Summary
Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.
Abstract
Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.
Introduction
Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas1. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas2. Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no sistema linfático terá implicações importantes para o desenvolvimento da vacina e a imunoterapia do câncer.
O advento de microscópios poderosos-incluindo novos microscópios confocais e de super resolução-permitiu um avanço extraordinário na compreensão de como diferentes populações de células imunes se comportam em seu ambiente nativo3. Agora é possível a imagem de vários subtipos de células simultâneas usando uma combinação de sondas com camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas fluorescentes controle de alvos específicos4,5. De fato, técnicas de alta dimensão, incluindo citometria de massas e análise de fluxo Multiparamétrico, têm sido cruciais para ampliar nosso conhecimento sobre diferentes compartimentos e funcionalidades da célula imune na saúde e na doença6, 7. no entanto, para preparar amostras para estas técnicas, os tecidos necessitam de digestão e as células são separadas do seu ambiente natural para serem analisadas em suspensões celulares. Para superar essas limitações e permitir uma melhor tradução em biologia, o objetivo do protocolo proposto aqui é aplicar uma metodologia direta para a imagem de linfonodos inteiros ex vivo usando microscópios confocais de estoque com o benefício de velocidade melhorada, tecido preservação da estrutura, e viabilidade da pilha comparada à mancha convencional da imunofluorescência. Usando esta aproximação, nós pudemos mostrar que os ratos deficientes para as pilhas de ltγδ T, um SubType do linfócito de T envolvidos na defesa adiantada do anfitrião de encontro aos micróbios patogénicos4, têm os folículos comprometidos e as zonas da pilha de t em comparação aos ratos selvagens do tipo. Estes resultados permitiram que nós prosseguisse um estudo em que nós demonstramos que as pilhas de ltγδ T jogam um papel crítico na homeostase de órgãos lymphoid e da resposta imune humoral4. Além disso, este protocolo fornece um caminho fisiológico para sondas e anticorpos para alcançar o linfonodo, como eles são administrados por via subcutânea e dissipar-se através da circulação linfática do tecido, com base em relatos prévios que utilizaram a rotulagem in situ com anticorpos para visualizar as estruturas linfáticas-associadas8,9, adinâmica do centro germinais10,11,12, e alvos prontamente acessíveis ao fluxo sanguíneo13 ,14,15.
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Protocol
O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230.
1. camundongos utilizados para o experimento
- Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo.
- Use camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem administrar a mistura do anticorpo assim como para investigar a presença de pilhas mononucleares, incluindo o antígeno que apresenta células e fagócitos, e sua distribuição no LN.
Nota: os camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter têm proteína fluorescente verde (GFP) e proteína vermelha fluorescente (RFP) inseridas o controle dos promotores CX3CR1 e CCR2, respectivamente. Os ratos do repórter podem ser usados com ou sem a injeção da mistura do anticorpo. Veja por favor a referência4 para a injeção da mistura do anticorpo em um rato do repórter. Prossiga para a cirurgia se nenhum anticorpo será injetado.
2. preparação e injeção da mistura do anticorpo
Nota: efectue estes passos em ratos descritos no passo 1,1.
- Diluir 1:10 de violeta brilhante (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brilhante (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0,2 mg/ml) e 1:20 de ficoeritrina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) em PBS com o volume final apropriado para injetar na coxa interna (para imagem inguinal) ou na pata Pad (para imagem popliteal) linfática.
Nota: use como isotypes: BV421 mouse IgG2b, k controle isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ controle isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL). Se alterar o anticorpo de coloração, use o isotipo correto. - Para a imagem ln inguinal, injete 100 μl da mistura de anticorpos por via subcutânea na coxa interna (Figura 1a). Alternativamente, injete 50 μL por via subcutânea da mistura do anticorpo no coxim da pata à imagem poplítea LN (Figura 2a). Use delicadas 1 mL de seringas de insulina, (insulina U-100) com a agulha de tamanho 0,30 mm × 13 mm (30 Gauge × 1/2 polegada).
