Summary
Этот протокол описывает метод изображения различных популяций клеток в осушении лимфатических узлов без изменений в структуре органа.
Abstract
Лимфатические узлы (LNs) являются органами, распространяемыми внутри организма, где врожденные иммунные реакции могут соединиться с адаптивным иммунитетом. В самом деле, LNs стратегически вмешались в пути лимфатических сосудов, что позволяет интимный контакт тканевых антигенов со всеми резидентами иммунных клеток в LN. Таким образом, понимание клеточного состава, распределения, местоположения и взаимодействия с помощью ex vivo всего LN изображений будет добавить к знаниям о том, как тело координирует местные и системные иммунные реакции. Этот протокол показывает стратегию визуализации ex vivo после введения виво флуоресцентных антител с меткой, что позволяет очень воспроизводимую и простую в выполнении методологии с помощью обычных конфокальных микроскопов и фондовых реагентов. С помощью подкожной инъекции антител, можно маркировать различные популяции клеток в слива ЛН, не влияя на структуры тканей, которые могут быть потенциально повреждены с помощью обычной иммунофлуоресцентной микроскопии техники.
Introduction
Лимфатические узлы (LNs) являются яйцевидными органами, широко присутствующими по всему телу с важнейшей функцией преодоления врожденных и адаптивных иммунных реакций. LNs фильтруют лимфу для того, чтобы определить посторонние частицы и раковые клетки, чтобы смонтировать иммунный ответ против них1. Антиген, представляющий клетки (APCs), Т-клетки и В-клетки работают вместе с генерацией антиген-специфических антител (гуморальный иммунитет) и цитотоксических лимфоцитов (клеточный иммунитет) для устранения посторонних частиц и раковых клеток2. Таким образом, понимание динамики иммунных клеток, присутствующих в лимфатической системе, будет иметь важные последствия для разработки вакцины и иммунотерапии рака.
Появление мощных микроскопов - в том числе новых конфокальных и супер разрешение микроскопов - позволило чрезвычайный прогресс в понимании того, как различные популяции иммунных клеток ведут себя в их родной среде3. Теперь можно изображение нескольких одновременных подтипов клеток с помощью комбинации зондов с генетически модифицированными мышами, которые выражают флуоресцентные белки под контролем конкретных целей4,5. В самом деле, высокомерные методы, в том числе массовой цитометрии и мульти-параметрического анализа потока имеют решающее значение для расширения наших знаний о различных иммунных клеток разобщенности и функциональности в области здоровья и болезни6, 7. Однако, для подготовки образцов для этих методов, ткани нуждаются в пищеварении и клетки отделены от их естественной среде для анализа в клеточных суспензий. Чтобы превзойти эти ограничения и позволить лучший перевод в биологии, цель протокола, предложенного здесь, заключается в применении простой методологии изображения ex vivo целые лимфатические узлы с помощью фондовых конфокальных микроскопов с преимуществом улучшенной скорости, ткани сохранение структуры, и жизнеспособность клеток по сравнению с обычными иммунофлуоресцентными окрашивания. Используя этот подход, мы смогли показать, что мыши не хватает для Т-клеток, подтип Т-лимфоцитов, участвующих в принимающей ранней защиты от патогенов4, имеют скомпрометированы фолликулов и Т-клеточных зон по сравнению с дикими мышами типа. Эти выводы позволили нам продолжить исследование, в котором мы показали, что Т-клетки играют важную роль в гомеостазе лимфоидных органов и гуморальный иммунный ответ4. Кроме того, этот протокол обеспечивает физиологические пути для зондов и антител для достижения лимфатических узлов, так как они управляются подкожно и рассеивать через ткани лимфатической циркуляции, опираясь на предыдущие доклады, которые используются в situ маркировки с антителами для визуализации лимфатических ассоциированных структур8,9, динамика зародышевого центра10,11,12,и цели легко доступны для кровотока13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был одобрен Постоянным комитетом по животным гарвардской медицинской школы и Бригамской женской больницы, протокол 2016N000230.
1. Мыши, используемые для эксперимента
- Используйте 8-недельных мышей мужского и женского пола на фоне B6 для администрирования смеси антител.
- Используйте CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT мышей, чтобы определить, может ли ex vivo всего LN изображения также могут быть применены к репортер умысла без введения антитела смесь, а также для расследования присутствия моноядерных клеток, в том числе антиген представления клеток и фагоцитов, и их распределение в LN.
