Summary
이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.
Abstract
림프절 (LN)은 타고난 면역 반응이 적응 면역과 연결할 수있는 신체 내에서 퍼지는 기관입니다. 사실, LN은 전략적으로 림프관의 경로에 개입되어 LN의 모든 상주 면역 세포와 조직 항원과 친밀한 접촉을 허용합니다. 따라서, 전 생체 내 LN 이미징을 사용하여 세포 조성, 분포, 위치 및 상호 작용을 이해하는 것은 신체가 국소 및 전신 면역 반응을 어떻게 조정시키는지에 대한 지식을 추가할 것이다. 이 프로토콜은 기존의 공초점 현미경 및 재고 시약을 사용하여 매우 재현 가능하고 수행하기 쉬운 방법론을 허용하는 형광 표지 항체의 생체 내 투여 에 따른 생체 내 이미징 전략을 보여줍니다. 항체의 피하 주입을 통해, 기존의 면역 형광 현미경 기술에 의해 잠재적으로 손상될 수 있는 조직 구조에 영향을 미치지 않고 배수 LN에 있는 다른 세포 인구를 표지하는 것이 가능합니다.
Introduction
림프절 (LN)은 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 기능을 가진 몸 전체에 널리 존재하는 난형 형 기관입니다. LN은 이물질과 암세포를 식별하기 위해 림프를 걸루어면역 반응을 장착한다 1. 항원 제시 세포(APC), T 세포 및 B 세포는 항원 특이적 항체(체액성 면역) 및 세포독성 림프구(cellular immunity)를생성하여 이물질 및 암세포를 제거하기 위해 함께 작용한다 2. 따라서, 림프계에 존재하는 면역 세포의 역학을 이해하는 것은 백신 개발 및 암 면역 요법에 중요한 영향을 미칠 것이다.
새로운 공초점 및 초고해상도 현미경을 포함한 강력한 현미경의 출현은 다른 면역 세포 집단이 그들의 모국환경에서어떻게 행동하는지 이해하는 특별한 발전을 허용했습니다 3. 이제 특정 표적4,5의통제하에 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스와 프로브의 조합을 사용하여 여러 동시 세포 아류형을 영상화할 수 있다. 실제로, 질량 세포 분석 및 다중 파라메트릭 흐름 분석을 포함한 고차원 기술은 건강과 질병의 다양한 면역 세포 구획화 및 기능에 대한 지식을 확장하는 데 매우 중요했습니다6, 7. 그러나, 이러한 기술에 대한 샘플을 준비하기 위해, 조직은 소화가 필요하고 세포는 세포 현탁액에서 분석될 수 있도록 천연 밀리외에서 분리된다. 이러한 한계를 능가하고 생물학에서 더 나은 번역을 허용하기 위해, 여기에 제안 된 프로토콜의 목표는 개선 된 속도, 조직의 이점으로 스톡 공초점 현미경을 사용하여 생체 전체 림프절을 이미지화하는 간단한 방법론을 적용하는 것입니다. 기존의 면역형광 염색에 비해 구조 보존 및 세포 생존능력. 이 접근법을 사용하여, 우리는 γδ T 세포에 대한 결핍 마우스가 병원체에 대하여 호스트 초기 방어에 관여하는T 림프구의 특수형 4, 야생 형 마우스에 비해 여포 및 T 세포 영역을 손상했다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 이 사실 인정은 우리가 γδ T 세포가 림프기관 및 체액 성 면역 반응의 항상성에 있는 중요한역할을 한다는 것을 설명한 연구 결과를 추구하는 것을 허용했습니다 4. 또한, 이 프로토콜은 프로브와 항체가 림프절에 도달하기 위한 생리적 경로를 제공하며, 피하 투여되고 조직 림프순환을 통해 소멸되기 때문에, situ labeling에 사용된 이전 보고서에 근거하여 림프 관련 구조를 시각화하는 항체8,9,발아 중심 역학10,11,12,혈류에 쉽게 접근할 수 있는 표적13 ,14,15.
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Protocol
이 프로토콜은 하버드 의과 대학과 브리검 여성 병원의 동물 상임위원회에 의해 승인되었다, 프로토콜 2016N000230.
