Summary
Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.
Abstract
Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.
Introduction
Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos1. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la dinámica de las células inmunitarias presentes en el sistema linfático tendrá importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna y la inmunoterapia contra el cáncer.
La llegada de poderosos microscopios -incluyendo nuevos microscopios confocales y de superresolución- ha permitido un avance extraordinario en la comprensión de cómo se comportan las diferentes poblaciones de células inmunitarias en su entorno nativo3. Ahora es posible crear una imagen de varios subtipos celulares simultáneos utilizando unacombinación de sondas con ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de objetivos específicos 4,5. De hecho, las técnicas de alta dimensión, incluida la citometría de masas y el análisis de flujo multiparamétrico han sido cruciales para ampliar nuestros conocimientos sobre la compartimentación y funcionalidad de diferentes células inmunitarias en la salud y la enfermedad6, 7. Sin embargo, para preparar muestras para estas técnicas, los tejidos necesitan digestión y las células se separan de su entorno natural para ser analizadas en suspensiones celulares. Para superar estas limitaciones y permitir una mejor traducción en biología, el objetivo del protocolo propuesto aquí es aplicar una metodología sencilla para la imagen de ganglios linfáticos enteros ex vivo utilizando microscopios confocales con el beneficio de la mejora de la velocidad, el tejido conservación de la estructura y viabilidad celular en comparación con la tinción de inmunofluorescencia convencional. Mediante el uso de este enfoque, pudimos demostrar que los ratones deficientes para las células T,un subtipo de linfocitos T involucrados en la defensa temprana del huésped contra patógenos 4, han comprometido folículos y zonas de células T en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos nos permitieron realizar un estudio en el que demostramos que las células T desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de los órganos linfoides y la respuesta inmune humoral4. Además, este protocolo proporciona una vía fisiológica para que las sondas y los anticuerpos lleguen al ganglio linfático, ya que se administran por vía subcutánea y se disipan a través de la circulación linfática tisular, basándose en informes anteriores que se utilizan en el etiquetado in situ con anticuerpos para visualizar estructuras asociadas a linfáticos8,9, dinámica central germinal10,11,12, y objetivos fácilmente accesibles para el flujo sanguíneo13 ,14,15.
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Protocol
El protocolo fue aprobado por el Comité Permanente de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard y Brigham and Women's Hospital, protocolo 2016N000230.
1. Ratones utilizados para el experimento
- Utilice ratones machos y hembras de 8 semanas de edad sobre el fondo B6 para administrar la mezcla de anticuerpos.
- Utilice ratones CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar si las imágenes de LN enteras ex vivo también se pueden aplicar a ratones reportero sin administrar mezcla de anticuerpos, así como para investigar la presencia de células mononucleares, incluida la presentación de antígenos células y fagocitos, y su distribución en el LN.
NOTA: Los ratones reportero CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT tienen proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP) insertadas bajo el control de los promotores CX3CR1 y CCR2, respectivamente. Los ratones Reportero se pueden utilizar con o sin la inyección de la mezcla de anticuerpos. Consulte la referencia4 para la inyección de mezcla de anticuerpos en un ratón de reportero. Proceda a la cirugía si no se inyectará ningún anticuerpo.
2. Preparación e inyección de mezcla de anticuerpos
NOTA: Realice estos pasos en ratones descritos en el paso 1.1.
- Diluir 1:10 de violeta brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) y 1:20 de fiesteesterina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) en PBS con el volumen final adecuado para inyectar en el muslo interno (a imagen inguinal) o en la pata (a la imagen popliteal) linfa.
NOTA: Uso como isotipos: BV421 Ratón IgG2b, k Control de isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, Control de Isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rata IgG2a, Control de Isotipos (R35-95; 0,2 mg/ml). Si cambia el anticuerpo de tinción, utilice el isotipo correcto. - Para la imagen de LN inguinal, inyecte 100 ml de la mezcla de anticuerpos por vía subcutánea en el muslo interno (Figura1A). Alternativamente, inyectar por vía subcutánea de 50 l de mezcla de anticuerpos en la almohadilla de la pata para crear una imagen de LN popal (Figura2A). Utilice delicadas jeringas de insulina de 1 ml (Insulina U-100) con la aguja de 0,30 mm a 13 mm (30 de calibre a 1 x 2 pulgadas).
