Summary
Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.
Abstract
I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.
Introduction
I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro1. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose2. Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie presenti nel sistema linfatico avrà importanti implicazioni per lo sviluppo del vaccino e l'immunoterapia del cancro.
L'avvento di potenti microscopi - tra cui nuovi microscopi confocali e super-risoluzione - ha permesso uno straordinario progresso nella comprensione di come si comportano le diverse popolazioni di cellule immunitarie nel loro ambiente nativo3. È ora possibile immaginare diversi sottotipi di cellule simultanee utilizzando una combinazione di sonde con topi geneticamente modificati che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di specifici obiettivi4,5. Infatti, tecniche ad alta dimensione, tra cui citometria di massa e analisi del flusso multi-parametrico sono state cruciali per espandere le nostre conoscenze su diverse compartimentazioni e funzionalità delle cellule immunitarie nella salute e nella malattia6, 7. Tuttavia, per preparare campioni per queste tecniche, i tessuti hanno bisogno di digestione e le cellule sono separate dal loro ambiente naturale per essere analizzate nelle sospensioni cellulari. Per superare queste limitazioni e consentire una migliore traduzione in biologia, l'obiettivo del protocollo qui proposto è quello di applicare una metodologia semplice per immagini ex vivo interi linfonodi utilizzando microscopi confocali stock con il vantaggio di una migliore velocità, tessuto conservazione della struttura e vitalità cellulare rispetto alla colorazione dell'immunofluorescenza convenzionale. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di dimostrare che i topi carenti per le cellule T, un sottotipo di linfocito T coinvolto nella difesa precoce dell'ospite contro i patogeni4, hanno follicoli compromessi e zone di cellule T rispetto ai topi di tipo selvatico. Questi risultati ci hanno permesso di seguire uno studio in cui abbiamo dimostrato che le cellule T di z svolgono un ruolo critico nell'omeostasi degli organi linfoidi e nella risposta immunitaria umorale4. Inoltre, questo protocollo fornisce un percorso fisiologico per le sonde e gli anticorpi per raggiungere il linfonodo, in quanto vengono somministrati sottocutaneamente e dissipati attraverso la circolazione linfatica dei tessuti, basandosi su precedenti rapporti che hanno utilizzato nell'etichettatura situ con anticorpi per visualizzare strutture associate a linfatiche8,9, dinamica del centro germinale10,11,12, e bersagli facilmente accessibili al flusso sanguigno13 ,14,15.
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Protocol
Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.
1. Topi usati per l'esperimento
- Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.
- Utilizzare i mouse CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la miscela di anticorpi, nonché per studiare la presenza di cellule mononucleari, inclusa la presentazione di antigene cellule e fagociti, e la loro distribuzione nella LN.
NOTA: i topi cX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT presentano proteine fluorescenti verdi (GFP) e proteine fluorescenti rosse (RFP) inserite rispettivamente sotto il controllo dei promotori CX3CR1 e CCR2. I topi reporter possono essere utilizzati con o senza l'iniezione della miscela di anticorpi. Si prega di vedere il riferimento4 per l'iniezione di mix di anticorpi in un topo reporter. Procedere all'intervento chirurgico se non verrà iniettato alcun anticorpo.
2. Preparazione e iniezione del mix di anticorpi
NOTA: eseguire questa procedura sui mouse descritti nel passaggio 1.1.
- Diluire 1:10 di viola brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 di blu brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) e 1:20 di phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS con il volume finale appropriato per iniettare nella coscia (per iniettare nella coscia interna (per iniettare nella coscia) (per immagine inguinale) o nella zampa pad (all'immagine popliteal) linfa.
NOTA: Utilizzare come isotipi: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, - Controllo isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se si modifica l'anticorpo di colorazione, utilizzare l'isotipo corretto. - Per immaginare LN inguinale, iniettare 100 l del mix di anticorpi sottocutaneamente nella coscia interna (Figura 1A). In alternativa, iniettare 50 - L sottocutaneamente di miscela di anticorpi nel pad zampa per immagine popliteal LN (Figura 2A). Utilizzare delicate siringhe di insulina da 1 mL (Insulin U-100) con l'ago della taglia 0,30 mm x 13 mm (30 misuratore : 1/2 pollice).
