Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.
Abstract
Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.
Introduction
Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren1. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen2. Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzellen wird daher wichtige Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung und die Krebsimmuntherapie haben.
Das Aufkommen leistungsstarker Mikroskope - einschließlich neuer konfokaler und superhochauflösender Mikroskope - hat einen außergewöhnlichen Fortschritt im Verständnis des Verständnisses ermöglicht, wie sich verschiedene Immunzellpopulationen in ihrer heimischen Umgebung verhalten3. Es ist nun möglich, mehrere simultane Zellsubtypen mit einer Kombination von Sonden mit genetisch veränderten Mäusen abzubilden, die fluoreszierende Proteine unter Kontrolle spezifischer Targets4,5ausdrücken. In der Tat waren hochdimensionale Techniken, einschließlich Massenzytometrie und multiparametrische Strömungsanalyse, entscheidend für die Erweiterung unseres Wissens über verschiedene Immunzellabteilalisation und Funktionalität in Gesundheit und Krankheit6, 7. Um jedoch Proben für diese Techniken vorzubereiten, müssen Gewebe verdaut werden und Zellen werden von ihrem natürlichen Milieu getrennt, um in Zellsuspensionen analysiert zu werden. Um diese Grenzen zu übertreffen und eine bessere Übersetzung in die Biologie zu ermöglichen, ist das Ziel des hier vorgeschlagenen Protokolls, eine einfache Methodik anzuwenden, um ex vivo ganze Lymphknoten mit Stock-Konfokalmikroskopen mit dem Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Gewebe Strukturerhaltung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbung. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass Mäuse, die einen Mangel an T-Zellen haben, einem Subtyp von T-Lymphozyten, der an der frühen Abwehr von Krankheitserregern beteiligt ist4, Follikel und T-Zellzonen im Vergleich zu Wildtypmäusen kompromittiert haben. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, eine Studie zu verfolgen, in der wir zeigten, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Lymphorganen und der humoralen Immunantwort spielen4. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll einen physiologischen Weg für Sonden und Antikörper, um den Lymphknoten zu erreichen, da sie subkutan verabreicht werden und sich durch die Lymphzirkulation des Gewebes ableiten, aufbauend auf früheren Berichten, die in situ-Kennzeichnung verwendet wurden. mit Antikörpern zur Visualisierung lymphatischer Strukturen8,9, Keimzentrumsdynamik10,11,12und Targets leicht zugänglich für den Blutfluss13 ,14,15.
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Protocol
Das Protokoll wurde vom Standing Committee on Animals an der Harvard Medical School und dem Brigham and Women es Hospital, Protokoll 2016N000230, genehmigt.
1. Mäuse, die für das Experiment verwendet werden
- Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse auf dem B6-Hintergrund für die Verabreichung der Antikörpermischung.
- Verwenden Sie CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT-Mäuse, um festzustellen, ob ex vivo ganze LN-Bildgebung auch auf Reportermäuse angewendet werden kann, ohne Antikörpermischung zu verabreichen, sowie um das Vorhandensein von mononukleären Zellen zu untersuchen, einschließlich Antigen, die Zellen und Phagozyten und ihre Verteilung in den LN.
HINWEIS: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT Reportermäuse haben grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) unter der Kontrolle von CX3CR1 bzw. CCR2-Promotoren eingesetzt. Reportermäuse können mit oder ohne Injektion der Antikörpermischung verwendet werden. Bitte beachten Sie Referenz4 für Antikörper-Mix-Injektion in einer Reportermaus. Fahren Sie mit der Operation fort, wenn kein Antikörper injiziert wird.
2. Antikörper-Mix-Vorbereitung und Injektion
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte an Mäusen aus, die in Schritt 1.1 beschrieben sind.
- 1:10 von brillantviolett (BV) 421 anti-CD4 verdünnen (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 von brillantblau (BB) 515 Anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) und 1:20 Von Phycoerythrin (PE) Anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) in PBS mit dem entsprechenden Endvolumen, um in den inneren Oberschenkel zu injizieren (zu Bild leisten) oder in die Pfotenpad (um popliteal) Lymphe zu bilden.