ПРИМЕЧАНИЕ: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT репортер мышей зеленый флуоресцентный белок (GFP) и красный флуоресцентный белок (RFP) вставляется под контролем CX3CR1 и CCR2 промоутеров, соответственно. Репортер мышей могут быть использованы с или без инъекции смеси антител. Пожалуйста, смотрите ссылку4 для инъекции смеси антител в мышь репортера. Приступайке к операции, если не будет введено антитела.
2. Препарат смеси антител и инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги на мышах, описанных в шаге 1.1.
- Разбавить 1:10 блестящего фиолетового (BV) 421 анти-CD4 (GK1.5; 0,2 мг/мл), 1:10 яркого синего (BB) 515 анти-CD19 (1D3; 0,2 мг/мл) и 1:20 фикеритрина (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 мг/мл) в PBS с соответствующим окончательным объемом для введения во внутреннюю бедро (к изображение паховой) или в лапу площадку (к изображению popliteal) лимфы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование в качестве изотипов: BV421 Мышь IgG2b, k Изотип управления (R35-38; 0,2 мг/мл); PE Rat IgG2a, изотипный контроль (R35-95; 0,2 мг/мл); BB515 Крыса IgG2a, изотипный контроль (R35-95; 0,2 мг/мл). При изменении окрашивания антитела, используйте правильный изотип. - Для изображения inguinal LN, вводят 100 л смеси антител subcutaneously в внутреннее бедро(рисунок 1A). Кроме того, вводить 50 л подкожно смесь антител в лапу площадку для изображения popliteal LN (Рисунок 2A). Используйте тонкие 1 мл инсулиновых шприцев, (Инсулин U-100) с иглой размером 0,30 мм и 13 мм (30 калибровочных и 1/2 дюйма).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что инъекция для окрашивания inguinal LN является подкожной и не внутримышечной (т.е.), так как смесь антител не будет должным образом сливаться, если i.m. администрация выполняется. - Не обезврежайте животных перед инъекцией смеси антител.
- Подождите как минимум 3 ч (ангинальное dLN) и 12 ч (popliteal dLN) после инъекции для удаления органов.
- Если маркировка клеток LN не полностью наблюдается с использованием больших полимерных флуоресцентных красителей, таких как блестящий фиолетовый или блестящий синий, используйте меньшие флюорофоры, в том числе флуоресцеин изотиоцианат (FITC), ПЭ и аллофиццанин (APC) в качестве альтернативы.
3. Хирургическая процедура для удаления слива етбивья слива етбивного узла
- Эвтаназия мышей с помощью CO2 асфиксии с последующим вывихом шейки матки.
- Иммобилизованные мыши на акриловой стадии с клейкой лентой и применять минеральное масло с ватным тампоном на брюшной кожи для предотвращения осаждения меха вокруг разреза(Рисунок 1B). Удаление меха не требуется.
- Выполните разрез средней линии с использованием микрохирургии изогнутые ножницы (11,5 см) и микрохирургии изогнутые щипцы (12,5 см) в брюшной полости от лобка к процессу xiphoid(рис. 1С).
- Отмежевать мускулатуру брюшной полости от кожи(рисунок 1D).
- Сделать горизонтальные разрезы кожи в верхней и нижней части вертикальной линии разреза для создания кожи лоскуты на стороне интереса (в соответствии с стороны инъекции смеси антитела) и лоскут кожи, чтобы визуализировать лимфатический узел(рисунок 1E).
- Лента кожи лоскут на акриловой пластине(рисунок 1F).
- Удалите слив пахового лимфатического узла с помощью микрохирургии изогнутых щипц(рисунок 1F). Лимфатический узла будет выглядеть как транслюцидный, как правило, билогубный, сфера под кожей.
4. Хирургическая процедура для удаления поплавка осушение лимфатических узлов
- Эвтаназия мышей с помощью CO2 асфиксии с последующим вывихом шейки матки.
- Иммобилизованные мыши в склонном положении на акриловой стадии с клейкой лентой и нанесите минеральное масло с ватным тампоном в теленка и колене(рисунок 2A-D).
- Выполните разрез средней линии в теленка от пятки до колена(Рисунок 2E,F).
- Отмежевать мускулатуру теленка от кожи(рисунок 2F,G).
- Разоблачить popliteal ямки(Рисунок 2G). Поплитический лимфатический узло появится как транслюцидная сфера в поплитальной ямке.
- Удалите поплит лимфатический узло с помощью микрохирургии изогнутых щипцы(рисунок 2G).
- Кроме того, переверните мышь на месте на спине, и подойти к popliteal ямсы между бицепс феморис и semitendinosus для поплавка LN удаления, выполняя разрез средней линии в теленка от пятки до колена с последующим диссоциацией теленка мускулатуры из кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Popliteal ямка является мелкой депрессии, расположенной в задней части коленного сустава. Открыто тщательно, чтобы увидеть popliteal лимфатический узла.
