeddannelse med andre teknikker, herunder molekylær biologi og højdimensionel immunophenotyping, har forbedret vores evne til at undersøge immunceller i deres oprindelige kontekst. Mens andre tilgange kan kræve vævs fordøjelse og celle isolation – hvilket kan føre til tab af vævs integritet – giver brugen af in vivo-eller ex vivo-billeddannelse en stor fordel i at undersøge forskellige celle undertyper på en geografisk måde3 , 16. det er ikke overraskende, at tilgængeligheden af genetisk modificerede muse stammer, hvor cellerne specifikt er rettet mod at udtrykke forskellige fluorophorer, er hastigt stigende. Vigtigere er, at kombinationen af reporter mus og injektion af antistof mix er et kraftfuldt værktøj til at plette forskellige cellepopulationer in vivo i samme organ4. Desuden, populariseringen af gen redigeringsværktøjer som crispr/Cas9 har tilladt forskellige grupper til at tilpasse deres muse stammer på en måde, at stort set enhver celletype kan nu afbildet i deres bona fide placering17. Ved hjælp af denne fremgangsmåde kan det rumlige og funktionelle forhold mellem forskellige celletyper vurderes i dybe detaljer. Men hvis billeddannelse af celle bevægelsen eller dynamiske hændelser in vivo ikke er obligatorisk, kan der anvendes en mindre kompleks eksperimentel tilgang. I dette tilfælde leveres antistoffer og sonder in vivo, og organet (eller en prøve) er direkte visualiseret i mikroskopet.
Her beskrev vi en ligetil protokol, der dispenserede brugen af vævs Kryopreservation og kryosectioning, der potentielt kan påvirke organ strukturer og tillod opskrivning af immunceller i lymfeknuder efter in vivo administration af fluorescerende-mærkede antistoffer. Disse protokoller krævede minimal tekniske og kirurgiske færdigheder og kunne tilpasses til at visualisere stort set alle immunceller i deres oprindelige placering. Vigtigere, vi foreslog, at antistoffer skal administreres på en måde, at de vil nå lymfeknuder ved hjælp af de samme veje, som antigener og celler rejser under en immunrespons. Ved indsprøjtning af fluorescerende antistoffer i det subkutane rum, var det muligt at efterligne alle væv og hæodynamiske barrierer fundet in vivo og anslå kronologien af antigen afledning. Ud over denne ansøgning, denne metode kunne anvendes og nyttige for Biodistribution af florescent-mærket narkotika og celle-målretning undersøgelser af fluorescerende-mærkede nanopartikler.
Der er dog begrænsninger for denne metode. Mængden af antistof, der kræves, er højere sammenlignet med konventionelle histologiske metoder; men da konventionel immunofluorescens mikroskopi kræver flere runder af vævs forberedelse og farvning for at optimere teknikken og opnå gode billeder, kan omkostningerne ved konventionel mikroskopi potentielt overvinde omkostningerne ved den høje antistof koncentration, som anvendes i vores protokol. Dernæst baseret på de kendte egenskaber af lymfe antigen dræning i lymfeknude9,18, effektiviteten af mærkning sandsynligvis hurtigt falde med afstanden til lymfe Vaskulaturen på grund af størrelsen af mærkningen reagens Ansat. Faktisk, de sorte områder i nogle af billederne kan skyldes dårlig væv penetration. Kun 40-100 μm i dybden kan opnås med confokale Imaging af LN, og dermed kun overfladiske LN regioner kan visualiseres. En måde at i det mindste delvist overvinde dette problem er at bruge fluorophores med bedre excitation og påvisning af mikroskopet. En anden alternativ tilgang er at bruge multiphoton laser mikroskopi med nær-infrarød excitation bølgelængde, der har været nøglen til dybe væv billeddannelse og blev vist sig at omgå alvorlige lys spredning problemer observeret med confokale enkelt photon laser mikroskopi19. I tilfælde af billedbehandlings celler, der er plettet af antistoffer, som blev leveret in vivo, kan kun antigener, der udtrykkes på cellens overflade, målrettes. Hvis de anvendte antistoffer endnu ikke er valideret, bliver det afgørende at udføre en tilsvarende isotype kontrol farvning for at udelukke Auto luorescens og validere mærkningen. Dette kan udføres i samme dyr, dvs celle målretning antistof mix injiceres ipsilaterally og isotype Control mix injiceres kontra til. Desuden kan mængden af antistof, der er nødvendigt for effektivt at plette en celle in vivo, variere mellem eksperimenter og cellelinjer, og en alternativ tilgang til denne begrænsning er at anvende genetisk målrettet fluorescens udtryk.
Afslutningsvis foreslår vi en ny protokol for hele lymfeknude Imaging, der opretholder vævs arkitektoniske integritet, er reproducerbar, let at udføre og bruge konventionelle confokale mikroskoper. Denne teknik viser, hvordan enkle metoder kan tillade regelmæssige laboratorie strukturer til at arbejde som poly-funktionelle platforme, der muliggør store fremskridt i immunsystemet undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH (R01 AI43458 til H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
