Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for å bilde forskjellige celle populasjoner i drenering lymfeknuter uten endringer i organ strukturen.
Abstract
Lymfeknuter (LNs) er organer spredt i kroppen, der de medfødte immunresponser kan koble med adaptive immunitet. Faktisk LNs er strategisk interposed i banen av lymfesystemet fartøy, slik intim kontakt av vev antigener med alle bosatt immunceller i LN. Således, forståelse det cellular komposisjonen, distribusjon, plasseringen og vekselvirkningen benytter ex vivo hele LN tenkelig ville legge til kunnskapen opp på hvor kroppen koordinater innenbys og systemisk immun svar. Denne protokollen viser en ex vivo avbildnings strategi etter en in vivo-administrasjon av fluorescerende-merkede antistoffer som tillater en svært reproduserbar og enkel å utføre metodikk ved hjelp av konvensjonelle konfokalmikroskopi mikroskop og lager reagenser. Gjennom subkutan injeksjon av antistoffer, er det mulig å merke forskjellige celle populasjoner i drenering LNs uten å påvirke vev strukturer som kan potensielt skades av en konvensjonell immunofluorescence mikroskopi teknikk.
Introduction
Lymfeknuter (LNs) er ovale-formede organer allment tilstede i hele kroppen med den avgjørende funksjon av å bygge bro over medfødte og adaptive immunresponser. LNs filtrere lymfe for å identifisere fremmede partikler og kreftceller for å montere en immunrespons mot dem1. Antigen presentere celler (APCs), T-celler og B-celler arbeide sammen for å generere antigen-spesifikke antistoffer (humoral immunitet) og cytotoksisk lymfocytter (cellulær immunitet) for å eliminere de fremmede partikler og kreftceller2. Dermed forstå dynamikken i immunceller til stede i lymfesystemet vil ha viktige implikasjoner for vaksinen utvikling og kreft immunterapi.
Ankomsten av kraftige mikroskop-inkludert nye konfokalmikroskopi og super oppløsning mikroskop-har tillatt en ekstraordinær fremgang i å forstå hvordan ulike immun celle populasjoner oppfører seg i sitt eget miljø3. Det er nå mulig å avbilde flere samtidige celle under typer ved hjelp av en kombinasjon av sonder med genmodifiserte mus som uttrykker fluorescerende proteiner under kontroll av konkrete mål4,5. Faktisk, høy dimensjonal teknikker, inkludert masse flowcytometri og multi-parametrisk flyt analyse har vært avgjørende for å utvide vår kunnskap om ulike immun celle compartmentalization og funksjonalitet i helse og sykdom6, 7. men for å forberede prøvene for disse teknikkene, trenger vev fordøyelse og celler er adskilt fra sitt naturlige miljø for å bli analysert i celle suspensjoner. Å overgå disse begrensningene og tillate en bedre oversettelse i biologi, målet for protokollen foreslås her er å bruke en grei metodikk til bilde ex vivo hele lymfeknuter ved hjelp av lager konfokalmikroskopi mikroskop med fordel for forbedret hastighet, vev strukturbevaring, og celle levedyktighet i forhold til den konvensjonelle immunofluorescence farging. Ved å bruke denne tilnærmingen, var vi i stand til å vise at mus mangelfull for γδ T-celler, en under type av T-lymfocytter involvert i vert tidlig forsvar mot patogener4, har kompromittert sekker og T celle soner sammenlignet med vill type mus. Disse funnene tillot oss å forfølge en studie der vi viste at γδ T-celler spiller en avgjørende rolle i homeostase av lymfoide organer og humoral immunrespons4. Videre gir denne protokollen en fysiologiske vei for sonder og antistoffer for å nå lymfeknuter, som de administreres subkutant og spre gjennom vev lymfatisk sirkulasjon, bygge på tidligere rapporter som brukes in situ merking med antistoffer for å visualisere lymfatisk tilknyttede strukturer8,9, Germinal Center Dynamics10,11,12, og mål lett tilgjengelig for blodstrøm13 ,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble godkjent av den stående komité for dyr ved Harvard Medical School og Brigham og Women ' s Hospital, protokoll 2016N000230.
1. mus som brukes til eksperimentet
- Bruk 8-ukers gamle mannlige og kvinnelige mus på B6 bakgrunnen for å administrere antistoff mix.
- Bruk CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT mus for å avgjøre om ex vivo hele ln Imaging kan også brukes til reporter mus uten å administrere antistoff Mix samt å undersøke tilstedeværelsen av mononukleære celler, inkludert antigen presentere celler og phagocytes, og deres fordeling i LN.