NOTA: Assicurarsi che l'iniezione per la colorazione LN inguinale sia sottocutanea e non intramuscolare (im.), poiché la miscela di anticorpi non verrà correttamente drenata se viene eseguita la somministrazione. - Non anestesizzare gli animali prima dell'iniezione di miscela di anticorpi.
- Attendere un minimo di 3 h (dLN inguinale) e 12 h (dLN popliteal) dopo l'iniezione per rimuovere gli organi.
- Se l'etichettatura delle cellule LN non è completamente osservata utilizzando grandi coloranti fluorescenti polimerici come viola brillante o blu brillante, utilizzare fluorofori più piccoli, tra cui l'isotociociocianato di fluoresceina (FITC), PE e allophycocyanin (APC) come alternativa.
3. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo drenante inguinale
- Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale.
- Immobilizza i topi sullo stadio acrilico con del nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone sulla pelle addominale per evitare la deposizione di pelliccia intorno all'incisione (Figura 1B). La rimozione della pelliccia non è necessaria.
- Eseguire un'incisione mediana utilizzando forbici curve di microchirurgia (11,5 cm) e pinze curve di microchirurgia (12,5 cm) nell'addome dal pube al processo xifoideo (Figura 1C).
- Dissociare la muscolatura addominale dalla pelle (Figura 1D).
- Fare incisioni orizzontali della pelle nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale per creare lembi della pelle sul lato di interesse (secondo il lato dell'iniezione di mix anticorpo) e sbattere la pelle per visualizzare il linfonodo (Figura 1E).
- Nastro la pelle-flap sulla piastra acrilica (Figura 1F).
- Rimuovere il linfonodo drenante inguinale utilizzando pinze curve di microchirurgia (Figura 1F). Il nodo linfo-falgioco apparirà come una sfera traslucida, di solito bilobulare, sotto la pelle.
4. Procedura chirurgica per rimuovere il linfonodo di drenaggio popliteale
- Topi eutanasi che utilizzano asfissia di CO2 seguita da lussazione cervicale.
- Immobilizzai i topi in una posizione prona sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applica l'olio minerale con un tampone di cotone nel polpaccio e nel ginocchio (Figura 2A-D).
- Eseguire un'incisione mediana nel vitello dal tallonlo al ginocchio (Figura 2E,F).
- Dissociare la muscolatura del vitello dalla pelle (Figura 2F,G).
- Esporre la fossa popliteale (Figura 2G). Il linfonodo popliteale apparirà come una sfera traslucida nella fossa popliteale.
- Rimuovere il linfonodo popliteale utilizzando le pappe curve di microchirurgia (Figura 2G).
- In alternativa, capovolgere il mouse sulla posizione supina e avvicinarsi alla fossa popliteal tra bicipiti femoris e semitendinosus per la rimozione di LN popliteale eseguendo un'incisione mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio seguita da dissociazione del polpaccio muscolatura dalla pelle.
NOTA: La fossa popliteale è una depressione poco profonda situata nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Aperto con attenzione per vedere il linfonodo popliteale.
5. Preparazione del linfonodo
- Posizionare l'intero organo in un piatto di coltura con fondo di vetro (35 mm x 10 mm) e rimuovere il grasso che circonda l'organo utilizzando prate curve di microchirurgia (Figura 1G-I e Figura 2H).
- Centralizzare l'organo al centro del piatto (Figura 1J e Figura 2H).
- Coprire l'organo con un frammento di delicati tergicristalli compito e tenerlo inzuppato con temperatura ambiente salino 0.9% o Fosfato Buffer Solution (Figura 1K-M e Figura 2H).
NOTA: Non è necessario lavare i linfonodi dopo la rimozione o eseguire l'estrazione del linfonodo nel cofano.
6. Microscopia confocale ex vivo (Imaging)
- Posizionare il piatto Petri nello slot al microscopio confocale invertito (Figura1N e Figura 2H).
- Image LN al microscopio confocale (Figura 1O e Figura 2H).
- In primo luogo, ottenere la giusta messa a fuoco utilizzando la luce convenzionale del microscopio confocale con obiettivo 4x o 10x. Quindi passare dalla funzione di luce alla modalità laser.