1. 실험에 사용되는 마우스
- 항체 혼합을 투여하기 위한 B6 배경에 8주 된 수컷 및 암컷 마우스를 사용한다.
- CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT 마우스를 사용하여 항체 혼합을 투여하지 않고 리포터 마우스에 전 생체 전체 LN 이미징을 적용할 수 있는지 여부를 결정하고 항원 제시를 포함한 단핵 세포의 존재를 조사할 수 있습니다. 세포와 식세포, 그리고 LN에서의 분포.
참고: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT 리포터 마우스는 각각 CX3CR1 및 CCR2 프로모터의 제어 하에 삽입된 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)을 가지고 있습니다. 리포터 마우스는 항체 혼합물의 주입 유무에 관계없이 사용할 수 있다. 리포터 마우스에서 항체 혼합 주입에 대한 참조4를 참조하십시오. 항체가 주입되지 않을 경우 수술을 진행하십시오.
2. 항체 혼합 준비 및 주입
참고: 1.1단계에서 설명된 마우스에서 이러한 단계를 수행합니다.
- 1:10 의 화려한 보라색 (BV) 421 안티 CD4 (GK1.5; 0.2 mg/mL), 1:10 브릴리언트 블루(BB) 515 안티 CD19(1D3; 0.2 mg/mL) 및 1:20 의 피코에리트린(PE) 안티-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) PBS내 허벅지에 주입할 수 있는 적절한 최종 부피(T45-2342; 0.2 mg/mL) 이미지 inguinal) 또는 발 패드에 (이미지 popliteal) 림프에.
참고 : 아이소 타입으로 사용 : BV421 마우스 IgG2b, k 아이소 타입 제어 (R35-38; 0.2 mg / mL); PE 쥐 IgG2a, θ 이소형 제어 (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 쥐 IgG2a, θ 이소타입 제어 (R35-95; 0.2 mg/mL). 염색 항체를 변경하는 경우 올바른 등방형을 사용하십시오. - 인과 LN을 이미지화하기 위해, 100 μL의 항체 혼합물을 내부 허벅지 내로 피하주사한다(도1A). 대안적으로, 50 μL의 피하 혼합물을 발 패드내로 주입하여 포퓰리즘LN(도 2A)을 이미지화한다. 크기 0.30 mm × 13mm (30 게이지 × 1/2 인치)의 바늘로 섬세한 1 mL 인슐린 주사기 (인슐린 U-100)를 사용하십시오.
참고 : 인큐니얼 LN 염색을위한 주사가 피하이고 근육 내 (i.m.)가 아닌지 확인하십시오. - 항체 혼합 주입 전에 동물을 마취시키지 마십시오.
- 최소 3 시간 (inguinal dLN) 및 12 h (popliteal dLN) 포스트 주사를 기다려 장기를 제거합니다.
- LN 세포 표지가 화려한 보라색 또는 화려한 청색과 같은 큰 폴리머 형광 염료를 사용하여 완전히 관찰되지 않는 경우, 대안으로 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), PE 및 알로피코시아닌 (APC)을 포함한 더 작은 형광을 사용하십시오.
3. 인구 배수 림프절을 제거하는 수술 절차
- CO2 질식을 이용한 안락사 마우스와 자궁 경부 탈구.
- 접착제 테이프로 아크릴 단계에 마우스를 고정하고 절개 주위의 모피 침착을 방지하기 위해 복부 피부에 면봉으로 미네랄오일을 적용합니다 (그림 1B). 모피 제거는 필요하지 않습니다.
- 치골에서 xiphoid 과정까지 복부에 미세 수술 곡선 가위 (11.5 cm) 및 미세 수술 곡선 집게 (12.5 cm)를 사용하여중간 선 절개를 수행합니다 (그림 1C).
- 피부에서 복부 근육을 해리 (그림1D).
- 수직 절개선의 위쪽과 아래쪽에 수평 피부 절개를 만들어 관심 있는 측면에 피부 플랩을 만들고(항체 혼합 주입의 측면에 따라) 피부를 플랩하여 림프절을 시각화합니다(그림1E).
- 아크릴 플레이트에 피부 플랩테이프 (그림1F).