NOTA: Asegúrese de que la inyección para la tinción LN inguinal es subcutánea y no intramuscular (es decir), la mezcla de anticuerpos no se drenará correctamente si se realiza la administración de i.m. - No anestesiar a los animales antes de la inyección de mezcla de anticuerpos.
- Espere un mínimo de 3 h (dLN inguinal) y 12 h (dLN popliteal) después de la inyección para extraer los órganos.
- Si el etiquetado de células LN no se observa completamente utilizando grandes tintes fluorescentes de polímero como violeta brillante o azul brillante, utilice fluoróforos más pequeños, incluyendo isotiocianato de fluoresceína (FITC), PE y aloficocyanina (APC) como alternativa.
3. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático drenante inguinal
- Ratones euthanizales utilizando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.
- Inmovilizar ratones en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la piel abdominal para evitar la deposición de piel alrededor de la incisión (Figura1B). La eliminación de la piel no es necesaria.
- Realizar una incisión de línea media utilizando tijeras curvas de microcirugía (11,5 cm) y fórceps curvos de microcirugía (12,5 cm) en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide (Figura1C).
- Disociar la musculatura abdominal de la piel (Figura 1D).
- Realice incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical para crear colgajos de piel en el lado de interés (según el lado de la inyección de mezcla de anticuerpos) y agitar la piel para visualizar el ganglio linfático (Figura1E).
- Tape el cierre de la piel en la placa de acrílico (Figura1F).
- Retire el ganglio linfático drenante inguinal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1F). El ganglio linfático aparecerá como una esfera translúcida, generalmente bilobular, debajo de la piel.
4. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático de drenaje popliteal
- Ratones euthanizales utilizando asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.
- Inmovilizar ratones en una posición propensa en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la pantorrilla y la rodilla (Figura2A-D).
- Realice una incisión de línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla (Figura2E,F).
- Disociar la musculatura de la pantorrilla de la piel (Figura2F,G).
- Exponer la fosa popliteal (Figura2G). El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida en la fosa popliteal.
- Retire el ganglio linfático popliteal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura2G).
- Alternativamente, gire el ratón sobre la posición supina, y acérquese a la fosa popliteal entre el bíceps femoris y semitendinosus para la extirpación del LN popliteal realizando una incisión de línea media en el talón desde el talón hasta la rodilla seguida de la disociación de la pantorrilla musculatura de la piel.
NOTA: La fosa popliteal es una depresión poco profunda situada en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Abra cuidadosamente para ver el ganglio linfático popliteal.
5. Preparación de los ganglios linfáticos
- Coloque todo el órgano en un recipiente de cultivo con fondo de vidrio (35 mm x 10 mm) y retire la grasa que rodea el órgano utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1G-I y Figura 2H).
- Centralice el órgano en el centro del plato (Figura1J y Figura 2H).
- Cubra el órgano con un fragmento de delicados limpiaparabrisas de tareas y manténgalo empapado con solución salina a temperatura ambiente 0,9% o solución de tampón de fosfato (Figura1K-M y Figura 2H).
NOTA: No es necesario lavar los ganglios linfáticos después de la extracción o realizar la extracción de los ganglios linfáticos en la campana.
6. Microscopía confocal ex-vivo (Imágenes)
- Coloque la placa Petri en la ranura del microscopio confocal invertido (Figura1N y Figura 2H).
- LNdes de imagen bajo un microscopio confocal (Figura1O y Figura 2H).
- En primer lugar, obtener el enfoque correcto utilizando la luz convencional del microscopio confocal con objetivo 4x o 10x. A continuación, cambie de la función de luz al modo láser.