Merk: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter mus har grønt fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RFP) satt inn under kontroll av CX3CR1 og CCR2 arrangører, henholdsvis. Reporter mus kan brukes med eller uten injeksjon av antistoff mix. Se referanse4 for antistoff blanding injeksjon i en reporter mus. Fortsett til kirurgi hvis ingen antistoff vil bli injisert.
2. antistoff blanding forberedelse og injeksjon
Merk: Utfør disse trinnene på mus som beskrevet i trinn 1,1.
- Fortynne 1:10 brilliant fiolett (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 av strålende blå (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) og 1:20 av fykoerytrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) i PBS med riktig slutt volum å injisere i indre lår (for å bilde lysken) eller inn i labben puten (til bildet popliteal) lymfe.
Merk: Bruk som isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k isotype kontroll (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, ĸ isotype Control (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, ĸ isotype kontroll (R35; 0,2 mg/mL). Hvis du endrer farge antistoff, bruk riktig isotype. - Til bilde lysken LN, Injiser 100 μL av antistoff blandingen subkutant i det indre låret (figur 1a). Alternativt kan du injisere 50 μL subkutant av antistoff blandes inn i labb puten til bilde popliteal LN (figur 2a). Bruk delikate 1 mL insulin sprøyter, (insulin U-100) med nålen på størrelse 0,30 mm × 13 mm (30 Gauge × 1/2 tommer).
Merk: Pass på at injeksjonen for lysken LN-farging er subkutan og ikke intramuskulær (IM), ettersom antistoff miks ikke blir skikkelig tømt hvis im administrering utføres. - Ikke bedøve dyr før antistoff blanding injeksjon.
- Vent til minimum 3 h (lysken om) og 12 h (popliteal om) etter injeksjon for å fjerne organene.
- Hvis LN cellemerking ikke er fullstendig observert ved hjelp av store polymer fluorescerende fargestoffer som briljant fiolett eller strålende blå, bruker mindre fluorophores, inkludert fluorescein isothiocyanate (FITC), PE og allofykocyanin (APC) som et alternativ.
3. kirurgi prosedyre for å fjerne lysken drenering lymfeknuter
- Euthanize mus bruker CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning.
- Nakkens mus på akryl scenen med teip og påfør mineralolje med en bomullspinne til mage huden for å hindre pels deponering rundt snittet (figur 1B). Pels fjerning er ikke nødvendig.
- Utfør et midtlinjen snitt ved hjelp av mikrokirurgi buet saks (11,5 cm) og mikrokirurgi buet tang (12,5 cm) i buken fra pubis til xiphoid prosessen (figur 1C).
- Distansere magemusklene fra huden (figur 1d).
- Lag horisontale hud snitt på toppen og bunnen av den vertikale snittlinjen for å lage hud klaffer på siden av interesse (i henhold til siden av antistoff Mix injeksjon) og klaff huden for å visualisere lymfeknuter (figur 1e).
- Tape huden-klaff på akryl plate (figur 1F).
- Fjern lysken drenering lymfeknuter ved hjelp av mikrokirurgi buet tang (figur 1F). Lymfeknuter vises som en gjennomsiktig, vanligvis bilobular, sfære under huden.
4. kirurgi prosedyre for å fjerne popliteal drenering lymfeknuter
- Euthanize mus bruker CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning.
- Nakkens mus på en utsatt posisjon på akryl scene med teip og påfør mineralolje med en bomullsdott i leggen og kneet (figur 2a-D).
- Utfør et midtlinjen snitt i leggen fra hælen til kneet (figur 2E, F).
- Distansere kalven muskulaturen fra huden (figur 2F, G).
- Utsett popliteal Fossa (figur 2g). Popliteal lymfeknuter vises som en gjennomsiktig sfære i popliteal Fossa.
- Fjern popliteal lymfeknuter ved hjelp av mikrokirurgi buet tang (figur 2g).
- Alternativt, omdreining musa over opp på liggende holdning, og adgang det popliteal Fossa imellom biceps femoris og semitendinosus for popliteal LN flytting av utføre en midtlinjen innsnitt inne det kalv fra hælen å det kne føle etter av dissosiasjon av det kalv muskulaturen fra huden.
Merk: popliteal Fossa er en grunn depresjon som ligger på baksiden av kneleddet. Åpne nøye for å se den popliteal lymfe noden.