- 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 환각 배수 림프절을 제거 (그림1F). 림프절은 투명, 일반적으로 담즙, 피부 아래 구로 나타납니다.
4. 수술 절차는 popliteal 배수 림프절을 제거하는
- CO2 질식을 이용한 안락사 마우스와 자궁 경부 탈구.
- 접착제 테이프로 아크릴 단계에 경향이 위치에 마우스를 고정하고 종아리와 무릎에 면봉으로 미네랄 오일을 적용 (그림2A-D).
- 발 뒤꿈치에서 무릎까지 종아리에 중간 선 절개를 수행합니다 (그림2E,F).
- 피부에서 종아리 근육을 해리 (그림2F,G).
- 포퓰럴 포사(그림2G)를노출한다. 포물성 림프절은 포물엽 fossa에서 반투명 구체로 나타납니다.
- 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 포피라이트 림프절을 제거 (그림 2G).
- 또는, 척추 위치에 마우스를 뒤집어, 이두근 femoris와 popliteal LN 제거를위한 반텐디노스 사이의 popliteal fossa에 접근 발 뒤꿈치에서 무릎에 종아리에 중간 절개를 수행한 후 종아리의 해리에 의해 피부에서 근육.
참고 : Popliteal fossa는 무릎 관절의 뒤쪽에있는 얕은 우울증입니다. 조심스럽게 열어 서 포피 라이트 림프절을 볼 수 있습니다.
5. 림프절 준비
- 전체 장기를 유리 바닥(35 mm x 10 mm)으로 배양 접시에 넣고 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 장기를 둘러싸는 지방을 제거합니다(그림1G-I 및 그림 2H).
- 접시 중간에 오르간을 중앙 집중화합니다(그림1J 및 그림 2H).
- 섬세한 작업 와이퍼의 조각으로 기관을 덮고 실온 식염수 0.9 % 또는 인산완충액으로 담근 상태로 유지하십시오 (그림1K-M 및 그림 2H).
참고 : 제거 후 림프절을 씻거나 후드에서 림프절 추출을 수행 할 필요가 없습니다.
6. 생체 내 공초점 현미경 검사법 (이미징)
- 페트리 접시를 역공초점 현미경 슬롯에 위치(그림1N 및 도 2H).
- 공초점 현미경 하에서 의 이미지 LN(그림1O 및 도 2H).
- 먼저, 공초점 현미경의 종래의 빛을 4x 또는 10x 객점으로 이용하여 정확한 초점을 얻는다. 그런 다음 광 기능에서 레이저 모드로 변경합니다.
참고: 공초점 현미경에 4x 목표가 없는 경우 10x 대물렌즈를 사용하여 포커스를 완벽하게 얻을 수 있습니다. - 이소타입 염색, 비염색 또는 비형광 시료를 이용하여 레이저 파워, 오프셋 및이득을 조절하여 자가형광및 비특이적 염색을 제거하는 등 이미지에 사용된 항체와 같은 형광 표지 항체로부터의 비특이적 염색을 이것으로 나타났다. 원고 (BV-421 안티 CD4, BB515 안티 CD19 및 PE 안티 F4 / 80).
- 림프절의 관심 영역에서 각각 마이크로 메트릭 및 전차를 사용하여 Z 및 XY 위치를 조정합니다.
- LN 구조 및 셀룰러 분포에 초점을 맞춘 4x, 10x 및 20x 목표 에서 이미지를 수집합니다. 1024 x 1024 픽셀 정의를 사용합니다.
참고: 동물당 목표당 다른 필드에서 최소 5개의 이미지를 획득합니다. - 이미지 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 채널을 분리하고, 관심 있는 배율과 색상을 추가하고, 3D 뷰를 재구성합니다.
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Representative Results
이 원고는 이러한 장기의 특정 세포 집단을 염색하기 위해 형광 표지 된 항체를 주입 한 후 구조를 손상시키지 않고 인과 성 림프절을 제거하는 기술을 보여줍니다 (그림1 및 그림 2 ).