NOTA: Si el microscopio confocal no contiene un objetivo 4x, el enfoque se puede obtener perfectamente utilizando el objetivo 10x. - Ajustar la potencia del láser, el desplazamiento y la ganancia utilizando una muestra de isotipo manchada, no manchada o no fluorescente (Tabla 1) para eliminar la autofluorescencia y las manchas inespecíficas de anticuerpos con etiqueta fluorescente como los utilizados en las imágenes mostradas en este manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 y PE anti-F4/80).
- Ajuste las posiciones Z y XY, utilizando el micrométrico y el carro, respectivamente, en el área de interés en el ganglio linfático.
- Adquirir imágenes bajo objetivos 4x, 10x y 20x centrándose en la estructura LN y la distribución celular. Utilice la definición de 1024 x 1024 píxeles.
NOTA: Adquirir un mínimo de cinco imágenes en diferentes campos por objetivo por animal. - Analice imágenes utilizando un software de imagen para separar canales, añadir escala y colores de interés, y reconstruir la vista 3D.
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Representative Results
Este manuscrito muestra técnicas para eliminar los ganglios linfáticos inguinales y popliteales sin dañar su estructura después de la inyección de anticuerpos con etiqueta fluorescente para manchar poblaciones celulares específicas en estos órganos (Figura1 y Figura 2 ).
La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células LN con BV421 anti-CD4 y BB515 anti-CD19 y análisis de imágenes confocales definió la localización de células T (CD4+) y células B (CD19+) en LN inguinales y popliteales. En ambos órganos, los folículos decélulas B estaban rodeados por poblaciones de células T (Figura 3, Figura 4 y video 1), un sello distintivo de la estructura LN1. Para excluir la posibilidad de que los fagocitos que recubren los senos linfáticos puedan capturar los anticuerpos fluorescentes inyectados y dar lugar a un etiquetado no específico de los marcadores celulares, se incluyó PE anti-F4/80 en la mezcla de anticuerpos. Como se muestra en la Figura5, los fagocitos no internalizaron los anticuerpos inyectados, lo que indica que la tinción de células B y T era específica. Además, elvídeo 1 muestra que la tinción de células T y B no se supercontroló, lo que confirma la especificidad de la tinción.
Para investigar la localización espacial de células mononucleares fagocíticas en el LN, se tomaron imágenes de LN inguinales y popitales de CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+. Las células mononucleares se encontraron a lo largo del LN inguinal, incluyendo el seno subcapsular. La mayoría de estas células fueron CX3CR1GFP/+, seguido de CCR2RFP/+ y celdas positivas dobles (amarillo) (Figura6A-F). El mismo patrón de distribución celular y fenotipos celulares se observó en el LN popliteal (Figura7A-I). Los LN inguinales y popliteales mostraron regiones negras sin CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, que están ocupadas por linfocitos. Además, las células CX3CR1+ y CCR2+ eran escasas en el área interna de los LN y se concentraban en el área exterior, lo que indica que estas células ocupan principalmente el seno subcapsular LN (Figura6G-I y Figura 7J-L). Por lo tanto, el protocolo propuesto puede definir claramente las principales poblaciones celulares presentes en los ganglios linfáticos.
Figura 1: Preparación de ganglios linfáticos inguinales.
(A) Inyección subcutánea de mezcla maestra de anticuerpos FACS en el muslo interno. (B) 3 h después de la inyección, eutanasia el ratón, inmovilizar el ratón sobre una placa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral a la piel abdominal para evitar la deposición de piel alrededor de la incisión. (C) Realizar una incisión de línea media en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide. (D) Disociar la musculatura abdominal de la piel y hacer un cierre de piel. (E) Pegue el cierre de la piel de la placa de acrílico. (F) Retire el ganglio linfático inguinal utilizando un fórceps curvo microcirugía. (G-H) Coloque el órgano en un plato de cultivo (G) y retire la grasa que rodea el órgano (H). (I) Imagen ilustrativa que muestra el tamaño del órgano después de la limpieza. J-M) Centralice el órgano en medio de un plato de petri (J), cubra el órgano con un pedazo de delicados limpiaparabrisas de tareas (K) y manténgase empapado con calurosa 0,9% de salina o 1x PBS (L, M). (N) Coloque la placa Petri en la ranura del microscopio. (O) Escanee el órgano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de ganglios linfáticos poplíliales.