Nota: Assegure-se de que a injeção para coloração inguinal do LN seja subcutânea e não intramuscular (IM), pois a mistura de anticorpos não será drenada corretamente se a administração por via intramuscular for realizada. - Não anestesiar animais antes da injecção de mistura de anticorpos.
- Aguarde um mínimo de 3 h (dLN inguinal) e 12 h (dLN popliteal) pós-injecção para remover os órgãos.
- Se a rotulagem de células LN não for completamente observada usando grandes corantes fluorescentes de polímero, como violeta brilhante ou azul brilhante, use fluoróforos menores, incluindo isotiocianato de fluoresceina (FITC), PE e alfiscocianina (APC) como alternativa.
3. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem inguinal
- Eutanizar camundongos usando CO2 asfixia seguido de luxação cervical.
- Imobilize os camundongos na fase acrílica com fita adesiva e aplique óleo mineral com um cotonete na pele abdominal para evitar a deposição de peles ao redor da incisão (Figura 1b). A remoção da pele não é necessária.
- Realize uma incisão na linha média usando Microcirurgia de tesoura curvada (11,5 cm) e fórceps curvo microcirúrgico (12,5 cm) no abdômen do púis ao processo xifóide (Figura 1C).
- Dissociar a musculatura abdominal da pele (Figura 1D).
- Faça incisões cutâneas horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical para criar retalhos de pele no lado do interesse (de acordo com o lado da injeção de mistura de anticorpos) e bata a pele para visualizar o linfonodo (Figura 1e).
- Tape a aba da pele na placa acrílica (Figura 1F).
- Remover o linfonodo de drenagem inguinal usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1F). O linfonodo aparecerá como uma esfera translúcida, geralmente bilobular, a pele.
4. procedimento cirúrgico para remover o linfonodo de drenagem poplítea
- Eutanizar camundongos usando CO2 asfixia seguido de luxação cervical.
- Imobilize os camundongos em posição propensa no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral com cotonete na panturrilha e joelho (Figura 2a-D).
- Realize uma incisão na linha média na panturrilha do calcanhar até o joelho (Figura 2E, F).
- Dissociar a musculatura da panturrilha da pele (Figura 2F, G).
- Expor a fossa poplítea (Figura 2G). O linfonodo poplíteo aparecerá como uma esfera translúcida na fossa poplítea.
- Remover o linfonodo poplíteo usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 2G).
- Alternativamente, gire o rato sobre na posição supina, e aproxime a fossa poplítea entre o bíceps femoral e o semitendíneo para a remoção poplítea do ln realizando uma incisão do midline na vitela do salto ao joelho seguida pela dissociação da vitela musculatura da pele.
Nota: a fossa poplítea é uma depressão rasa localizada na parte de trás da articulação do joelho. Abra com cuidado para ver o linfonodo poplíteo.
5. preparação do linfonodo
- Coloque todo o órgão em um prato de cultura com fundo de vidro (35 mm x 10 mm) e retire a gordura que rodeia o órgão usando fórceps curvo microcirurgia (Figura 1G-I e Figura 2h).
- Centralize o órgão no meio do prato (Figura 1J e Figura 2h).
- Cubra o órgão com um fragmento de limpadores de tarefas delicadas e mantenha-o embebido com a temperatura ambiente salina 0,9% ou solução tampão fosfato (Figura 1K-M e Figura 2h).
Nota: não é necessário lavar os gânglios linfáticos após a remoção ou para realizar a extração do linfonodo no capô.
6. microscopia confocal ex-vivo (Imaging)
- Posicione o prato de Petri na ranhura do microscópio confocal invertido (Figura 1N e Figura 2h).
- Imagem LNs um microscópio confocal (Figura 1o e Figura 2h).
- Primeiramente, obtenha o foco correto usando a luz convencional do microscópio confocal com o objetivo 4x ou 10x. Em seguida, mude da função de luz para o modo de laser.