5. Подготовка лимфатических узлов
- Поместите весь орган в культурное блюдо со стеклянным дном (35 мм х 10 мм) и удалить жир, который окружает орган с помощью микрохирургии изогнутые щипцы (Рисунок 1G-I и Рисунок 2H).
- Централизованно орган в середине блюда(рисунок 1J и рисунок 2H).
- Обложка органа с фрагментом деликатной задачи стеклоочистителей и держать его пропитанной комнатной температуры сольник 0,9% или фосфатбуферное решение(Рисунок 1K-M и Рисунок 2H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно мыть лимфатические узлы после удаления или выполнять извлечения лимфатических узлов в капюшоне.
6. Ex-vivo конфокальная микроскопия (изображение)
- Позиция чашку Петри в перевернутом слоте для конфокального микроскопа(рисунок 1N и рисунок 2H).
- Изображение LNs под конфокальный микроскоп(Рисунок 1O и Рисунок 2H).
- Во-первых, получить правильный фокус с помощью обычного света конфокального микроскопа с 4x или 10x цели. Затем перейти от функции света к лазерного режима.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если конфокальный микроскоп не содержит 4x цель, фокус может быть прекрасно полученс с помощью 10x цели. - Отрегулируйте мощность лазера, смещение и увеличение с помощью изотип-окрашенных, не окрашенных или не-флуоресцентных образец (Таблица 1) для удаления автофлюоресценции и неспецифических окрашивания от флуоресцентных этикеток антител, таких как те, которые используются в изображениях показано в этом рукопись (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 и PE anti-F4/80).
- Отрегулируйте позиции К и XY, используя микрометрические и колесницы, соответственно, на область интереса к лимфатии узла.
- Приобретайте изображения под 4x, 10x и 20x целями, ориентируясь на структуру LN и сотовую дистрибуцию. Используйте определение 1024 x 1024 пикселей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрести как минимум пять изображений в различных полях на цель на одно животное. - Анализ изображений с помощью программного обеспечения изображения для разделения каналов, добавить масштаб и цвета, представляющие интерес, и реконструировать 3D-вид.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данная рукопись показывает методы удаления паховых и поплитетовых лимфатических узлов, не повреждая их структуру после инъекции флуоресцентных антител для окрашивания конкретных клеточных популяций в этих органах (Рисунок 1 и Рисунок 2 ).
Мощное сочетание иммуномаркировки клеток LN с BV421 анти-CD4 и BB515 анти-CD19 и конфокальный анализ изображений определили локализацию Т-клеток (CD4) и В-клеток (CD19) в ингинале и поплите. В обоих органах, L-клеточные фолликулы были окружены Популяциями Т-клеток(Рисунок 3, Рисунок 4 и видео 1), отличительной чертой структуры LN1. Чтобы исключить возможность того, что фагоциты, выстилающие лимфатические пазухи, могут захватывать инъекционные флуоресцентные антитела и приводить к неспецифической маркировке клеточных маркеров, PE anti-F4/80 был включен в смесь антител. Как показано на рисунке 5, фагоциты не усвоили инъекционные антитела, указывая, что окрашивание В и Т-клеток было специфическим. Кроме того,видео 1 показывает, что T и B-клеточное окрашивание не перекрывается, подтверждая окрашивание специфичности.
Для исследования пространственной локализации фагоцитических моноядерных клеток в LN были изображены паховые и поплитые ЛН из CX3CR1GFP/' CCR2RFP/ . Моноядерные клетки были обнаружены по всему inguinal LN, в том числе субкапсулярной синус. Большинство из этих клеток были CX3CR1GFP / ,а затем CCR2RFP / и двойные положительные клетки (желтый) (Рисунок 6A-F). Такая же картина распределения клеток и фенотипов клеток наблюдалась в popliteal LN(рисунок 7A-I). Оба паховых и popliteal LNs показали черные регионы без CX3CR1GFP / CCR2RFP / ,которые заняты лимфоцитов. Кроме того, cX3CR1 и CCR2 "клетки были скудными во внутренней области LNs и сосредоточены во внешней области, что свидетельствует о том, что эти клетки в основном занимают LN субкапсулярной синус (Рисунок 6G-I и Рисунок 7J-L). Таким образом, предлагаемый протокол может четко определить основные популяции клеток, присутствующих в лимфатических узлах.
Рисунок 1: Препарат ингинальных лимфатических узлов.