NOTA: Se il microscopio confocale non contiene un obiettivo 4x, la messa a fuoco può essere perfettamente ottenuta utilizzando l'obiettivo 10x. - Regolare la potenza del laser, l'offset e il guadagno utilizzando un campione macchiato di isotipo, non macchiato o non fluorescente (Tabella 1) per rimuovere l'autofluorescenza e la colorazione non specifica da anticorpi fluorescenti come quelli utilizzati nelle immagini mostrate in questo (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).
- Regolare le posizioni di xY, utilizzando rispettivamente la micrometrica e il carro, sull'area di interesse nel linfonodo.
- Acquisire immagini sotto 4x, 10x e 20x obiettivi concentrandosi sulla struttura LN e distribuzione cellulare. Usa la definizione di 1024 x 1024 pixel.
NOTA: Acquisire un minimo di cinque immagini in diversi campi per obiettivo per animale. - Analizza le immagini utilizzando un software di immagine per separare i canali, aggiungere scala e colori di interesse e ricostruire la vista 3D.
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Representative Results
Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).
La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (CD4) e b (CD19) in LN inguinali e popitivi. In entrambi gli organi, i follicoli cellulari B erano circondati da popolazioni di cellule T (Figura 3, Figura 4 e video 1), un segno distintivo della struttura LN1. Per escludere la possibilità che i fagociti che rivestono i seni linfatici possano catturare gli anticorpi fluorescenti iniettati e provocare un'etichettatura non specifica dei marcatori cellulari, l'anti-F4/80 PE è stato incluso nella miscela di anticorpi. Come mostrato nella Figura 5, i fagociti non hanno interno gli anticorpi iniettati, indicando che la colorazione delle cellule B e T era specifica. Inoltre, il video 1 mostra che la colorazione delle cellule T e B non si sovrapponeva, a conferma della specificità della colorazione.
Per studiare la localizzazione spaziale delle cellule mononucleari fagocitiche nell'LN, sono stati immaginati i LN inguinali e popitici di CX3CR1GFP/'CCR2 RFP/'. Le cellule mononucleari sono state trovate in tutto l'LN inguinale, incluso il sinus capsulare. La maggior parte di queste celle erano CX3CR1GFP/z, seguite da CCR2RFP / z e doppie celle positive (giallo) (Figura6A-F). Lo stesso modello di distribuzione cellulare e fenotipi cellulari è stato osservato nella LN popliteale (Figura 7A-I). Sia le LN inguinali che quelle popliteali mostravano regioni nere senza CX3CR1GFP/'CCR2 RFP/',che sono occupate da linfociti. Inoltre, le cellule CX3CR1 e CCR2 erano scarse nell'area interna delle LN e concentrate nell'area esterna, indicando che queste cellule occupano principalmente il sinus del subcapsular LN (Figura 6G-I e Figura 7J-L). Così, il protocollo proposto può chiaramente definire le principali popolazioni cellulari presenti nei linfonodi.
Figura 1: Preparazione del linfonodo inguinale.
(A) Iniezione sottocutanea della miscela master anticorpale FACS nella coscia interna. (B) 3 ore dopo l'iniezione, eutanasia il topo, immobilizzare il topo su una piastra acrilica con nastro adesivo e applicare olio minerale sulla pelle addominale per evitare la deposizione di pelliccia intorno all'incisione. (C) Eseguire un'incisione mediana nell'addome dal pube al processo xifoideo. (D) Dissociare la muscolatura addominale dalla pelle e fare un lembo della pelle. (E) Nastro la pelle-flap sulla piastra acrilica. (F) Rimuovere il linfonodo inguinale utilizzando una microchirurgia pinze curve. (G-H) Posizionare l'organo in un piatto di coltura (G) e rimuovere il grasso che circonda l'organo (H). (I) Immagine illustrativa che mostra la dimensione dell'organo dopo la pulizia. J-M) Centralizzare l'organo nel mezzo di una piastra di Petri (J), coprire l'organo con un pezzo di tergicristalli compito delicato (K) e mantenere inzuppato con caldo 0.9% salina o 1x PBS (L, M). (N) Posizionare il piatto Petri nello slot del microscopio. (O) Eseguire la scansione dell'organo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione del linfonodo popliteale.
