Summary
Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.
Abstract
Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.
Introduction
Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren1. Antigeen cellen (Apc's), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen2te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke gevolgen hebben voor de vaccin ontwikkeling en kanker immunotherapie.
De opkomst van krachtige microscopen-inclusief nieuwe confocale en superresolutie microscopen-heeft een buitengewone vooruitgang toegestaan in het begrijpen van hoe verschillende immuuncelpopulaties zich gedragen in hun eigen omgeving3. Het is nu mogelijk om verschillende gelijktijdige celsubtypen te maken met behulp van een combinatie van sondes met genetisch gemodificeerde muizen die fluorescerende eiwitten onder controle van specifieke doelstellingen4,5uitdrukken. In feite zijn hoge dimensionale technieken, waaronder massa cytometrie en multi-parametrische stromings analyse, van cruciaal belang geweest om onze kennis uit te breiden over verschillende compartimentalisatie en functionaliteit van de immuuncel in de gezondheid en ziekte6, 7. om monsters voor deze technieken voor te bereiden, hebben weefsels echter spijsvertering nodig en worden cellen gescheiden van hun natuurlijke milieu om te worden geanalyseerd in celsuspensies. Om deze beperkingen te overtreffen en een betere vertaling in de biologie mogelijk te maken, is het doel van het hier voorgestelde protocol om een eenvoudige methodologie toe te passen op beeld ex vivo hele lymfeklieren met behulp van voorraden confocale microscopen met het voordeel van verbeterde snelheid, weefsel behoud van de structuur en de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de conventionele immunofluorescentie kleuring. Door deze aanpak te gebruiken, konden we aantonen dat muizen deficiënte voor γδ T-cellen, een subtype van T-lymfocyten dat betrokken is bij vroege verdediging van de gastheer tegen pathogenen4, follikels en T-celzones hebben aangetast in vergelijking met wild type muizen. Deze bevindingen lieten ons toe om een studie uit te voeren waarin we hebben aangetoond dat de γδ T-cellen een cruciale rol spelen in de homeostase van lymfoïde organen en humorale immuunrespons4. Bovendien biedt dit protocol een fysiologisch traject voor sondes en antilichamen om de lymfeklier te bereiken, omdat ze subcutaan worden toegediend en afgevoerd door de weefsel lymfatische circulatie, voortbouwend op eerdere rapporten die in situ labeling werden gebruikt met antilichamen om lymfatische structuren te visualiseren8,9, Germinal CenterDynamics 10,11,12, en doelen gemakkelijk toegankelijk voor de bloedstroom13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door het Permanent Comité voor dieren aan de Harvard Medical School en het Brigham and Women's Hospital, protocol 2016N000230.
1. muizen gebruikt voor het experiment
- Gebruik 8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen op de B6 achtergrond voor het toedienen van de antilichaammix.
- Gebruik CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT muizen om te bepalen of ex vivo hele LN Imaging ook kan worden toegepast op reporter muizen zonder het toedienen van antilichaammix en om de aanwezigheid van mononucleaire cellen te onderzoeken, waaronder antigeen cellen en fagocyten, en hun verdeling in de LN.
Opmerking: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter muizen hebben respectievelijk groene FLUORESCERENDE eiwitten (GFP) en rood FLUORESCERENDE proteïne (RFP) onder de controle van CX3CR1 en CCR2 promotors. Reporter muizen kunnen worden gebruikt met of zonder de injectie van de antilichaammix. Raadpleeg referentie4 voor antilichaammix injectie in een reporter muis. Ga verder naar een operatie als er geen antilichaam geïnjecteerd wordt.
2. preparaat en injectie met antilichaammix
Opmerking: Voer deze stappen uit op muizen die worden beschreven in stap 1,1.
- Verdun 1:10 van Brilliant Violet (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 van briljant blauw (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) en 1:20 van phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS met het juiste eindvolume om in de binnenste dij te injecteren (om afbeelding inguinale) of in het Paw pad (naar afbeelding popliteal) lymfe.
Opmerking: gebruik als isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype-regeling (R35-38; 0,2 mg/mL); PE rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL). Als u het kleurstof antilichaam wijzigt, gebruik dan de juiste Isotype. - Voorbeeld inguinale LN, Injecteer 100 μL van de antilichaammix subcutaan in de binnenste dij (Figuur 1a). U ook 50 μL subcutaan van antilichaam mengsel injecteren in het Paw pad naar afbeelding popliteale ln (Figuur 2a). Gebruik delicate 1 mL insuline spuiten, (insuline U-100) met de naald van maat 0,30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 inch).