Nota: se o microscópio confocal não contiver um objetivo de 4x, o foco pode perfeitamente ser obtido usando o objetivo 10x. - Ajuste o poder do laser, o offset e o ganho usando uma amostra isotipo-manchada, não-manchada ou não-fluorescente (tabela 1) para remover o autofluorescence e a mancha inespecífica dos anticorpos fluorescente-etiquetados tais como esses usados nas imagens mostradas neste manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 e PE anti-F4/80).
- Ajuste as posições Z e XY , utilizando a micrométrica e a carruagem, respectivamente, na área de interesse no linfonodo.
- Adquira imagens com objetivos de 4x, 10x e 20x com foco na estrutura do LN e na distribuição celular. Use a definição 1024 x 1024-pixel.
Nota: Adquira um mínimo de cinco imagens em diferentes campos por objetivo por animal. - Analise imagens usando um software de imagem para separar canais, adicionar escala e cores de interesse, e para reconstruir a vista 3D.
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Representative Results
Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ).
A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de pilhas de B (CD19 +) em LNS inguinal e poplítea. Em ambos os órgãos, os folículos de células B foram cercados por populações de células T (Figura 3, Figura 4 e vídeo 1), uma marca registrada da estrutura do ln1. Para excluir a possibilidade de que os fagócitos que revestem os seios linfáticos pudessem captar os anticorpos fluorescentes injetados e resultar em rotulagem não específica de marcadores celulares, o PE anti-F4/80 foi incluído na mistura de anticorpos. Como mostrado na Figura 5, os fagócitos não internalizam anticorpos injetados, indicando que a coloração das células B e T foi específica. Além disso, o vídeo 1 mostra que a coloração das células T e B não se sobrepõem, confirmando a especificidade da coloração.
Para investigar a localização espacial de células mononucleares fagocíticas no LN, as LNs inguinal e poplítea de CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+ foram fotografadas. As pilhas mononuclear foram encontradas durante todo o LN inguinal, incluindo a cavidade subcapsular. A maioria dessas células foi de CX3CR1GFP/+, seguida de CCR2RFP/+ e células duplas positivas (amarelo) (Figura 6A-F). O mesmo padrão de distribuição celular e fenótipos de células foi observado no LN poplíteo (Figura 7A-I). Os LNS inguinal e poplítea mostraram regiões pretas sem CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, que são ocupados por linfócitos. Além disso, as células CX3CR1 + e CCR2 + foram escassas na área interna dos LNs e concentradas na área externa, indicando que essas células ocupam principalmente o seio subcapsular LN (Figura 6G-I e Figura 7J-L). Assim, o protocolo proposto pode definir claramente as principais populações de células presentes nos linfonodos.
Figura 1: preparação do linfonodo inguinal.
(A) injeção subcutânea de mistura mestre de anticorpos FACS na coxa interna. (B) 3 h após a injeção, eutanizar o rato, imobilizar o rato sobre uma placa acrílica com fita adesiva e aplicar óleo mineral na pele abdominal para evitar a deposição de peles ao redor da incisão. (C) realizar uma incisão na linha média no abdômen a partir do púbis para o processo xiphoide. (D) dissociar a musculatura abdominal da pele e fazer um retalho cutâneo. (E) Tape a pele-retalho na placa acrílica. (F) remover o linfonodo inguinal usando um fórceps curvo de microcirurgia. (G-H) Coloque o órgão em um prato de cultura (G) e retire a gordura que circunda o órgão (H). (I) retrato ilustrativo que mostra o tamanho do órgão após a limpeza. J-M) Centralize o órgão no meio de uma placa de Petri (j), cubra o órgão com uma parte de limpadores delicados da tarefa (K) e sustento embebido com o soro fisiológico morno de 0,9% ou o 1X PBS (L, M). (N) Posicione o prato de Petri na ranhura do microscópio. (O) digitalizar o órgão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preparação do linfonodo poplíteo.