HINWEIS: Verwendung als Isotypen: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0,2 mg/ml); PE Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml); BB515 Ratte IgG2a, Isotype Control (R35-95; 0,2 mg/ml). Wenn Sie den Färbeantikörper ändern, verwenden Sie den richtigen Isotyp. - Um die Leistenbild LN abzubilden, injizieren Sie 100 l des Antikörper-Mix subkutan in den inneren Oberschenkel (Abbildung 1A). Alternativ können Sie eine subkutane Antikörpermischung von 50 l in das Pfotenpad in das Bild popliteal LN (Abbildung 2A) einspritzen. Verwenden Sie empfindliche 1 ml Insulinspritzen (Insulin U-100) mit der Nadel der Größe 0,30 mm x 13 mm (30 Gauge bei 1/2 Zoll).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Injektion für die Braunfärbung von LN subkutan und nicht intramuskulär ist (i.m.), da die Antikörpermischung nicht ordnungsgemäß entleert wird, wenn die i.m. Verabreichung durchgeführt wird. - Anästhesisieren Sie Tiere nicht vor der Injektion von Antikörpermischungen.
- Warten Sie mindestens 3 h (leistend) und 12 h (popliteal dLN) nach der Injektion, um die Organe zu entfernen.
- Wenn die LN-Zellbeschriftung nicht vollständig mit großen Polymerfluoreszenzfarbstoffen wie brillanten Violett- oder Brillantblau-Farbstoffen beobachtet wird, verwenden Sie als Alternative kleinere Fluorophore, einschließlich Fluoresceinisothiocyanat (FITC), PE und Allophycocyanin (APC).
3. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des leistend entwässernden Lymphknotens
- Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
- Immobilisieren Sie Mäuse auf der Acrylbühne mit Klebeband und tragen Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen auf die Bauchhaut auf, um Fellablagerungen um den Schnitt zu verhindern (Abbildung 1B). Pelzentfernung ist nicht notwendig.
- Führen Sie einen Mittellinienschnitt mit einer mikrochirurgischen gekrümmten Schere (11,5 cm) und einer mikrochirurgischen gekrümmten Zange (12,5 cm) im Bauch vom Schambein bis zum xiphoiden Prozess durch (Abbildung 1C).
- Dissoziieren Sie die Bauchmuskulatur von der Haut (Abbildung 1D).
- Machen Sie horizontale Hauteinschnitte an der Ober- und Unterseite der vertikalen Schnittlinie, um Hautklappen auf der Seite des Interesses zu erstellen (entsprechend der Seite der Antikörper-Mix-Injektion) und klappern Sie die Haut, um den Lymphknoten zu visualisieren (Abbildung 1E).
- Kleben Sie die Hautklappe auf die Acrylplatte (Abbildung 1F).
- Entfernen Sie den inguinal entwässernden Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 1F). Lymphknoten erscheint als transluzider, in der Regel bilobular, Kugel unter der Haut.
4. Chirurgisches Verfahren zur Entfernung des popliteal enzierenden Lymphknotens
- Euthanisieren Sie Mäuse mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
- Immobilisieren Sie Mäuse in einer anfälligen Position auf Acryl-Bühne mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl mit einem Wattestäbchen in der Wade und Knie (Abbildung2A-D).
- Führen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie (Abbildung 2E,F).
- Dissoziieren Sie die Kalbsmuskulatur von der Haut (Abbildung 2F,G).
- Expose the popliteal fossa (Abbildung 2G). Popliteallymphknoten erscheint als transluziden Kugel in der poplitealen Fossa.
- Entfernen Sie den poplitealen Lymphknoten mit mikrochirurgischen gekrümmten Zangen (Abbildung 2G).
- Alternativ drehen Sie die Maus auf supine Position, und nähern Sie sich der poplitealen Fossa zwischen bizeps femoris und semitendinosus für popliteale LN Entfernung durch Durchführung einer Mittellinie Schnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie gefolgt von Dissoziation des Kalbs Muskulatur von der Haut.