5. fremstilling av lymfeknuter
- Plasser hele orgelet i en kultur rett med glassbunn (35 mm x 10 mm) og fjern fettet som omgir orgelet ved hjelp av mikrokirurgi buet tang (figur 1G-I og figur 2h).
- Sentralisere orgelet i midten av fatet (figur 1j og figur 2h).
- Dekk orgelet med et fragment av delikat oppgave kluter og holde den fuktet med romtemperatur saltvann 0,9% eller fosfat buffer løsning (figur 1km og figur 2h).
Merk: det er ikke nødvendig å vaske lymfeknuter etter fjerning eller for å utføre lymfeknuter utvinning i panseret.
6. ex-vivo konfokalmikroskopi mikroskopi (Imaging)
- Plasser Petri parabolen i den omvendte konfokalmikroskopi mikroskop sporet (figur 1N og figur 2h).
- Bilde LNs under et konfokalmikroskopi mikroskop (figur 1o og fig. 2h).
- Først, få riktig fokus ved hjelp av konvensjonelle lys av konfokalmikroskopi mikroskop med 4X eller 10x objektiv. Deretter skifter du fra lys funksjonen til laser modus.
Merk: Hvis det konfokalmikroskopi mikroskopet ikke inneholder et 4X objektiv, kan fokuset oppnås perfekt ved hjelp av 10x-objektiv. - Juster laser effekt, offset og gevinst ved hjelp av en isotype, ikke-farget eller ikke-fluorescerende prøve (tabell 1) for å fjerne autofluorescence og løs flekker fra fluorescerende-merket antistoffer som de som brukes i bildene som ble vist i denne manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 og PE anti-F4/80).
- Juster Z og XY posisjoner, ved hjelp av micrometric og Chariot, henholdsvis på området av interesse i lymfe noden.
- Skaff deg bilder under 4X, 10x og 20x mål med fokus på LN struktur og cellulær distribusjon. Bruk 1024 x 1024-piksel definisjon.
Merk: Skaff deg minimum fem bilder i ulike felt per mål per dyr. - Analyser bilder ved hjelp av et bildeprogramvare for å skille kanaler, legge til skala og farger av interesse, og å rekonstruere 3D-visning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette manuskriptet viser teknikker for å fjerne lysken og popliteal lymfeknuter uten å skade deres struktur etter injeksjon av fluorescerende-merket antistoffer for å flekk spesifikke celle populasjoner i disse organene (figur 1 og figur 2 ).
Den kraftige kombinasjonen av immunolabeling av LN celler med BV421 anti-CD4 og BB515 anti-CD19 og konfokalmikroskopi Imaging analyse definert lokalisering av T-celler (CD4 +) og B-celler (CD19 +) i lysken og popliteal LNs. I begge organene, B celle sekker var omgitt av T celle populasjoner (Figur 3, Figur 4 og Video 1), et kjennetegn på ln struktur1. For å utelukke muligheten for at phagocytes lining de lymfatisk bihulene kunne fange injisert fluorescerende antistoffer og resultere i ikke-spesifikk merking av celle markører, PE anti-F4/80 ble inkludert i antistoff mix. Som vist i figur 5har phagocytes ikke blitt injisert antistoffer, noe som tyder på at B og T celle farging var spesifikk. Videre viserVideo 1 at T og B celle farging ikke overlapper, bekrefter farging spesifisitet.
For å undersøke den romlige lokalisering av phagocytic mononukleære celler i LN, lysken og popliteal LNs fra CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+ ble avbildet. Mononukleære celler ble funnet i hele lysken LN, inkludert subcapsular sinus. De fleste av disse cellene var CX3CR1GFP/+, ETTERFULGT av CCR2RFP/+ og doble positive celler (gul) (figur 6A-F). Det samme mønsteret av celle distribusjon og celle fenotyper ble observert i popliteal LN (figur 7A-i). Både lysken og popliteal LNs viste svarte områder uten CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, som er okkupert av lymfocytter. Videre var CX3CR1 + og CCR2 + celler knappe i det indre området av LNs og konsentrert i ytter området, noe som indikerer at disse cellene primært opptar LN subcapsular sinus (figur 6G-I og figur 7J-L). Dermed kan den foreslåtte protokollen klart definere store celle populasjoner stede i lymfeknuter.
Figur 1: lysken lymfe-node forberedelse.