(A, B) Iniezione sottocutanea di miscela master anticorpale FACS nel pad della zampa. (C, D) 3 h dopo l'iniezione, eutanasia il topo, immobilizzare il topo su una piastra acrilica con nastro adesivo (C) e applicare olio minerale sulla pelle addominale per evitare la deposizione di pelliccia intorno all'incisione (D). (E) Eseguire un'incisione mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio. (F) Esporre la fossa popliteale. (G) Rimuovere il linfonodo popitivo utilizzando pinze microchirurgiche-curve. (H) Mettere l'organo in una piastra di Petri e rimuovere il grasso che circonda l'organo, centralizzare l'organo al centro del piatto Petri, coprire l'organo con un pezzo di delicati tergicristalli e mantenere imbevuto di calda salina 0.9% o 1x PBS. Posizionare il piatto Petri nella fessura del microscopio e scansionare l'organo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini di microscopia confocale rappresentative di interi linfonodi inguinali di topi ingenui non immunizzati.
(A-C) Le cellule LN B e T sono state macchiate utilizzando CD4 (verde; T) e CD19 (rosso; cellule B); barra della scala : 50 m. (D-I) Amplificazione di un'area specifica con obiettivo 10x; barra della scala 30 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini di microscopia confocale rappresentative di linfonodi popitivi interi di topi ingenui non immunizzati.
(A-C) Le cellule LN B e T sono state macchiate utilizzando CD4 (verde; T) e CD19 (rosso; cellule B); barra della scala di 60 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini di microscopia confocale rappresentative di interi linfonodi inguinali di topi ingenui non immunizzati che mostrano fagociti.
(A-C) LN B e le cellule fagocitiche sono state macchiate usando CD19 (verde; B) e F4/80 (blu; fagociti); barra della scala : 100 m; (D-F) LN T e le cellule fagocimiche sono state macchiate usando CD3 (verde; cellule T) e F4/80 (bianco; fagociti); barra della scala 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini di microscopia confocale di interi linfonodi inguinali di CX3CR1 geneticamente modificati GFP/ CCR2 Richiesta di offerta/p topi senza iniezione di mix master anticorpale.
(A-C) La distribuzione delle celle LN è stata valutata con CX3CR1 (verde) e CCR2 (rosso); barra della scala 100 m. (D-F) Amplificazione di un'area specifica con obiettivo 20x; barra della scala : 50 m. (G-I) Distribuzione delle cellule LN nel pavimento del sinusdelo del linfonodo; barra della scala 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini di microscopia confocale di linfonodi popitivi interi di CX3CR1 geneticamente modificati GFP/ CCR2 Richiesta di offerta/p topi senza iniezione di mix master anticorpale.
(A-C) La distribuzione delle celle LN è stata valutata con CX3CR1 (verde) e CCR2 (rosso); barra della scala 200 m. (D-F) Amplificazione di interi organi con obiettivo 10x; barra della scala 100 m. (G-I) Amplificazione di un'area specifica con obiettivo 20x; barra della scala : 50 m. (J-L) Distribuzione delle cellule LN nel pavimento del sinusdelo del linfonodo; barra della scala 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: La specificità della colorazione delle cellule T e B (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
| laser | Potenza laser | Guadagno | compensare | Pinhole |
| 406nm | 20% | 65 | -5 | 60 m |
| 488nm | 25% | 50 | -5 | 60 m |
| 561nm | 25% | 65 | -10 | 60 m |
Tabella 1: impostazioni di acquisizione delle immagini.
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Discussion
La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico3 , 16. Non sorprende che la disponibilità di ceppi di topi geneticamente modificati in cui le cellule sono specificamente mirate ad esprimere diversi fluorofori sia in rapido aumento. È importante sottolineare che la combinazione di topi reporter e l'iniezione del mix di anticorpi è un potente strumento per macchiare diverse popolazioni di cellule in vivo nello stesso organo4. Inoltre, la divulgazione di strumenti di editing genetico come CRISPR/Cas9 ha permesso a diversi gruppi di personalizzare i loro ceppi di mouse in modo che praticamente qualsiasi tipo di cellula può essere ora immaginato nella loro posizione in buona fede17. Utilizzando questo approccio, la relazione spaziale e funzionale tra i diversi tipi di cellule può essere valutata in dettagli approfonditi. Tuttavia, se l'imaging del movimento cellulare o gli eventi dinamici in vivo non sono obbligatori, è possibile utilizzare un approccio sperimentale meno complesso. In questo caso, anticorpi e sonde vengono consegnati in vivo e l'organo (o un campione) viene visualizzato direttamente al microscopio.