LN 세포의 면역 라벨링과 BV421 항 CD4 및 BB515 항 CD19 및 공초점 이미징 분석의 강력한 조합은 인과 및 포퓰리터 LN에서 T 세포 (CD4+) 및 B 세포 (CD19+)의 국소화를 정의했습니다. 두 기관 모두에서, B 세포 여포는 T세포 집단에 의해 포위되었다 (도 3, 도 4 및 비디오1), LN 구조의 특징1. 림프부 내막의 식세포가 주입된 형광 항체를 포착하고 세포 마커의 비특이적 라벨링을 초래할 수 있다는 가능성을 배제하기 위해, PE 항-F4/80은 항체 혼합물에 포함되었다. 도5에 도시된 바와 같이, 식세포는 주입된 항체를 내계화하지 않았고, B 및 T 세포 염색이 특이적임을 나타낸다. 더욱이,비디오 1은 T 및 B 세포 염색이 겹치지 않았음을 나타내며, 염색 특이성을 확인한다.
LN에서 식세포 단핵 세포의 공간 국소화를 조사하기 위해 CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+에서 의 인과 및 포플리탈 LN이 이미지화되었다. 단핵 세포는 침하 부비동을 포함하는 인추니얼 LN 전반에 걸쳐 발견되었다. 이 세포의 대다수는 CX3CR1GFP/+,CCR2RFP/+ 및 이중 양성 세포 (노란색) (그림6A-F)에선행되었습니다. 세포 분포 및 세포 표현형의 동일한 패턴은 popliteal LN에서 관찰되었다(도7A-I). 음혈성 및 포피럴 L은 모두 림프구가 차지하는 CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+가없는 검은 색 영역을 보였습니다. 더욱이, CX3CR1+ 및 CCR2+ 세포는 LN의 내부 영역에서 부족하고 외부 영역에 집중되었고, 이들 세포가 주로 LN 하방 부비동을 차지한다는 것을 나타낸다(그림6G-I 및 도 7J-L). 따라서, 제안된 프로토콜은 림프절에 존재하는 주요 세포 집단을 명확하게 정의할 수 있다.
그림 1: 인기닌 림프절 제제.
(A) FACS 항체 마스터 믹스를 허벅지 안쪽에 피하 주사한다. (B) 주사 후 3시간 동안 마우스를 안락사시키고, 접착제 테이프로 아크릴 판상에 마우스를 고정시키고, 절개 주위의 털 침착을 방지하기 위해 복부 피부에 미네랄 오일을 도포한다. (C) 치골에서 xiphoid 과정에 복부에 중간 선 절개를 수행합니다. (D) 피부에서 복부 근육을 해리하고 피부 플랩을합니다. (E) 아크릴 플레이트에 피부 플랩을 테이프로 바삭합니다. (F) 미세 수술 곡면 집게를 사용하여 인큐니얼 림프절을 제거합니다. (G-H) 장기를 배양 접시(G)에 놓고 장기 (H)를 둘러싸는 지방을 제거합니다. (I) 청소 후 장기 크기를 보여주는 그림. ) J-M) 페트리 접시 (J)의 중간에오르간을 중앙 집중화하고, 섬세한 작업 와이퍼 (K)로 오르간을 덮고 따뜻한 0.9 % 식염수 또는 1 x PBS (L,M)로담가 둡니다. (N) 페트리 접시를 현미경 슬롯에 놓습니다. (O) 장기를 스캔합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포피라이트 림프절 제제.
(A,B) FACS 항체 마스터 믹스의 피하 주사를 발 패드내로 주입한다. (C,D) 3시간 주사 후, 마우스를 안락사시키고, 접착제 테이프(C)로 아크릴판에 마우스를 고정시키고, 절개 주위의 털 침전을 방지하기 위해 복부 피부에 미네랄 오일을 도포한다(D). (E) 발 뒤꿈치에서 무릎까지 종아리의 중간 절개를 수행합니다. (F) 포플리탈 포사(popliteal fossa)를 노출한다. (G) 미세 외과 곡면 집게를 사용하여 포물성 림프절을 제거합니다. (H) 장기를 페트리 접시에 놓고 장기를 둘러싸는 지방을 제거하고 페트리 접시 중간에 오르간을 중앙 집중화하고, 섬세한 작업 와이퍼로 오르간을 덮고 따뜻한 식염수 0.9 % 또는 1 x PBS로 담근다. 현미경 슬롯에 페트리 접시를 배치하고 장기를 스캔합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 비면역화된 순진한 마우스의 전체 인과 림프절의 대표적인 공초점 현미경 이미지.