(A) subkutan INJEKSJON av FACS antistoff Master Mix inn i indre lår. (B) 3 h etter injeksjonen, euthanize musen, nakkens musen på en akryl plate med teip og påfør mineralolje til mage huden for å hindre pels deponering rundt snittet. (C) utføre et midtlinjen snitt i buken fra pubis til xiphoid prosessen. (D) distansere magemusklene fra huden og gjøre en hud-klaff. (E) tape Skin-klaff på akryl plate. (F) fjerne lysken lymfeknuter ved hjelp av en mikrokirurgi buet tang. (G-H) Plasser orgelet i en kultur rett (G) og fjern fettet som omgir orgelet (H). (I) illustrerende bilde som viser orgel størrelsen etter rengjøring. J-M) sentralisere orgelet i midten av en Petri parabol (J), dekke orgelet med et stykke delikat oppgave kluter (K) og holde dynket med varme 0,9% saltvann eller 1x PBS (L, M). (N) plasser Petri-parabolen i mikroskop sporet. (O) Skann orgelet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: popliteal-forberedelse av lymfeknuter.
(A, B) Subkutan injeksjon av FACS antistoff Master Mix inn i labben puten. (C, D) 3 h etter injeksjonen, euthanize musen, nakkens musen på en akryl plate med teip (c) og påfør mineralolje til abdominal hud for å hindre pels deponering rundt snittet (D). (E) utføre et midtlinjen snitt i leggen fra hælen til kneet. (F) utsett popliteal Fossa. (G) fjerne popliteal lymfe noden ved hjelp av mikrokirurgi-buet tang. (H) plasser orgelet i en Petri parabol og fjerne fettet som omgir orgelet, sentralisere orgelet i midten av Petri parabolen, dekke orgelet med et stykke delikat oppgave kluter og holde gjennomvåt med varmt saltvann 0,9% eller 1x PBS. Plasser Petri-fatet i sporet på mikroskopet og Skann orgelet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av hele lysken lymfeknuter av ikke-vaksineres naive mus.
(A-C) LN B og T celler ble farget ved hjelp av CD4 (grønn; T-celler) og CD19 (rød; B-celler); skala bar = 50 μm. (D-I) Forsterkning av bestemt område med 10x objektiv; vektstang = 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av hele popliteal lymfeknuter av ikke-vaksineres naive mus.
(A-C) LN B og T celler ble farget ved hjelp av CD4 (grønn; T-celler) og CD19 (rød; B-celler); skala bar = 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av hele lysken lymfe node av ikke-vaksineres naive mus viser phagocytes.
(A-C) LN B og phagocytic celler ble farget med CD19 (grønn; B-celler) og F4/80 (blå; phagocytes); skala bar = 100 μm; (D-F) LN T og phagocytic celler ble farget med CD3 (grønn; T-celler) og F4/80 (hvit; phagocytes); skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av hele lysken lymfeknuter av genetisk MODIFISERTE CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ mus uten antistoff Master Mix injeksjon.
(A-C) LN celle distribusjon ble evaluert med CX3CR1 (grønn) og CCR2 (rød); skala bar = 100 μm. (D-F) Forsterkning av bestemt område med 20x objektiv; skala bar = 50 μm. (G-I) LN celle distribusjon i lymfe noden sinus gulvet; skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: konfokalmikroskopi mikroskopi bilder av hele popliteal lymfeknuter av genetisk modifisert CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ mus uten antistoff Master Mix injeksjon.
(A-C) LN celle distribusjon ble evaluert med CX3CR1 (grønn) og CCR2 (rød); skala bar = 200 μm. (D-F) Forsterkning av hele orgel med 10x objektiv; skala bar = 100 μm. (G-I) Forsterkning av bestemt område med 20x objektiv; skala bar = 50 μm. (J-L) LN celle distribusjon i lymfe noden sinus gulvet; skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: det spesielle ved T og B celle farging (Høyreklikk for å laste ned).