HINWEIS: Popliteal fossa ist eine flache Depression an der Rückseite des Kniegelenks. Öffnen Sie sorgfältig, um den poplitealen Lymphknoten zu sehen.
5. Lymphknotenvorbereitung
- Legen Sie das ganze Organ in eine Kulturschale mit Glasboden (35 mm x 10 mm) und entfernen Sie das Fett, das das Organ umgibt, mit mikrochirurgischen gebogenen Zangen (Abbildung 1G-I und Abbildung 2H).
- Zentralisieren Sie das Organ in der Mitte der Schale (Abbildung 1J und Abbildung 2H).
- Bedecken Sie das Organ mit einem Fragment von empfindlichen Aufgabenwischern und halten Sie es mit Raumtemperatur-Saline 0,9% oder Phosphat-Puffer-Lösung (Abbildung 1K-M und Abbildung 2H) getränkt.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Lymphknoten nach der Entfernung zu waschen oder die Lymphknotenextraktion in der Haube durchzuführen.
6. Ex-vivo konfokale Mikroskopie (Imaging)
- Positionieren Sie die Petrischale im invertierten konfokalen Mikroskopschlitz (Abbildung 1N und Abbildung 2H).
- Bild-LNs unter einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 1O und Abbildung 2H).
- Erhalten Sie zunächst den richtigen Fokus, indem Sie das herkömmliche Licht des konfokalen Mikroskops mit 4x oder 10x Objektiv verwenden. Wechseln Sie dann von der Lichtfunktion in den Lasermodus.
HINWEIS: Wenn das konfokale Mikroskop kein 4-faches Objektiv enthält, kann der Fokus mit dem 10-fachen Objektiv perfekt erreicht werden. - Anpassen der Laserleistung, des Offsets und der Verstärkung mit einer isotypgefärbten, nicht gefleckten oder nicht fluoreszierenden Probe (Tabelle1), um Autofluoreszenz und unspezifische Färbung enthäut von fluoreszierenden Antikörpern, wie sie in den in diesem Bild gezeigten Manuskript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 und PE anti-F4/80).
- Passen Sie Z- und XY-Positionen mit dem mikrometrischen bzw. wagen den Bereich des Interesses am Lymphknoten an.
- Erfassen Sie Bilder unter 4x, 10x und 20x Objektiven, die sich auf die LN-Struktur und Zellverteilung konzentrieren. Verwenden Sie die Definition von 1024 x 1024 Pixel.
HINWEIS: Erwerben Sie mindestens fünf Bilder in verschiedenen Feldern pro Ziel pro Tier. - Analysieren Sie Bilder mit einer Bildsoftware, um Kanäle zu trennen, Skalierung und Farben von Interesse hinzuzufügen und 3D-Ansicht zu rekonstruieren.
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Representative Results
Dieses Manuskript zeigt Techniken zur Entfernung von Leisten- und Popliteal-Lymphknoten, ohne ihre Struktur nach der Injektion fluoreszierender Antikörper zu beschädigen, um bestimmte Zellpopulationen in diesen Organen zu färben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ).
Die leistungsstarke Kombination von Immunolabeling von LN-Zellen mit BV421 Anti-CD4 und BB515 Anti-CD19 und konfokaler Bildgebungsanalyse definierte die Lokalisation von T-Zellen (CD4+) und B-Zellen (CD19+) in Leisten- und Popliteal-LNs. In beiden Organen waren B-Zellfollikel von T-Zellpopulationen umgeben (Abbildung 3, Abbildung 4 und Video 1), ein Kennzeichen der LN-Struktur1. Um auszuschließen, dass Phagozyten, die die lymphatischen Nebenhöhlen auskundschaften, die injizierten fluoreszierenden Antikörper erfassen und zu einer unspezifischen Kennzeichnung von Zellmarkern führen könnten, wurde PE-Anti-F4/80 in den Antikörpermix einbezogen. Wie in Abbildung 5dargestellt, verinnerlichten Phagozyten keine injizierten Antikörper, was darauf hindeutet, dass die B- und T-Zellfärbung spezifisch war. Darüber hinaus zeigtVideo 1, dass sich die T- und B-Zellfärbung nicht überlappend hat, was die Färbungssspezifität bestätigt.