(A-C) LN B 및 T 세포는 CD4를 사용하여 염색하였다(녹색; T 세포) 및 CD19(적색; B 세포); 스케일 바 = 50 μm. (D-I) 10배 객관적으로 특정 영역의 증폭; 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역되지 않은 순진한 마우스의 전체 popliteal 림프절의 대표적인 공초점 현미경 사진.
(A-C) LN B 및 T 세포는 CD4를 사용하여 염색하였다(녹색; T 세포) 및 CD19(적색; B 세포); 스케일 바 = 60 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 식세포를 나타내는 비면역순진한 마우스의 전체 인과 림프절의 대표적인 공초점 현미경 이미지.
(A-C) LN B 및 식세포는 CD19를 사용하여 염색하였다(녹색; B 세포) 및 F4/80(파랑; 식세포); 스케일 바 = 100 μm; (D-F) LN T 및 식세포는 CD3를 사용하여 염색하였다(녹색; T 세포) 및 F4/80 (백색; 식세포); 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 유전자 변형 CX3CR1의 전체 인과 림프절의 공초점 현미경 이미지 GFP/+ CCR2 RFP/+ 항체 마스터 혼합 주입이없는 마우스.
(A-C) LN 세포 분포는 CX3CR1(녹색) 및 CCR2(적색)로 평가하였다; 스케일 바 = 100 μm. (D-F) 20배 목표와 특정 영역의 증폭; 스케일 바 = 50 μm. (G-I) 림프절 부비동 층에서LN 세포 분포; 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 유전자 변형 CX3CR1의 전체 포피라이트 림프절의 공초점 현미경 이미지 GFP/+ CCR2 RFP/+ 항체 마스터 혼합 주입이없는 마우스.
(A-C) LN 세포 분포는 CX3CR1(녹색) 및 CCR2(적색)로 평가하였다; 스케일 바 = 200 μm. (D-F) 10 배 객관적으로 전체 장기의 증폭; 스케일 바 = 100 μm. (G-I) 20배 목표와 특정 영역의 증폭; 스케일 바 = 50 μm. (J-L) 림프절 부비동 층에서LN 세포 분포; 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: T 및 B 세포 염색의 특이성 (다운로드 하려면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭).
| 레이저 | 레이저 파워 | 이득 | 오프셋 | 핀 홀 |
| 406nm | 20% | 65 | -5 | 60μm |
| 488nm | 25% | 50 | -5 | 60μm |
| 561nm | 25% | 65 | -10 | 60μm |
표 1: 이미지 수집 설정입니다.
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Discussion
분자 생물학 및 고차원 면역 phenotyping를 포함하여 그밖 기술과 화상 진찰의 조합은 그들의 본래 문맥에 있는 면역 세포를 조사하는 우리의 기능을 강화했습니다. 사실, 다른 접근법은 조직 소화와 세포 분리를 요구할 수 있지만 - 조직 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 - 생체 내 또는 생체 내 이미징의 사용은 지리적 방식으로 다른 세포 아류형을 조사하는 데 큰 이점을 부여합니다3 , 16. 세포가 특별히 다른 형광체를 발현하도록 표적으로 하는 유전자 변형 마우스 균주의 가용성이 급속히 증가하고 있다는 것은 놀라운 일이 아니다. 중요한 것은, 리포터 마우스와 항체 혼합물의 주사의 조합은 동일한 장기 4에서 생체 내 상이한세포 집단을 염색하는 강력한 도구이다. 더욱이, CRISPR/Cas9 같이 유전자 편집 공구의 대중화는 거의 모든 세포 모형이 그들의 선의의 위치17에서지금 상화될 수 있는 쪽으로 그들의 마우스 긴장을 사용자 정의하는 다른 단을 허용했습니다. 이 접근을 사용하여, 다른 세포 모형 사이 공간 그리고 기능적인 관계는 깊은 세부사항에서 평가될 수 있습니다. 그러나 생체 내에서 세포 운동 또는 동적 이벤트의 이미징이 필수가 아닌 경우 덜 복잡한 실험 접근법을 사용할 수 있습니다. 이 경우 항체와 프로브가 생체 내에서 전달되고 장기 (또는 샘플)가 현미경으로 직접 시각화됩니다.