| Laser | Laser strøm | Få | Forskyvning | Pinhole |
| 406nm | 20 | 65 | -5 | 60 μm |
| 488nm | 25 | 50 | -5 | 60 μm |
| 561nm | 25 | 65 | -10 | 60 μm |
Tabell 1: innstillinger for bildeinnhenting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinasjonen av Imaging med andre teknikker, inkludert molekylærbiologi og høy dimensjonal immunfenotyping har styrket vår evne til å undersøke immunceller i sin opprinnelige sammenheng. Faktisk, mens andre tilnærminger kan kreve vev fordøyelse og celle isolasjon-som kan føre til tap av vev integritet-bruk av in vivo eller ex vivo Imaging gir en stor fordel i å undersøke ulike celle under typer i en geografisk mote3 , 16. det er ikke overraskende at tilgjengeligheten av genetisk modifiserte mus stammer der cellene er spesielt målrettet for å uttrykke ulike fluorophores er raskt økende. Viktigere er kombinasjonen av reporter mus og injeksjon av antistoff Mix et kraftig verktøy for å flekk forskjellige celle populasjoner in-vivo i samme organ4. Videre popularisering av gen redigeringsverktøy som CRISPR/Cas9 har tillatt ulike grupper for å tilpasse sine mus stammer på en måte som nesten alle celle type kan nå avbildet i deres bona fide sted17. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan den romlige og funksjonelle forholdet mellom ulike celletyper vurderes i dype detaljer. Imidlertid, hvis tenkelig av cellen bevegelse eller drivkraft begivenheter inne Vivo er ikke mandat, en færre innviklet eksperimentelle adgang kan brukes. I dette tilfellet leveres antistoffer og sonder i Vivo, og orgelet (eller en prøve) er direkte visualisere i mikroskopet.
Her har vi beskrevet en grei protokoll som utlevert bruken av vev kryonisk bevaring og kryosnitt som potensielt kan påvirke organ strukturer og tillot styrking av immunceller innen lymfeknuter følgende in vivo administrasjon av fluorescerende-merket antistoffer. Disse protokollene krevde minimal tekniske og kirurgiske ferdigheter og kan tilpasses til å visualisere nesten alle immunceller i sin opprinnelige plassering. Viktigere, foreslo vi at antistoffer skal administreres på en måte at de vil nå lymfeknuter ved hjelp av samme trasé som antigener og celler reise under en immunrespons. Ved å injisere fluorescerende antistoffer i subkutan plass, var det mulig å etterligne alle vev og hemodynamisk barrierer funnet i vivo og anslå kronologi av antigen spredning. I tillegg til dette programmet, kan denne metoden brukes og nyttig for biodistribusjon av fluorescerende-merket narkotika og celle-målretting studier av fluorescerende-merket nanopartikler.
Det er imidlertid begrensninger på denne metoden. Mengden antistoff som kreves er høyere sammenlignet med konvensjonelle histologi metoder; men siden konvensjonelle immunofluorescence mikroskopi krever flere runder med vev forberedelser og flekker for å optimalisere teknikken og få gode bilder, kan kostnadene ved konvensjonelle mikroskopi potensielt overvinne kostnadene ved den høye antistoff konsentrasjon ansatt i vår protokoll. Neste, basert på de kjente egenskapene til lymfatisk antigen drenering i lymfe-noden9,18, effektiviteten av merking er sannsynlig å raskt redusere med avstanden til lymfesystemet blodkar på grunn av størrelsen på merking reagens Ansatt. Faktisk kan de svarte områdene i noen av bildene skyldes dårlig vev penetrasjon. Bare 40-100 μm i dybden kan oppnås med konfokalmikroskopi avbildning av LN, og dermed kan bare overfladiske LN-regioner bli visualisere. En måte å i det minste delvis overvinne dette problemet er å bruke fluorophores med bedre eksitasjon og deteksjon av mikroskopet. En annen alternativ tilnærming er å bruke multiphoton laser mikroskopi med nesten infrarød eksitasjon bølgelengde som har vært nøkkelen til dype vev Imaging og ble vist å omgå alvorlig lysspredning problemer observert med konfokalmikroskopi enkelt Foton laser mikroskopi19. I tilfelle av tenkelig celler farget av antistoffer som ble levert in vivo, bare antigener som er uttrykt på celleoverflaten kan målrettes. Hvis antistoffer som brukes ikke er validert ennå, blir det avgjørende å utføre en tilsvarende isotype kontroll farging å utelukke autofluorescence og validere merkingen. Dette kan utføres i samme dyr, dvs., celle målretting antistoff Mix injisert ipsilaterally og isotype kontroll Mix injisert contralaterally. I tillegg kan mengden av antistoff som er nødvendig for å effektivt beis en celle i vivo variere mellom eksperimenter og cellelinjer, og en alternativ tilnærming for denne begrensningen er å bruke genetisk målrettede fluorescens uttrykk.
I konklusjonen, foreslår vi en ny protokoll for hele lymfe node Imaging som opprettholder vevet arkitektoniske integritet, er reproduserbar, lett å utføre og bruke konvensjonelle konfokalmikroskopi mikroskop. Denne teknikken demonstrerer hvordan enkle metoder kan tillate regelmessige laboratorie strukturer for å fungere som Poly-funksjonelle plattformer som muliggjør store fremskritt i immunsystemet etterforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01 AI43458 til H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
References
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