Zur Untersuchung der räumlichen Lokalisierung phagozytischer mononukleärer Zellen in den LN wurden Leisten- und Popliteal-LNs von CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+ abgebildet. Mononukleäre Zellen wurden in der gesamten Leisten-LN gefunden, einschließlich der subkapsulären Sinus. Die meisten dieser Zellen waren CX3CR1GFP/+, gefolgt von CCR2RFP/+ und doppelten positiven Zellen (gelb) (Abbildung 6A-F). Das gleiche Muster der Zellverteilung und Zellphänotypen wurde in der poplitealen LN beobachtet (Abbildung 7A-I). Sowohl Leisten- als auch Popliteal-LNs zeigten schwarze Regionen ohne CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+, die von Lymphozyten belegt sind. Darüber hinaus waren CX3CR1+- und CCR2+-Zellen im Innenbereich der LNs knapp und konzentrierten sich im äußeren Bereich, was darauf hindeutet, dass diese Zellen in erster Linie den LN-Subkapselsinsinus einnehmen (Abbildung6G-I und Abbildung 7J-L). So kann das vorgeschlagene Protokoll wichtige Zellpopulationen, die in Lymphknoten vorhanden sind, klar definieren.
Abbildung 1: Leisten-Lymphknotenpräparat.
(A) Subkutane Injektion von FACS Antikörper-Master-Mix in den inneren Oberschenkel. (B) 3 h nach der Injektion, einschläfern Sie die Maus, immobilisieren Sie die Maus auf einer Acrylplatte mit Klebeband und wenden Sie Mineralöl auf die Bauchhaut, um Fellablagerungen um den Schnitt zu verhindern. (C) Führen Sie einen Mittellinienschnitt im Bauch von der Schambein bis zum xiphoiden Prozess durch. (D) Die Bauchmuskulatur von der Haut trennen und eine Hautklappe machen. (E) Verkleben Sie die Hautklappe auf der Acrylplatte. (F) Entfernen Sie den Leisten-Lymphknoten mit einer mikrochirurgischen gekrümmten Zange. (G-H) Legen Sie die Orgel in eine Kulturschale (G) und entfernen Sie das Fett, das das Organ umgibt (H). (I) Illustratives Bild, das die Orgelgröße nach der Reinigung zeigt. J-M) Zentralisieren Sie die Orgel in der Mitte einer Petrischale (J), bedecken Sie die Orgel mit einem Stück zarter Aufgabenwischer (K) und halten Sie mit warmen 0,9% Saline oder 1x PBS (L, M) getränkt. (N) Positionieren Sie die Petrischale im Mikroskopschlitz. (O) Scannen Sie das Organ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Popliteal Lymphknotenvorbereitung.
(A, B) Subkutane Injektion von FACS Antikörper-Master-Mix in das Pfotenpad. (C, D) 3 h nach der Injektion, einschläfern sie die Maus, immobilisieren Sie die Maus auf einer Acrylplatte mit Klebeband (C) und wenden Sie Mineralöl auf die Bauchhaut an, um die Fellablagerung um den Schnitt zu verhindern (D). (E) Führen Sie einen Mittellinienschnitt in der Wade von der Ferse bis zum Knie. (F) Expose die popliteale Fossa. (G) Entfernen Sie den poplitealen Lymphknoten mit mikrochirurgisch gekrümmten Zangen. (H) Legen Sie die Orgel in eine Petrischale und entfernen Sie das Fett, das das Organ umgibt, zentralisieren Sie das Organ in der Mitte der Petrischale, bedecken Sie die Orgel mit einem Stück zarter Aufgabenwischer und halten Sie mit warmer Herzwäsche 0,9% oder 1x PBS getränkt. Positionieren Sie die Petrischale im Mikroskopschlitz und scannen Sie das Organ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder ganzer Leistenlymphknoten nicht immunisierter naiver Mäuse.