Opmerking: Zorg ervoor dat de injectie voor inguinale LN-kleuring subcutaan is en niet intramusculair (i.m.), aangezien antilichaam mengsel niet goed wordt afgevoerd als i.m. toediening wordt uitgevoerd. - Niet verdoken dieren voor antilichaam mengen injectie.
- Wacht minimaal 3 uur (inguinale dLN) en 12 h (popliteal dLN) na injectie om de organen te verwijderen.
- Als LN cellabeling niet volledig wordt waargenomen met behulp van grote polymeer fluorescerende kleurstoffen zoals Brilliant Violet of Brilliant Blue, gebruik dan kleinere fluor Foren, waaronder fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), PE en allophycocyanin (APC) als alternatief.
3. chirurgie procedure om de inguinale drainage lymfeklier verwijderen
- Euthanize muizen met co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
- Immobiliseer muizen op het acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje aan op de buikhuid om pels depositie rond de incisie te voorkomen (Figuur 1b). Het verwijderen van bont is niet nodig.
- Voer een middenlijn incisie met behulp van microchirurgie gebogen schaar (11,5 cm) en microchirurgie gebogen Tang (12,5 cm) in de buik van de schaambeen naar de xifoïde proces (figuur 1c).
- Dissocieren de buikspieren van de huid (figuur 1d).
- Maak horizontale huid incisies aan de boven-en onderkant van de verticale incisie lijn om huid kleppen te maken aan de kant van de belangstelling (afhankelijk van de zijkant van de antilichaammix injectie) en flap de huid om de lymfeklier te visualiseren (Figuur 1e).
- Plak de skin-flap op de acrylplaat (Figuur 1f).
- Verwijder de inguinale drainage lymfeklier met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1f). Lymfeklier zal verschijnen als een translucid, meestal bilobular, bol onder de huid.
4. chirurgie procedure om de popliteale drainage lymfeklier te verwijderen
- Euthanize muizen met co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
- Immobiliseer muizen op een gevoelige positie op acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje in de kuit en knie (Figuur 2a-D).
- Voer een middenlijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie (Figuur 2E, F).
- Dissociëren de Kalver spier massa van de huid (figuur 2F, G).
- De popliteale Fossa (figuur 2g) blootstellen. Popliteale lymfeklier zal verschijnen als een translucid Sphere in de popliteale Fossa.
- Verwijder de lymfeklier van de popliteale met behulp van een microchirurgie gebogen Tang (figuur 2g).
- Als alternatief, draai de muis over op rugligging positie, en benaderen van de popliteale Fossa tussen biceps musculus femoris en semitendinosus voor de verwijdering van de popliteale LN door het uitvoeren van een middellijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie gevolgd door dissociatie van de kalf Musculatuur van de huid.
Opmerking: Popliteal Fossa is een ondiepe depressie gelegen aan de achterkant van het kniegewricht. Open zorgvuldig om de lymfeklier van de popliteale te zien.
5. voorbereiding van lymfeklieren
- Plaats het hele orgel in een kweek schaal met glazen bodem (35 mm x 10 mm) en verwijder het vet dat het orgel omringt met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1G-I en figuur 2H).
- Centraliseer het orgel in het midden van het gerecht (figuur 1J en afbeelding 2H).
- Bedek het orgel met een fragment van delicate taak wissers en houd het doorweekt met kamertemperatuur zoutoplossing 0,9% of fosfaat buffer (Figuur 1K-M en figuur 2H).
Opmerking: het is niet nodig om lymfeklieren te wassen na verwijdering of om de lymfeklier extractie in de afzuigkap uit te voeren.
6. ex-vivo confocale microscopie (beeldvorming)
- Plaats de Petri schaal in de omgekeerde confocale Microscoop sleuf (figuur 1N en Figuur 2uur).
- Beeld LNs onder een confocale Microscoop (figuur 1O en afbeelding 2H).
- Haal eerst de juiste focus door het conventionele licht van de confocale Microscoop te gebruiken met 4x of 10x objectief. Verander dan van de licht functie naar de laser modus.