(A) Подкожная инъекция мастера антител FACS смешивается во внутреннее бедро. (B) 3 ч после инъекции, эвтаназии мыши, обездвижить мышь на акриловой пластине с клейкой лентой и применять минеральное масло для брюшной кожи, чтобы предотвратить осаждение меха вокруг разреза. (C) Выполните разрез средней линии в брюшной полости от лобка к процессу xiphoid. (D) Отмежевать мускулатуру брюшной полости от кожи и сделать кожный лоскут. (E) Лента кожи-лоскут на акриловой пластине. (F) Удалить паховой лимфатический узла с помощью микрохирургии изогнутые щипцвые. (G-H) Поместите орган в блюдо культуры (G) и удалить жир, который окружает орган (H). (Я) Иллюстративная картина, показывающая размер органа после очистки. J-M) Централизованно орган в середине чашкаПетри (J ), накройте орган с куском деликатной задачи стеклоочистителей (K) и держать пропитанной теплой 0,9% солей или 1x PBS (L,M). (N) Позиция чашку Петри в слот микроскопа. (O) Сканирование органа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Подготовка поплитных лимфатических узлов.
(A, B) Подкожная инъекция мастера антител FACS смешивается в лапу площадку. (C, D) 3 ч после инъекции, эвтаназии мыши, обездвижить мышь на акриловой пластине с клейкой лентой (C) и применять минеральное масло для брюшной кожи, чтобы предотвратить осаждение меха вокруг разреза (D). (E) Выполните разрез средней линии в теленка от пятки до колена. (F) Разоблачить popliteal ямки. (G) Удалите поплит лимфатический узла с помощью микрохирургии изогнутые щипцы. (H) Поместите орган в чашку Петри и удалить жир, который окружает орган, централизовать орган в середине чашки Петри, накрыть орган с куском деликатной задачи стеклоочистителей и держать пропитанной теплым солизне 0,9% или 1x PBS. Расположите чашку Петри в слоте микроскопа и сканируете орган. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель конфокальной микроскопии изображения целых паховых лимфатических узлов неиммунизированных наивных мышей.
(A-C) LN B и T-клетки были окрашены с помощью CD4 (зеленый; Т-клетки) и CD19 (красный; B-клетки); бар масштаба 50 мкм. (D-I) Усиление конкретной области с целью 10-x; бар масштаба 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель конфокальной микроскопии изображения целых поплитных лимфатических узлов неиммунизированных наивных мышей.
(A-C) LN B и T-клетки были окрашены с помощью CD4 (зеленый; Т-клетки) и CD19 (красный; B-клетки); бар масштаба 60 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель конфокальной микроскопии изображения целого пахового лимфатического узла неиммунизированных наивных мышей с изображением фагоцитов.
(A-C) LN B и фагоцитные клетки были окрашены с помощью CD19 (зеленый; B-клетки) и F4/80 (синий; фагоциты); бар масштаба 100 мкм; (D-F) LN T и фагоцитные клетки были окрашены с помощью CD3 (зеленый; T-клетки) и F4/80 (белые; фагоциты); бар масштаба 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Конфокальная микроскопия изображений целых ингинальных лимфатических узлов генетически модифицированных CX3CR1 ГФП/З CCR2 ПФР/З мышей без антител мастер смеси инъекции.
(A-C) Распределение клеток LN оценивалось с помощью CX3CR1 (зеленый) и CCR2 (красный); бар масштаба 100 мкм. (D-F) Усиление конкретной области с целью 20-x; бар масштаба 50 мкм. (G-I) Распределение клеток LN в полу синуса лимфатического узла; бар масштаба 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Конфокальная микроскопия изображений целых поплит-лимфатических узлов генетически модифицированных CX3CR1 ГФП/З CCR2 ПФР/З мышей без антител мастер смеси инъекции.
(A-C) Распределение клеток LN оценивалось с помощью CX3CR1 (зеленый) и CCR2 (красный); бар масштаба 200 мкм. (D-F) Усиление всего органа с целью 10x; бар масштаба 100 мкм. (G-I) Усиление конкретной области с целью 20-x; бар масштаба 50 мкм. (J-L) Распределение клеток LN в полу синуса лимфатического узла; бар масштаба 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Специфика t и B-клеточного окрашивания (Правый клик для загрузки).