(A-C) LN B- und T-Zellen wurden mit CD4 (grün; T-Zellen) und CD19 (rot; B-Zellen); Skalenbalken = 50 m. (D-I) Verstärkung des spezifischen Bereichs mit 10-fachem Ziel; Skalenbalken = 30 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder ganzer poplitealer Lymphknoten nicht immunisierter naiver Mäuse.
(A-C) LN B- und T-Zellen wurden mit CD4 (grün; T-Zellen) und CD19 (rot; B-Zellen); Skalenbalken = 60 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder des gesamten Leistenlymphknotens von nicht immunisierten naiven Mäusen, die Phagozyten zeigen.
(A-C) LN B und phagozytische Zellen wurden mit CD19 (grün; B-Zellen) und F4/80 (blau; Phagozyten); Skala bar = 100 m; (D-F) LN T und phagozytische Zellen wurden mit CD3 (grün; T-Zellen) und F4/80 (weiß; Phagozyten); Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Konfokale Mikroskopiebilder ganzer Leistenlymphknoten genetisch veränderter CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ Mäuse ohne Antikörper-Master-Mix-Injektion.
(A-C) Die LN-Zellverteilung wurde mit CX3CR1 (grün) und CCR2 (rot) ausgewertet; Skalenbalken = 100 m. (D-F) Verstärkung des spezifischen Bereichs mit 20-fachem Ziel; Skalenbalken = 50 m. (G-I) LN-Zellverteilung im Lymphknoten Sinusboden; Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Konfokale Mikroskopiebilder ganzer poplitealer Lymphknoten genetisch veränderter CX3CR1 GFP/+ CCR2 RFP/+ Mäuse ohne Antikörper-Master-Mix-Injektion.
(A-C) Die LN-Zellverteilung wurde mit CX3CR1 (grün) und CCR2 (rot) ausgewertet; Skalenbalken = 200 m. (D-F) Verstärkung des gesamten Organs mit 10x objektiv; Skalenbalken = 100 m. (G-I) Verstärkung des spezifischen Bereichs mit 20-fachem Ziel; Skalenbalken = 50 m. (J-L) LN-Zellverteilung im Lymphknoten Sinusboden; Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Die Spezifität der T- und B-Zellfärbung (Rechtsklick zum Download).
| laser | Laserleistung | gewinnen | ausgleichen | nadelloch |
| 406nm | 20% | 65 | -5 | 60 m |
| 488nm | 25% | 50 | -5 | 60 m |
| 561nm | 25% | 65 | -10 | 60 m |
Tabelle 1: Einstellungen für die Bildaufnahme.
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Discussion
Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen3 , 16. Es ist nicht verwunderlich, dass die Verfügbarkeit genetisch veränderter Mausstämme, bei denen Zellen speziell auf den Ausdruck verschiedener Fluorophore ausgerichtet sind, rapide zunimmt. Wichtig ist, dass die Kombination von Reportermäusen und die Injektion des Antikörpermixes ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um verschiedene Zellpopulationen in-vivo im selben Organ zu färben4. Darüber hinaus hat die Popularisierung von Gen-Editing-Tools wie CRISPR/Cas9 es verschiedenen Gruppen ermöglicht, ihre Mausstämme so anzupassen, dass praktisch jeder Zelltyp jetzt an ihrem gutgläubigen Ort17abgebildet werden kann. Mit diesem Ansatz kann die räumliche und funktionale Beziehung zwischen verschiedenen Zelltypen in tiefen Details bewertet werden. Wenn jedoch die Abbildung der Zellbewegung oder dynamische Ereignisse in vivo nicht obligatorisch sind, kann ein weniger komplexer experimenteller Ansatz verwendet werden. In diesem Fall werden Antikörper und Sonden in vivo abgegeben und das Organ (oder eine Probe) direkt im Mikroskop visualisiert.