Opmerking: als de confocale Microscoop geen 4x-doelstelling bevat, kan de scherpstelling perfect worden verkregen met behulp van de 10x-doelstelling. - Pas de laser kracht, offset en Gain aan met behulp van een Isotype-gekleurd, niet-gekleurd of niet-fluorescerende monster (tabel 1) om autofluorescentie en onspecifieke kleuring te verwijderen van fluorescerende-gelabelde antilichamen zoals die gebruikt in de beelden die in dit manuscript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 en PE anti-F4/80).
- Pas Z -en XY -posities aan met behulp van de Micrometrische en Chariot, respectievelijk, op het gebied van belang in de lymfeklier.
- Verkrijg afbeeldingen onder 4x, 10x en 20x doelstellingen gericht op de LN structuur en cellulaire distributie. Gebruik 1024 x 1024-pixel definitie.
Opmerking: Verkrijg minimaal vijf afbeeldingen in verschillende velden per doelstelling per dier. - Analyseer afbeeldingen met behulp van een afbeeldings software om kanalen te scheiden, schaal en kleuren van interesse toe te voegen en de 3D-weergave te reconstrueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit manuscript toont technieken om inguinale en popliteale lymfeklieren te verwijderen zonder hun structuur te beschadigen na de injectie van fluorescerende-gelabelde antilichamen om specifieke celpopulaties in deze organen te vlekken (Figuur 1 en Figuur 2 ).
De krachtige combinatie van immunolabeling van LN-cellen met BV421 anti-CD4 en BB515 anti-CD19 en confocale beeldvormings analyse definieerde de lokalisatie van T-cellen (CD4 +) en B-cellen (CD19 +) in inguinale en popliteaal LNs. In beide organen werden B-celfollikels omringd door T-celpopulaties (Figuur 3, Figuur 4 en Video 1), een kenmerk van de LN-structuur1. Om de mogelijkheid uit te sluiten dat fagocyten die de lymfatische sinussen bekleden de geïnjecteerde fluorescerende antilichamen kunnen opvangen en resulteren in niet-specifieke labeling van celmarkeringen, werd PE anti-F4/80 opgenomen in de antilichaammix. Zoals weergegeven in Figuur 5, hebben fagocyten geen geïnjecteerde antilichamen geïntertaliseerd, wat aangeeft dat B-en T-celkleuring specifiek was. Video 1 toont bovendien aan dat T-en B-celkleuring elkaar niet overlappen, wat de kleuring specificiteit bevestigt.
Om de ruimtelijke lokalisatie van fagocytische mononucleaire cellen in de LN, inguinale en popliteale LNs van CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+ te onderzoeken, werden afgebeeld. Er werden mononucleaire cellen aangetroffen in de inguinale LN, inclusief de subcapsulaire sinus. De meeste van deze cellen waren CX3CR1GFP/+, gevolgd door CCR2RFP/+ en dubbele positieve cellen (geel) (Figuur 6A-F). Hetzelfde patroon van celdistributie en celfenotypes werd waargenomen in de popliteale LN (Figuur 7A-I). Zowel inguinale als popliteale LNs vertoonden zwarte gebieden zonder CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, die worden bezet door lymfocyten. Bovendien waren de CX3CR1 +-en CCR2 +-cellen schaars in het binnenste gedeelte van de LNs en concentreerden ze zich in het buitenste gebied, wat erop duidt dat deze cellen voornamelijk de subcapsulaire sinus van LN bezetten (Figuur 6G-I en Figuur 7J-L). Zo kan het voorgestelde protocol duidelijk de belangrijkste celpopulaties in lymfeklieren definiëren.
Figuur 1: inguinale lymfeklier preparaat.
A) subcutane injectie van FACS antilichamen Master mix in de binnenste dij. (B) 3 h na de injectie, euthaniseer de muis, immobiliseer de muis op een acrylplaat met plakband en breng minerale olie aan op de buikhuid om pels depositie rond de incisie te voorkomen. (C) Voer een middenlijn incisie in de buik van de schaambeen naar de xifoïde proces. (D) dissociëren de buikspieren van de huid en doe een huid flap. (E) plak de huid flap op de acrylplaat. (F) Verwijder de inguinale lymfeklier met behulp van een microchirurgie gebogen Tang. (G-H) Plaats het orgel in een kweek schaal (G) en verwijder het vet dat het orgel omringt (H). I) illustratief beeld dat de orgel grootte na reiniging weergeeft. J-M) Centraliseer het orgel in het midden van een petrischaaltje (j), bedek het orgel met een stukje delicate taak wissers (K) en blijf geweekt met een warme 0,9% zoutoplossing of 1x PBS (L, M). (N) plaats de Petri schaal in de Microscoop sleuf. (O) scan het orgel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: popliteale lymf node preparaat.
