Summary
このプロトコルは、臓器構造に変化を起さずにリンパ節を排出する異なる細胞集団を画像化する技術を説明する。
Abstract
リンパ節(LN)は体内に広がる器官であり、自然免疫応答が適応免疫とつながる。実際、LNはリンパ管の経路に戦略的に介入され、LN内のすべての常駐免疫細胞と組織抗原との親密な接触を可能にする。したがって、ex vivo全体LNイメージングを用いて細胞組成、分布、位置および相互作用を理解することは、身体が局所的および全身性免疫応答をどのように調整するかに関する知識を追加する。このプロトコルは、従来の共焦点顕微鏡およびストック試薬を用いて非常に再現性が高く、実行しやすい方法論を可能にする蛍光標識抗体の生体内投与に続くex vivoイメージング戦略を示す。抗体の皮下注射を通じて、従来の免疫蛍光顕微鏡技術によって損傷を受ける可能性のある組織構造に影響を与えることなく、RNを排出する異なる細胞集団に標識することができる。
Introduction
リンパ節(LN)は、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする重要な機能を持つ全身に広く存在する卵形の器官である。LNは、それらに対する免疫応答をマウントするために異物粒子および癌細胞を同定するためにリンパを濾過する1.抗原提示細胞(APC)、T細胞およびB細胞は、抗原特異的抗体(体液性免疫)および細胞傷害性リンパ球(細胞性免疫)を生成するために一緒に働き、外来粒子および癌細胞2を排除する。したがって、リンパ系に存在する免疫細胞のダイナミクスを理解することは、ワクチン開発とがん免疫療法に重要な意味を持つであろう。
新しい共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡を含む強力な顕微鏡の出現は、異なる免疫細胞集団が彼らのネイティブ環境でどのように振る舞うかを理解する上で並外れた進歩を可能にしました3。特定の標的4、5の制御下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスとのプローブの組み合わせを用いて、複数の同時細胞サブタイプを画像化することが可能となった。実際、質量サイトメトリーやマルチパラメトリックフロー解析などの高次元技術は、健康と疾患における異なる免疫細胞の区画化と機能性に関する知識を拡大するために重要であり、7.しかし、これらの技術のためのサンプルを調用するために、組織は消化を必要とし、細胞は細胞懸濁液で分析される自然なmilieuから分離される。これらの制限を超え、生物学のより良い翻訳を可能にするために、ここで提案されるプロトコルの目標は、改善された速度、組織の利点を持つストック共焦点顕微鏡を使用して、画像ex vivo全リンパ節に簡単な方法論を適用することです。構造保存、および従来の免疫蛍光染色と比較した細胞生存率。このアプローチを用いて、病原体4に対する宿主早期防御に関与するTリンパ球のサブタイプであるγδ T細胞に対するマウス欠損が、野生型マウスと比較して卵胞およびT細胞ゾーンを損なっていることを示すことができた。これらの知見により、βT細胞がリンパ球器官の恒常性と体液性免疫応答4の恒常性において重要な役割を果たすことを実証した研究を行うことが可能となった。さらに、このプロトコルは、プローブと抗体がリンパ節に到達するための生理学的経路を提供し、皮下に投与され、組織リンパ循環を通じて消散するので、その場標識で使用された以前の報告に基づいて構築するリンパ系関連構造8、9、胚中心ダイナミクス10、11、12、および血流に容易にアクセス可能な標的を可視化する抗体を用いて13 、14、15.
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Protocol
このプロトコルは、ハーバード大学医学部とブリガム・アンド・ウィメンズ病院の動物常任委員会(プロトコル2016N000230)によって承認されました。
1. 実験に使用したマウス
- 抗体ミックスを投与するためにB6の背景に8週齢の雄および雌マウスを使用する。
- CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WTマウスを使用して、抗体ミックスを投与せずにレポーターマウスにもex vivo全体LNイメージングを適用できるかどうかを判断し、抗原提示を含む単核細胞の存在を調べることができます。細胞および咽頭細胞、およびLNにおけるその分布。
注:CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WTレポーターマウスは、それぞれCX3CR1およびCCR2プロモーターの制御下に挿入された緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(RFP)を有する。レポーターマウスは、抗体ミックスの注射の有無にかかわらず使用することができる。レポーターマウスにおける抗体ミックス注射については、リファレンス4を参照してください。抗体が注入されない場合は、手術に進みます。
2. 抗体ミックス製剤および注射
注: 手順 1.1 で説明するマウスに対して、次の手順を実行します。
- ブリリアントバイオレット(BV)421アンチCD4(GK1.5; 0.2 mg/mL、ブリリアントブルー(BB)515アンチCD19(1D3;0.2mg/mL)の1:10、フィコエリスリン(PE)抗F4/80(T45-2342;0.2mg/mL)の1:10をPBSに注入する適切な最終容積(内側に注入する)イメージ鼠径部)または足パッド(画像ポピュライト)リンパに。