Hier beschrieben wir ein einfaches Protokoll, das die Verwendung von Gewebekryokonservierung und Kryosektion, die potenziell Beeinflussen von Organstrukturen und ermöglicht die Wertschätzung von Immunzellen in Lymphknoten nach in vivo Verabreichung von fluoreszierend gekennzeichnete Antikörper. Diese Protokolle erforderten minimale technische und chirurgische Fähigkeiten und konnten angepasst werden, um praktisch alle Immunzellen an ihrem ursprünglichen Standort zu visualisieren. Wichtig ist, dass wir vorgeschlagen haben, Antikörper so zu verabreichen, dass sie die Lymphknoten mit den gleichen Wegen erreichen, die Antigene und Zellen während einer Immunantwort zurücklegen. Durch die Injektion fluoreszierender Antikörper in den subkutanen Raum war es möglich, alle Gewebe und hämodynamischen Barrieren, die in vivo gefunden wurden, nachzuahmen und die Chronologie der Antigenableitung zu schätzen. Zusätzlich zu dieser Anwendung könnte diese Methode für die Bioverteilung von floreszentmarkierten Arzneimitteln und zellgezielten Studien an fluoreszierend gekennzeichneten Nanopartikeln angewendet werden.
Diese Methode ist jedoch eingeschränkt. Die Menge an Antikörpern ist höher im Vergleich zu herkömmlichen Histologie-Methoden; Da jedoch die konventionelle Immunfluoreszenzmikroskopie mehrere Runden der Gewebeaufbereitung und Färbung erfordert, um die Technik zu optimieren und gute Bilder zu erhalten, können die Kosten der konventionellen Mikroskopie potenziell die Kosten der hohen Antikörperkonzentration, die in unserem Protokoll verwendet wird. Als nächstes, basierend auf den bekannten Eigenschaften der lymphatischen Antigendrainage in den Lymphknoten9,18, ist die Effizienz der Etikettierung wahrscheinlich schnell mit dem Abstand zur lymphatischen Vaskulatur aufgrund der Größe des Etikettierungsreageims abnehmen Beschäftigt. Tatsächlich können die schwarzen Bereiche in einigen der Bilder durch eine schlechte Gewebedurchdringung entstehen. Mit der konfokalen Bildgebung von LN können nur 40-100 m in der Tiefe erreicht werden, so dass nur oberflächliche LN-Regionen visualisiert werden können. Eine Möglichkeit, dieses Problem zumindest teilweise zu lösen, ist die Verwendung von Fluorophoren mit besserer Anregung und Detektion durch das Mikroskop. Ein weiterer alternativer Ansatz ist die Verwendung der Multiphotonen-Lasermikroskopie mit nahinfraroter Anregungswellenlänge, die der Schlüssel zur Tiefengewebebildgebung war und nachweislich schwere Lichtstreuungsprobleme umgeht, die mit konfokalen Einzelphotonenlasern beobachtet wurden. Mikroskopie19. Bei bildgebenden Zellen, die mit Antikörpern gefärbt wurden, die in vivo abgegeben wurden, können nur Antigene, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, gezielt eingesetzt werden. Wenn die verwendeten Antikörper noch nicht validiert wurden, wird es wichtig, eine entsprechende Isotyp-Kontrollfärbung durchzuführen, um die Autofluoreszenz auszuschließen und die Kennzeichnung zu validieren. Dies kann bei demselben Tier durchgeführt werden, d.h. zellgezielter Antikörpermix ipsilaterin injiziert und Isotyp-Kontrollmix kontralateral injiziert. Darüber hinaus kann die Menge an Antikörpern, die notwendig sind, um eine Zelle in vivo effizient zu färben, zwischen Experimenten und Zelllinien variieren, und ein alternativer Ansatz für diese Einschränkung besteht darin, die genetisch ausgerichtete Fluoreszenzexpression zu verwenden.
Abschließend schlagen wir ein neues Protokoll für die Bildgebung ganzer Lymphknoten vor, das die architektonische Integrität des Gewebes aufrechterhält, reproduzierbar, einfach durchzuführen und herkömmliche konfokale Mikroskope verwendet. Diese Technik zeigt, wie einfache Methoden es ermöglichen können, regelmäßige Laborstrukturen als polyfunktionale Plattformen zu arbeiten, die große Fortschritte in der Untersuchung des Immunsystems ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH (R01 AI43458 bis H.L.W.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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