(a, B) Subcutane injectie van FACS antilichamen Master mix in de Paw pad. (C, D) 3 h na de injectie, euthanaseren de muis, immobiliseer de muis op een acrylplaat met plakband (c) en breng minerale olie aan op de buikhuid om pels depositie rond de incisie te voorkomen (D). (E) Voer een middenlijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie. F) de popliteale Fossa blootstellen. G) Verwijder de lymfeklier van de popliteale met behulp van een microchirurgie-gebogen Tang. (H) plaats het orgel in een petrischaaltje en verwijder het vet dat het orgel omringt, Centraliseer het orgel in het midden van de petrischaal, bedek het orgel met een stukje delicate taak wissers en blijf geweekt met warme zoutoplossing 0,9% of 1x PBS. Plaats de Petri schaal in de Microscoop sleuf en scan het orgel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve confocale microscopie beelden van hele inguinale lymfeklieren van niet-geïmmobiliseerde naïeve muizen.
(a-C) LN B-en T-cellen werden gekleurd met CD4 (groen; T-cellen) en CD19 (rood; B-cellen); schaalbalk = 50 μm. (D-I) Versterking van het specifieke gebied met 10x objectief; schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve confocale microscopie beelden van hele popliteale lymfeklieren van niet-geïmmobiliseerde naïeve muizen.
(a-C) LN B-en T-cellen werden gekleurd met CD4 (groen; T-cellen) en CD19 (rood; B-cellen); schaalbalk = 60 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve confocale microscopie beelden van hele inguinale lymfeklier van niet-geïmmobiliseerde naïeve muizen die fagocyten vertonen.
(a-C) LN B en fagocytische cellen werden gekleurd met behulp van CD19 (groen; B-cellen) en F4/80 (blauw; fagocyten); schaalbalk = 100 μm; (D-F) LN T en phagocytische cellen werden gekleurd met behulp van CD3 (groen; T-cellen) en F4/80 (wit; fagocyten); schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: confocale microscopie beelden van hele inguinale lymfeklieren van genetisch gemodificeerde CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ Muizen zonder antilichamen Master Mix injectie.
(a-C) De celdistributie van LN werd geëvalueerd met CX3CR1 (groen) en CCR2 (rood); schaalbalk = 100 μm. (D-F) Versterking van een specifiek gebied met een doelstelling van 20 x; schaalbalk = 50 μm. (G-I) LN celverdeling in de lymfeklier-sinus bodem; schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: confocale microscopie beelden van hele popliteale lymfeklieren van genetisch gemodificeerde CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ Muizen zonder antilichamen Master Mix injectie.
(a-C) De celdistributie van LN werd geëvalueerd met CX3CR1 (groen) en CCR2 (rood); schaalbalk = 200 μm. (D-F) Versterking van het hele orgel met 10x objectief; schaalbalk = 100 μm. (G-I) Versterking van een specifiek gebied met een doelstelling van 20 x; schaalbalk = 50 μm. (J-L) LN celverdeling in de lymfeklier-sinus bodem; schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: de specificiteit van T-en B-celkleuring (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
| Laser | Laser Power | Krijgen | Offset | Pinhole |
| 406nm | 20 | 65 | -5 | 60 μm |
| 488nm | 25 | 50 | -5 | 60 μm |
| 561nm | 25 | 65 | -10 | 60 μm |
Tabel 1: instellingen voorbeeld verwerving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode3 , 16. het is niet verwonderlijk dat de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muis stammen waarin cellen specifiek worden getarget om verschillende fluor soorten uit te drukken, snel toeneemt. Belangrijk is dat de combinatie van reporter muizen en de injectie van de antilichaammix een krachtig hulpmiddel is om verschillende celpopulaties in vivo in hetzelfde orgaan4te vlekken. Bovendien heeft de popularisatie van genbewerkings hulpmiddelen zoals CRISPR/Cas9 verschillende groepen toegestaan om hun muis stammen zodanig aan te passen dat vrijwel elk celtype nu in hun bonafide locatie17kan worden afgebeeld. Met deze benadering kan de ruimtelijke en functionele relatie tussen verschillende celtypen worden beoordeeld in diepe Details. Echter, als Imaging van de celbeweging of dynamische gebeurtenissen in vivo niet verplicht zijn, kan een minder complexe experimentele benadering worden gebruikt. In dit geval worden antilichamen en sondes in vivo geleverd en wordt het orgel (of een monster) direct gevisualiseerd in de Microscoop.