注:アイソタイプとして使用: BV421マウスIgG2b, kアイソタイプコントロール (R35-38; 0.2 mg/mL);PE ラット IgG2a, κ アイソタイプコントロール (R35-95; 0.2 mg/mL);BB515ラットIgG2a、κ等型制御(R35-95;0.2 mg/mL)。染色抗体を変更する場合は、正しいアイソタイプを使用してください。 - 鼠径部LNを画像化するには、抗体ミックスの100μLを皮下に内腿に注入する(図1A)。あるいは、50μLの抗体ミックスを足パッドに注入し、画像ポプライトLN(図2A)を画像化する。繊細な1 mLインスリン注射器(インスリンU-100)を0.30mm×13mm(30ゲージ×1/2インチ)の針で使用してください。
注:鼠径LN染色の注射は皮下であり、筋肉内(i.m.)ではないことを確認してください。 - 抗体ミックス注射の前に動物を麻酔しないでください。
- 臓器を取り除くために、最低3時間(鼠径dLN)と12h(ポピュライトdLN)ポスト注射を待ちます。
- LN細胞標識が鮮やかな紫色や鮮やかな青色などの大型ポリマー蛍光色素を用いて完全に観察されない場合は、フッ素イソチオシアネート(FITC)、PEおよびアロフィコシアニン(APC)を含む小さな蛍光色素を代替として使用する。
3. 鼠径排水リンパ節を除去する手術手順
- CO2窒息を用いてマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- 粘着テープでアクリル期にマウスを固定し、切開後の毛皮の沈着を防ぐために綿棒でミネラルオイルを腹部の皮膚に塗布する(図1B)。毛皮の除去は必要ありません。
- 陰部手術曲げられたはさみ(11.5cm)と、陰部から腹部の微小外科曲げられた鉗子(12.5 cm)を用いて中線切開を行う(図1C)。
- 皮膚から腹部の筋肉を解離する(図1D)。
- 垂直切開線の上部と下部に水平皮膚切開を行い、目的の側面に皮膚フラップを作成し(抗体ミックス注射の側面に従って)、皮膚をフラップしてリンパ節を可視化する(図1E)。
- アクリルプレートにスキンフラップをテープで留めます(図1F)。
- マイクロ手術曲げられた鉗子を使用して鼠径排水リンパ節を取り除く(図1F)。リンパ節は、皮膚の下の球体、通常は球状の半透明として現れる。
4. 吸引性排水リンパ節を除去する手術手順
- CO2窒息を用いてマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- 粘着テープでアクリルステージ上の傾向のある位置でマウスを固定し、ふくらはぎと膝に綿棒でミネラルオイルを塗布する(図2A-D)。
- かかとから膝までのふくらはぎに中線切開を行う(図2E,F)。
- 皮膚からふくらはぎの筋肉を解離する(図2F,G)。
- ポプライトフォッサ(図2G)を露出します。ポプライトリンパ節は、ポプライトフォッサに半透明球として現れる。
- マイクロサージャリー湾曲鉗子(図2G)を使用して、ポピュライトリンパ節を取り外します。
- または、上の位置にマウスをひっくり返し、かかとから膝へのふくらはぎの中線切開を行い、その後ふくらはぎの解離を行うことにより、二頭筋大腿骨と半腱の間のポプライトフォッサに近づきます。皮膚からの筋肉。
注:ポプライトフォッサは、膝関節の後ろに位置する浅いうつ病です。注意深く開いて、ポピュライトリンパ節を見てください。
5. リンパ節の準備
- ガラス底(35mm x 10mm)で器官全体を培養皿に入れ、マイクロサージャリー曲げられた鉗子を使用して器官を取り囲む脂肪を取り除きます(図1G-Iおよび図2H)。
- 皿の真ん中に器官を一元化する(図1Jおよび図2H)。
- 繊細なタスクワイパーの断片で器官を覆い、室温生理食生食液0.9%またはリン酸バッファー溶液(図1K-Mおよび図2H)で浸しておきます。
注:除去後にリンパ節を洗浄したり、フード内のリンパ節抽出を実行する必要はありません。
6. 元生体共焦点顕微鏡(イメージング)
- ペトリ皿を反転共焦点顕微鏡スロット(図1Nおよび図2H)に配置します。
- 共焦点顕微鏡下の画像LAN(図1Oおよび図2H)。
- まず、目的を4倍または10倍の目的で共焦点顕微鏡の従来の光を用いて正しい焦点を得る。その後、光機能からレーザーモードに変更します。
注:共焦点顕微鏡に4倍の目的が含まれていない場合、焦点は10倍の目的を使用して完全に得ることができる。 - アイソタイプ染色、非染色または非蛍光サンプル(表1)を使用してレーザーパワー、オフセット、ゲインを調整し、画像に示すような蛍光標識抗体からの自己蛍光および非特異的染色を除去します。原稿(BV-421アンチCD4、BB515アンチCD19およびPEアンチF4/80)。
- それぞれ、リンパ節の対象領域にマイクロメトリックとチャリオットを使用して、Z とXYの位置を調整します。
- LN構造と細胞分布に焦点を当てた4倍、10倍、20倍の目標の下で画像を取得します。1024 x 1024 ピクセルの定義を使用します。
注:動物ごとに目的ごとに異なるフィールドで最低5枚の画像を取得します。 - 画像ソフトウェアを使用して画像を分析し、チャンネルを分離し、対象のスケールと色を追加し、3D ビューを再構築します。
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Representative Results
この原稿は、これらの器官の特定の細胞集団を染色するために蛍光標識抗体を注入した後、その構造を損傷することなく鼠径およびポピライトリンパ節を除去する技術を示しています(図1および図2)).