(A, B) Injeção subcutânea de mistura de mestre de anticorpos FACS na almofada da pata. (C, D) 3 h após a injeção, eutanizar o rato, imobilizar o rato sobre uma placa acrílica com fita adesiva (c) e aplicar óleo mineral na pele abdominal para evitar a deposição de peles ao redor da incisão (D). (E) realize uma incisão na linha média na panturrilha do calcanhar até o joelho. (F) expor a fossa poplítea. (G) remover o linfonodo poplíteo usando fórceps curvo microcirurgia. (H) Coloque o órgão em uma placa de Petri e retire a gordura que circunda o órgão, centralizar o órgão no meio da placa de Petri, cubra o órgão com uma parte de limpadores delicados da tarefa e sustento embebido com soro fisiológico morno 0,9% ou 1X PBS. Posicione a placa de Petri na ranhura do microscópio e escaneie o órgão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens representativas da microscopia confocal de linfonodos inguinais inteiros de camundongos ingênuos não imunizados.
(A-C) As células LN B e T foram coradas usando CD4 (verde; Células T) e CD19 (vermelho; Células B); barra de escala = 50 μm. (D-I) Amplificação de área específica com objetivo de 10x; barra de escala = 30 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens representativas da microscopia confocal de linfonodos poplíteo inteiros de camundongos ingênuos não imunizados.
(A-C) As células LN B e T foram coradas usando CD4 (verde; Células T) e CD19 (vermelho; Células B); barra de escala = 60 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens representativas da microscopia confocal de linfonodos inguinais inteiros de camundongos ingênuos não imunizados mostrando fagócitos.
(A-C) O LN B e as células fagocíticas foram corados usando CD19 (verde; Células B) e F4/80 (azul; fagócitos); barra de escala = 100 μm; (D-F) LN T e células fagocíticas foram coradas usando CD3 (verde; Células T) e F4/80 (branco; fagocitos); barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: imagens de microscopia confocal de linfonodos inguinais inteiros de CX3CR1 geneticamente modificados GFP/+ CCR2 RFP/+ camundongos sem injeção de mistura mestre de anticorpos.
(A-C) A distribuição da célula LN foi avaliada com CX3CR1 (verde) e CCR2 (vermelho); barra de escala = 100 μm. (D-F) Amplificação de área específica com objetivo de 20x; barra de escala = 50 μm. (G-I) Distribuição de células LN no assoalho do seio linfonodal; barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: imagens de microscopia confocal de linfonodos popliteais inteiros de CX3CR1 geneticamente modificados GFP/+ CCR2 RFP/+ camundongos sem injeção de mistura mestre de anticorpos.
(A-C) A distribuição da célula LN foi avaliada com CX3CR1 (verde) e CCR2 (vermelho); barra de escala = 200 μm. (D-F) Amplificação de órgão inteiro com objetivo de 10x; barra de escala = 100 μm. (G-I) Amplificação de área específica com objetivo de 20x; barra de escala = 50 μm. (J-L) Distribuição de células LN no assoalho do seio linfonodal; barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: a especificidade da coloração das células T e B (Clique direito para baixar).
| Laser | Poder do laser | Ganhar | Deslocamento | Pinhole |
| 406nm | 20 | 65 | -5 minutos | 60μm |
| 488nm | 25 | 50 | -5 minutos | 60μm |
| 561nm | 25 | 65 | -10 | 60μm |
Tabela 1: configurações de aquisição de imagem.
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Discussion
A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica3 , 16. não é surpreendente que a disponibilidade de estirpes de rato geneticamente modificados em que as células são especificamente destinadas a expressar diferentes fluoróforos está a aumentar rapidamente. Importante, a combinação de ratos do repórter e a injeção da mistura do anticorpo são uma ferramenta poderosa para manchar as populações diferentes da pilha in-vivo no mesmo órgão4. Além disso, a popularização de ferramentas de edição de genes como CRISPR/Cas9 permitiu que diferentes grupos personalizem suas cepas de mouse de uma forma que virtualmente qualquer tipo de célula pode ser agora imaged em sua localização de bona fide17. Usando essa abordagem, a relação espacial e funcional entre diferentes tipos de células pode ser avaliada em detalhes profundos. Entretanto, se a imagem latente do movimento da pilha ou de eventos dinâmicos in vivo não é obrigatória, uma aproximação experimental menos complexa pode ser usada. Neste caso, os anticorpos e as pontas de prova são entregados in vivo, e o órgão (ou uma amostra) é visualizado diretamente no microscópio.