| Лазерный | Лазерная мощность | Получить | Смещение | Пинхол |
| 406нм | 20% | 65 | -5 | 60 м |
| 488нм | 25% | 50 | -5 | 60 м |
| 561нм | 25% | 65 | -10 | 60 м |
Таблица 1: Настройки приобретения изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сочетание изображений с другими методами, включая молекулярную биологию и высокомерную иммунофенотипирование, повысило нашу способность исследовать иммунные клетки в их родном контексте. В самом деле, в то время как другие подходы могут потребовать переваривания тканей и изоляции клеток - что может привести к потере целостности тканей - использование in vivo или ex vivo изображений предоставляет большое преимущество в расследовании различных подтипов клеток в географической моды3 , 16. Неудивительно, что доступность генетически модифицированных штаммов мыши, в которых клетки специально ориентированы на экспресс различных фторофоров, быстро растет. Важно отметить, что сочетание репортер мышей и инъекции смесь антител является мощным инструментом для пятна различных популяций клеток в-vivo в том же органе4. Кроме того, популяризация инструментов редактирования генов, таких как CRISPR/Cas9, позволила различным группам настроить свои штаммы мыши таким образом, что практически любой тип клеток теперь может быть изображен в их добросовестном месте17. Используя этот подход, пространственные и функциональные отношения между различными типами клеток могут быть оценены в глубоких деталях. Однако, если визуализация движения клетки или динамических событий in vivo не являются обязательными, можно использовать менее сложный экспериментальный подход. В этом случае антитела и зонды поставляются in vivo, а орган (или образец) непосредственно визуализирован в микроскоп.
Здесь мы описали простой протокол, который обходится использование криоконсервации тканей и криосекции, которые потенциально могут повлиять на структуры органов и позволило признательность иммунных клеток в лимфатических узлах после введения in vivo флуоресцентные антитела. Эти протоколы требовали минимальных технических и хирургических навыков и могли быть адаптированы для визуализации практически любых иммунных клеток в их первоначальном местоположении. Важно отметить, что мы предложили, что антитела должны быть введены таким образом, что они будут достигать лимфатических узлов, используя те же пути, что антигены и клетки путешествия во время иммунного ответа. Путем впрыскивать флуоресцентные антитела в подкожном пространстве, было по возможности имитировать все ткани и гемодинамические барьеры найденные in vivo и оценить хронологию рассеяния антигена. В дополнение к этому применению, этот метод может быть применен и полезным для биораспределения флуоресцентных маркировки наркотиков и клеточной ориентации исследований флуоресцентных маркировки наночастиц.
Однако этот метод имеет ограничения. Количество требуемых антител выше по сравнению с обычными методами гистологии; однако, поскольку обычная иммунофлуоресцентная микроскопия требует нескольких раундов подготовки тканей и окрашивания для того, чтобы оптимизировать технику и получить хорошие изображения, стоимость обычной микроскопии потенциально может преодолеть стоимость высокой концентрация антител, используемых в нашем протоколе. Далее, на основе известных свойств лимфатического антигена дренажа в лимфатический узел9,18, эффективность маркировки, вероятно, быстро снизится с расстоянием до лимфатических сосуды из-за размера маркировки реагента Работает. Действительно, черные области в некоторых изображениях могут возникнуть в результате плохого проникновения тканей. Только 40-100 мкм в глубину может быть достигнуто с конфокальной визуализации LN, и, таким образом, только поверхностные lN регионов могут быть визуализированы. Один из способов, по крайней мере частично преодолеть эту проблему заключается в использовании фторофоров с лучшим возбуждением и обнаружением микроскопом. Другой альтернативный подход заключается в использовании многофотонных лазерной микроскопии с ближней инфракрасной длиной волн возбуждения, которая была ключом к глубокой визуализации тканей и было показано, чтобы обойти серьезные проблемы рассеяния света наблюдается с конфоковой одного фотона лазера микроскопия19. В случае клеток изображения окрашенных антителами, которые были доставлены в vivo, только антигены, которые выражаются на поверхности клетки могут быть направлены. Если используемые антитела еще не были проверены, становится критическим для выполнения соответствующего изотипа управления окрашивания, чтобы исключить автофлуоресценции и проверить маркировки. Это может быть выполнено в том же животном, т.е. клетки ориентации антитела смесь вводили ipsilaterally и изотип контроля смеси вводят контратерально. Кроме того, количество антител, необходимых для эффективного пятна клетки in vivo может варьироваться между экспериментами и клеточных линий и альтернативный подход для этого ограничения заключается в использовании генетически ориентированных флуоресценции выражение.
В заключение, мы предлагаем новый протокол для всего лимфатических узлов изображения, которая поддерживает ткани архитектурной целостности, воспроизводимый, простой в исполнении и использовать обычные конфокальные микроскопы. Этот метод демонстрирует, как простые методы могут позволить регулярным лабораторным структурам работать в качестве полифункциональных платформ, которые позволяют значительное продвижение в исследовании иммунной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH (R01 AI43458 в H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