Qui abbiamo descritto un protocollo semplice che ha dispensato l'uso della crioconservazione e della criosezione dei tessuti che possono potenzialmente influenzare le strutture degli organi e hanno permesso l'apprezzamento delle cellule immunitarie all'interno dei linfonodi dopo la somministrazione in vivo di anticorpi fluorescenti. Questi protocolli richiedevano minime capacità tecniche e chirurgiche e potevano essere adattati per visualizzare praticamente qualsiasi cella immunitaria nella loro posizione originale. È importante sottolineare che abbiamo proposto che gli anticorpi debbano essere somministrati in modo da raggiungere i linfonodi utilizzando gli stessi percorsi che gli antigeni e le cellule viaggiano durante una risposta immunitaria. Iniettando anticorpi fluorescenti nello spazio sottocutaneo, è stato possibile imitare tutti i tessuti e le barriere emodinamiche presenti in vivo e stimare la cronologia della dissipazione dell'antigene. Oltre a questa applicazione, questo metodo potrebbe essere applicato e utile per la biodistribuzione di farmaci con etichetta florescente e studi di targeting cellulare di nanoparticelle fluorescenti.
Tuttavia, esistono limitazioni a questo metodo. La quantità di anticorpi necessari è superiore rispetto ai metodi di istologia convenzionali; tuttavia, poiché la microscopia convenzionale immunofluorescenza richiede diversi cicli di preparazione e colorazione dei tessuti per ottimizzare la tecnica e ottenere buone immagini, il costo della microscopia convenzionale può potenzialmente superare il costo dell'alto concentrazione di anticorpi impiegati nel nostro protocollo. Successivamente, sulla base delle proprietà note del drenaggio dell'antigene linfatico nel linfonodo9,18, l'efficienza dell'etichettatura è probabile che diminuisca rapidamente con la distanza dalla vascolatura linfatica a causa delle dimensioni del reagente di etichettatura Impiegato. Infatti, le aree nere in alcune delle immagini possono derivare da scarsa penetrazione dei tessuti. Con l'imaging confocale di LN è possibile ottenere solo 40-100 m di profondità, e quindi è possibile visualizzare solo regioni LN superficiali. Un modo per superare almeno parzialmente questo problema è quello di utilizzare fluorofori con una migliore eccitazione e rilevamento dal microscopio. Un altro approccio alternativo consiste nell'utilizzare la microscopia laser multifotona con lunghezza d'onda di eccitazione nel vicino infrarosso che è stata fondamentale per l'imaging dei tessuti profondi ed è stato indicato per aggirare i gravi problemi di dispersione della luce osservati con il laser fotone singolo confocale microscopia19. Nel caso di cellule di imaging macchiate da anticorpi che sono stati consegnati in vivo, solo gli antigeni espressi sulla superficie cellulare possono essere mirati. Se gli anticorpi utilizzati non sono ancora stati convalidati, diventa fondamentale eseguire una colorazione corrispondente del controllo isotipo per escludere l'autofluorescenza e convalidare l'etichettatura. Questo può essere eseguito nello stesso animale, cioè, cellula di puntamento anticorpo mix iniettato ipsilateralmente e miscela di controllo isotipo iniettato contralateralmente. Inoltre, la quantità di anticorpi necessari per macchiare in modo efficiente una cellula in vivo può variare tra esperimenti e linee cellulari e un approccio alternativo per questa limitazione consiste nell'utilizzare l'espressione di fluorescenza geneticamente mirata.
In conclusione, proponiamo un nuovo protocollo per l'imaging del linfonodo intero che mantiene l'integrità architettonica dei tessuti, è riproducibile, facile da eseguire e utilizzare microscopi confocali convenzionali. Questa tecnica dimostra come semplici metodi possano consentire alle strutture di laboratorio regolari di funzionare come piattaforme polifunzionali che consentono importanti progressi nelle indagini del sistema immunitario.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