Aqui nós descrevemos um protocolo direto que dispensou o uso da criopreservação e do criossecção do tecido que pode potencial afetar estruturas do órgão e permitiu a apreciação das pilhas imunes dentro dos nós de linfa que seguem in vivo a administração de anticorpos com rótulo fluorescente. Estes protocolos exigiram habilidades técnicas e cirúrgicas mínimas e podiam ser adaptados para visualizar virtualmente todas as pilhas imunes em sua posição original. Importante, nós propor que os anticorpos devem ser administrados em uma maneira que alcancem os nós de linfa usando as mesmas vias que os antígenos e as pilhas viajam durante uma resposta imune. Ao injetar anticorpos fluorescentes no espaço subcutâneo, foi possível imitar todos os tecidos e barreiras hemodinâmicas encontradas in vivo e estimar a cronologia da dissipação do antígeno. Além desta aplicação, este método poderia ser aplicado e útil para a biodistribuição de drogas fluorescentes-etiquetadas e de estudos Cell-Targeting de nanopartículas fluorescente-etiquetadas.
No entanto, há limitações para esse método. A quantidade de anticorpo exigida é mais elevada comparada aos métodos convencionais da histologia; no entanto, uma vez que a microscopia de imunofluorescência convencional requer várias rodadas de preparo e coloração do tecido, a fim de otimizar a técnica e obter boas imagens, o custo da microscopia convencional pode potencialmente superar o custo da alta concentração de anticorpos empregado no nosso protocolo. Em seguida, com base nas propriedades conhecidas da drenagem do antígeno linfático no linfonodo9,18, a eficiência da rotulagem é susceptível de diminuir rapidamente com a distância para a vasculatura linfática devido ao tamanho do reagente de rotulagem Empregado. Certamente, as áreas pretas em algumas das imagens podem resultar da penetração pobre do tecido. Somente 40-100 μm em profundidade podem ser alcançados com a imagem latente confocal do LN, e assim somente as regiões superficiais de LN podem ser visualizadas. Uma maneira de, pelo menos parcialmente superar esta questão é usar fluoróforos com melhor excitação e detecção pelo microscópio. Uma outra aproximação alternativa é usar a microscopia do laser do multifotônica com o comprimento de onda near-infrared da excitação que foi chave à imagem latente profunda do tecido e foi mostrado para contornar as edições de espalhamento claras severas observadas com o único laser confocal do fóton a microscopia19. No caso de células de imagem manchadas por anticorpos que foram entregues in vivo, apenas antígenos que são expressos na superfície celular podem ser direcionados. Se os anticorpos usados não foram validados ainda, torna-se crítico executar um controle de isotipo correspondente que mancha para excluir o autofluorescence e para validar a rotulagem. Isso pode ser realizado no mesmo animal, ou seja, a mistura de anticorpos de segmentação celular injetada ipsilateralmente e mistura de controle isotipo injetado contralateralmente. Além, a quantidade de anticorpo necessário para manchar eficientemente uma pilha in vivo pode variar entre experiências e linhas de pilha e uma aproximação alternativa para esta limitação é usar a expressão genética-alvejada da fluorescência.
Em conclusão, nós propor um protocolo novo para a imagem latente inteira do nó de linfa que mantem a integridade arquitectónica do tecido, é reprodutível, fácil-à-executa e usa microscópios confocal convencionais. Essa técnica demonstra como métodos simples podem permitir que estruturas laboratoriais regulares funcionem como plataformas poli-funcionais que possibilitam grandes avanços na investigação do sistema imunológico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01 AI43458 para H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