(A, B) Inyección subcutánea de mezcla maestra de anticuerpos FACS en la almohadilla de la pata. (C, D) 3 h después de la inyección, eutanasia el ratón, inmovilizar el ratón en una placa acrílica con cinta adhesiva (C) y aplicar aceite mineral a la piel abdominal para evitar la deposición de piel alrededor de la incisión (D). (E) Realice una incisión de línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla. (F) Exponer la fosa popliteal. (G) Retire el ganglio linfático popliteal utilizando fórceps curvados por microcirugía. (H) Colocar el órgano en un plato de petri y retirar la grasa que rodea el órgano, centralizar el órgano en el medio de la placa de Petri, cubrir el órgano con un pedazo de delicado salparabrisas de tarea y mantener empapado con salina caliente 0.9% o 1x PBS. Coloque la placa Petri en la ranura del microscopio y escanee el órgano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de microscopía confocal de ganglios linfáticos inguinales enteros de ratones ingenuos no inmunizados.
(A-C) Las células LN B y T se teñían usando CD4 (verde; T) y CD19 (rojo; Células B); barra de escala a 50 m. (D-I) Amplificación de área específica con objetivo 10x; barra de escala a 30 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de microscopía confocal de ganglios linfáticos popliteales enteros de ratones ingenuos no inmunizados.
(A-C) Las células LN B y T se teñían usando CD4 (verde; T) y CD19 (rojo; Células B); barra de escala a 60 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes representativas de microscopía confocal de ganglios linfáticos inguinales enteros de ratones ingenuos no inmunizados que muestran fagocitos.
(A-C) LN B y las células fagocíticas se teñieron usando CD19 (verde; B) y F4/80 (azul; fagocitos); barra de escala a 100 m; (D-F) LN T y las células fagocíticas se teñían usando CD3 (verde; T) y F4/80 (blanco; fagocitos); barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de microscopía confocal de ganglios linfáticos inguinales enteros de CX3CR1 modificado genéticamente GFP/+ CCR2 RFP/+ ratones sin inyección de mezcla maestra de anticuerpos.
(A-C) La distribución de células LN se evaluó con CX3CR1 (verde) y CCR2 (rojo); barra de escala a 100 m. (D-F) Amplificación de área específica con objetivo 20x; barra de escala a 50 m. (G-I) Distribución de células LN en el suelo del seno de los ganglios linfáticos; barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Imágenes de microscopía confocal de ganglios linfáticos popliteales enteros de CX3CR1 modificado genéticamente GFP/+ CCR2 RFP/+ ratones sin inyección de mezcla maestra de anticuerpos.
(A-C) La distribución de células LN se evaluó con CX3CR1 (verde) y CCR2 (rojo); escala de escala a 200 m. (D-F) Amplificación de todo el órgano con 10x objetivo; barra de escala a 100 m. (G-I) Amplificación de área específica con objetivo 20x; barra de escala a 50 m. (J-L) Distribución de células LN en el suelo del seno de los ganglios linfáticos; barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: La especificidad de la tinción de células T y B (Haga clic con el botón derecho para descargar).
| Láser | Potencia láser | Ganar | Compensar | Estenopeica |
| 406nm | 20% | 65 | -5 | 60m |
| 488nm | 25% | 50 | -5 | 60m |
| 561nm | 25% | 65 | -10 | 60m |
Tabla 1: Configuración de adquisición de imágenes.