여기에서 우리는 잠재적으로 기관 구조물에 영향을 미칠 수 있는 조직 동결 보존 및 냉동 절제의 사용을 분배하고 생체 내 행정에 따르는 임파선 내의 면역 세포의 감사를 허용하는 간단한 프로토콜을 기술했습니다 형광 표지 항체. 이 프로토콜은 최소한의 기술 및 외과 기술을 요구하고 그들의 본래 위치에 있는 거의 모든 면역 세포를 구상하기 위하여 적응될 수 있었습니다. 중요한 것은, 우리는 항체가 항원과 세포가 면역 반응 도중 여행하는 동일 통로를 사용하여 림프절에 도달할 것이라는 쪽으로 관리되어야 한다는 것을 제안했습니다. 피하 공간에 형광 항체를 주입함으로써, 생체 내에서 발견되는 모든 조직 및 혈역학적 장벽을 모방하고 항원 방산의 연대기를 추정할 수 있었다. 이 응용 프로그램 이외에, 이 방법은 형광 표지된 나노입자의 형광 표지된 약 및 세포 표적화 연구 결과의 biodistribution에 적용될 수 있고 유용할 수 있었습니다.
그러나 이 방법에는 제한사항이 있습니다. 요구되는 항체의 양은 전통적인 기관학 방법에 비해 더 높습니다; 그러나, 기존의 면역 형광 현미경 검사법은 기술을 최적화하고 좋은 이미지를 얻기 위해 여러 라운드의 조직 준비 및 염색을 필요로하기 때문에, 기존의 현미경 검사법의 비용은 잠재적으로 높은 비용을 극복 할 수 있습니다 우리의 프로토콜에 사용되는 항체 농도. 다음으로, 림프절 9,18에림프항원 배수의 알려진 특성에 기초하여, 라벨링 시약의 크기로 인해 림프질 혈관구조와의 거리에 따라 라벨링의 효율이 급격히 감소할 가능성이 있다. 고용. 실제로, 이미지의 일부에 있는 검은 영역 은 가난한 조직 침투에서 발생할 수 있습니다. 40-100 μm 깊이의 LN의 공초점 이미징을 통해 달성할 수 있으며, 따라서 표면LN 영역만 시각화할 수 있습니다. 적어도 부분적으로이 문제를 극복 하는 한 가지 방법은 더 나은 여기 와 현미경에 의해 검출 형광소를 사용 하는. 또 다른 대안은 심층 조직 이미징의 핵심이었으며 공초점 단일 광자 레이저로 관찰된 심각한 광산염 문제를 우회하는 것으로 나타난 근적외선 여기 파장을 가진 다광자 레이저 현미경을 사용하는 것입니다. 현미경 검사법19. 생체 내에서 전달된 항체에 의해 염색된 이미징 세포의 경우, 세포 표면에 발현되는 항원만 표적화될 수 있다. 사용된 항체가 아직 검증되지 않은 경우, 자동 형광을 배제하고 라벨링을 검증하기 위해 상응하는 아이소타입 제어 염색을 수행하는 것이 중요해진다. 이는 동일한 동물, 즉 세포 표적화 항체 혼합이 입체적으로 주입되고 이소타입 대조군 혼합이 반대로 주입된 것과 동일하게 수행될 수 있다. 또한, 생체 내에서 세포를 효율적으로 염색하는 데 필요한 항체의 양은 실험과 세포주 간에 다를 수 있으며 이러한 제한에 대한 대안적 접근법은 유전자 표적 형광 발현을 사용하는 것이다.
결론적으로, 우리는 조직 건축 무결성을 유지하고, 재현 가능하고, 수행하기 쉽고, 기존의 공초점 현미경을 사용하는 전체 림프절 이미징을위한 새로운 프로토콜을 제안합니다. 이 기술은 간단한 방법이 면역 계통 조사에 있는 중요한 어드밴스를 가능하게 하는 poly 기능적인 플랫폼으로 정규 실험실 구조물을 작동하도록 허용하는 방법을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (H.L.W.에 R01 AI43458)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
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