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol dat het gebruik van weefsel cryopreservatie en cryosectioning die mogelijk invloed kunnen hebben op orgaan structuren en toegestaan de waardering van immune cellen binnen lymfeklieren na in vivo toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen. Deze protocollen eisten minimale technische en chirurgische vaardigheden en kunnen worden aangepast om vrijwel alle immuuncellen in hun oorspronkelijke locatie te visualiseren. Belangrijk is dat we hebben voorgesteld dat antilichamen zodanig worden toegediend dat ze de lymfeklieren bereiken met dezelfde trajecten die antigenen en cellen tijdens een immuunrespons gebruiken. Door het injecteren van fluorescerende antilichamen in de subcutane ruimte was het mogelijk om alle weefsels en hemodynamische barrières in vivo na te bootsen en de chronologie van antigeen dissipatie te schatten. Naast deze toepassing, deze methode kan worden toegepast en nuttig voor de biodistributie van fluorescerende-gelabelde drugs en cel-targeting studies van TL-gelabelde nanodeeltjes.
Er zijn echter beperkingen voor deze methode. De vereiste hoeveelheid antilichaam is hoger in vergelijking met conventionele histologische methoden; echter, aangezien conventionele immunofluorescentie microscopie verschillende rondes van weefsel voorbereiding en-kleuring vereist om de techniek te optimaliseren en goede beelden te verkrijgen, kunnen de kosten van conventionele microscopie mogelijk de kosten van de hoge in ons Protocol gebruikte antilichaam concentratie. Vervolgens, op basis van de bekende eigenschappen van lymfatische antigeen drainage in de lymfeklier9,18, zal de efficiëntie van labeling snel afnemen met de afstand tot de lymfatische vasculatuur vanwege de grootte van het etiketterings reagens zelfstandige. Inderdaad, de zwarte gebieden in sommige van de beelden kunnen voortvloeien uit slechte weefsel penetratie. Slechts 40-100 μm in diepte kan worden bereikt met confocale beeldvorming van LN, zodat alleen oppervlakkige LN-regio's kunnen worden gevisualiseerd. Een manier om op zijn minst gedeeltelijk te overwinnen dit probleem is het gebruik van fluoroforen met betere excitatie en detectie door de Microscoop. Een andere alternatieve benadering is het gebruik van multiphoton laser microscopie met near-infrarood excitatie golflengte die de sleutel is geweest tot diepe weefsel beeldvorming en werd getoond om ernstige lichtverstrooiings problemen te omzeilen die werden waargenomen met confocale enkelvoudige fotonen Laser microscopie19. In het geval van beeldvormende cellen die worden gekleurd door antilichamen die in vivo zijn geleverd, kunnen alleen antigenen die op het celoppervlak worden uitgedrukt, worden getarget. Als de gebruikte antilichamen nog niet zijn gevalideerd, wordt het cruciaal om een overeenkomstige Isotype-controle kleuring uit te voeren om autofluorescentie uit te sluiten en de labeling te valideren. Dit kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier, d.w.z. cel gericht antilichaam mix geïnjecteerd ipsilaterally en Isotype Control mix contralaterally geïnjecteerd. Bovendien kan de hoeveelheid antilichaam die nodig is om een cel in vivo efficiënt te vlekken, variëren tussen experimenten en cellijnen en een alternatieve aanpak voor deze beperking is het gebruik van genetische gerichte fluorescentie expressie.
Concluderend, wij stellen een nieuw protocol voor hele lymfeklier Imaging die de weefsel architecturale integriteit onderhoudt, reproduceerbaar, gemakkelijk uit te voeren en het gebruik van conventionele confocale microscopen. Deze techniek laat zien hoe eenvoudige methoden kunnen toestaan dat reguliere laboratorium structuren werken als poly-functionele platformen die belangrijke vooruitgang in het onderzoek van het immuunsysteem mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01 AI43458 naar H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