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Discussion
La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfica3 , 16. No es de extrañar que la disponibilidad de cepas de ratón modificadas genéticamente en las que las células están específicamente dirigidas a expresar diferentes fluoróforos está aumentando rápidamente. Es importante destacar que la combinación de ratones reportero y la inyección de la mezcla de anticuerpos es una poderosa herramienta para manchar diferentes poblaciones celulares in-vivo en el mismo órgano4. Además, la popularización de herramientas de edición de genes como CRISPR/Cas9 ha permitido a diferentes grupos personalizar sus cepas de ratón de una manera que prácticamente cualquier tipo de célula se puede imaginar ahora en su ubicación de buena fe17. Con este enfoque, la relación espacial y funcional entre diferentes tipos de celda se puede evaluar en detalles profundos. Sin embargo, si las imágenes del movimiento celular o los eventos dinámicos in vivo no son obligatorios, se puede utilizar un enfoque experimental menos complejo. En este caso, los anticuerpos y las sondas se entregan in vivo, y el órgano (o una muestra) se visualiza directamente en el microscopio.
Aquí describimos un protocolo sencillo que dispensaba el uso de criopreservación de tejidos y criosección que potencialmente puede afectar las estructuras de los órganos y permitió la apreciación de las células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos después de la administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente. Estos protocolos exigían habilidades técnicas y quirúrgicas mínimas y podían adaptarse para visualizar prácticamente cualquier célula inmune en su ubicación original. Es importante destacar que propusimos que los anticuerpos se administraran de manera que llegaran a los ganglios linfáticos utilizando las mismas vías que los antígenos y las células viajan durante una respuesta inmunitaria. Mediante la inyección de anticuerpos fluorescentes en el espacio subcutáneo, fue posible imitar todos los tejidos y barreras hemodinámicas encontradas in vivo y estimar la cronología de la disipación de antígenos. Además de esta aplicación, este método podría aplicarse y ser útil para la biodistribución de fármacos con etiqueta florescente y estudios de segmentación celular de nanopartículas etiquetadas con fluorescentes.
Sin embargo, hay limitaciones a este método. La cantidad de anticuerpos requeridos es mayor en comparación con los métodos de histología convencionales; sin embargo, dado que la microscopía de inmunofluorescencia convencional requiere varias rondas de preparación y tinción de tejidos para optimizar la técnica y obtener buenas imágenes, el costo de la microscopía convencional puede potencialmente superar el costo de la alta concentración de anticuerpos empleada en nuestro protocolo. A continuación, sobre la base de las propiedades conocidas del drenaje del antígeno linfático en el ganglio linfático9,18, es probable que la eficiencia del etiquetado disminuya rápidamente con la distancia a la vasculatura linfática debido al tamaño del reactivo de etiquetado Empleado. De hecho, las áreas negras en algunas de las imágenes pueden resultar de una mala penetración de tejido. Sólo se pueden lograr 40-100 m de profundidad con imágenes confocales de LN, y por lo tanto sólo se pueden visualizar regiones LN superficiales. Una manera de superar al menos parcialmente este problema es utilizar fluoróforos con mejor excitación y detección por el microscopio. Otro enfoque alternativo es utilizar microscopía láser multifotona con longitud de onda de excitación casi infrarroja que ha sido clave para la toma de imágenes de tejido profundo y se demostró para eludir los problemas graves de dispersión de luz observados con láser de fotones único confocal microscopía19. En el caso de las células de imagen teñidas por anticuerpos que se entregaron in vivo, solo se pueden apuntar a antígenos que se expresan en la superficie celular. Si los anticuerpos utilizados no se han validado todavía, se vuelve fundamental realizar una tinción de control de isotipo correspondiente para excluir la autofluorescencia y validar el etiquetado. Esto se puede realizar en el mismo animal, es decir, mezcla de anticuerpos de orientación celular inyectada ipsilateralmente y mezcla de control de isotipo inyectada contralateralmente. Además, la cantidad de anticuerpos necesaria para manchar eficientemente una célula in vivo puede variar entre experimentos y líneas celulares y un enfoque alternativo para esta limitación es utilizar la expresión de fluorescencia dirigida genéticamente.
En conclusión, proponemos un nuevo protocolo para la imagen de nodos linfáticos enteros que mantiene la integridad arquitectónica del tejido, es reproducible, fácil de realizar y utilizar microscopios confocales convencionales. Esta técnica demuestra cómo los métodos simples pueden permitir que las estructuras de laboratorio regulares funcionen como plataformas polifuncionales que permiten avances importantes en la investigación del sistema inmunitario.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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