BV421抗CD4およびBB515抗CD19および共焦点イメージング解析を用いたLN細胞の免疫標識の強力な組み合わせは、鼠径およびポピュライトLNにおけるT細胞(CD4+)およびB細胞(CD19+)の局在を定義した。両器官において、B細胞卵胞はT細胞集団(図3、図4およびビデオ1)に囲まれ、LN構造1の特徴である。リンパ洞を覆う食細胞が注入された蛍光抗体を捕捉し、細胞マーカーの非特異的標識をもたらす可能性を排除するために、PE抗F4/80は抗体ミックスに含まれていた。図5に示すように、食細胞は注入された抗体を内部化しなかったが、BおよびT細胞染色が特異的であったことを示す。また、ビデオ1は、TおよびB細胞染色が重ならなかったことを示し、染色特異性を確認した。
LNにおける食細胞単核細胞の空間的局在化を調べるために、CX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+からの鼠径およびポピライトLNを画像化した。単核細胞は、皮下副頭頸部を含む鼠径部LN全体で見出された。これらの細胞の大半はCX3CR1GFP/+で、次いでCCR2RFP/+および二重陽性細胞(黄色)であった(図6A-F)。ポピュライトLN(図7A-I)では、細胞分布と細胞型の同じパターンが観察された。鼠径およびポピライトLNの両方が、リンパ球によって占有されているCX3CR1GFP/+ CCR2RFP/+を持たない黒い領域を示した。また、CX3CR1+およびCCR2+細胞は、LNの内側領域に乏しく、外側領域に集中し、これらの細胞が主にLNサブカプセル副頭腸を占めていることを示す(図6G-Iおよび図7J-L)。したがって、提案されたプロトコルは、リンパ節に存在する主要な細胞集団を明確に定義することができる。
図1:鼠径リンパ節調製。
(A) FACS抗体マスターミックスの皮下注射を内腿に注入する。(B)3時間後、マウスを安楽死させ、粘着テープでアクリル板にマウスを固定し、切開後の毛皮の沈着を防ぐために腹部の皮膚にミネラルオイルを塗布する。(C) 陰気からキシフスプロセスに腹部の中線切開を行う。(D) 皮膚から腹部の筋肉を解離し、皮膚フラップを行う。(E) アクリルプレートにスキンフラップをテープで留めます。(F) 微小外科曲げられた鉗子を使用して鼠径リンパ節を取り除く。(G-H)オルガンを培養皿(G)に入れ、器官(H)を取り囲む脂肪を取り除きます。(I) 洗浄後の臓器サイズを示す図図。J-M)ペトリ皿(J)の真ん中に器官を集中化し、繊細なタスクワイパー(K)で器官を覆い、0.9%の生理食生理食トリネまたは1x PBS(L,M)で浸しておきます。(N) ペトリ皿を顕微鏡スロットに置きます。(O)オルガンをスキャンします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ポプライトリンパ節調製。
(A, B)FACS抗体マスターミックスの皮下注射を足パッドに入れ。(C,D)3時間後に、マウスを安楽死させ、粘着テープ(C)でアクリル板上にマウスを固定し、切開(D)の周りの毛皮の沈着を防ぐために腹部の皮膚にミネラルオイルを塗布する( D)。(E) かかとから膝にふくらはぎに中線切開を行う。(F) ポプライトフォッサを露出させる。(G) マイクロサージャリー湾曲鉗子を使用して、ポピュライトリンパ節を取り除きます。(H) 臓器をペトリ皿に入れ、臓器を取り囲む脂肪を取り除き、ペトリ皿の真ん中に臓器を集中化し、繊細な作業ワイパーで臓器を覆い、暖かい生理食生に0.9%または1x PBSを浸しておきます。ペトリ皿を顕微鏡スロットに置き、器官をスキャンします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:非免疫ナイーブマウスの鼠径リンパ節全体の代表的な共焦点顕微鏡画像。
(A-C)LN BおよびT細胞をCD4(緑色;を用いて染色した。T細胞)およびCD19(赤色;Bセル);スケールバー = 50 μm。(D-I)10倍の目的を持つ特定の領域の増幅;スケールバー = 30 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:非免疫ナイーブマウスの全ポプライトリンパ節の代表的な共焦点顕微鏡画像。
(A-C)LN BおよびT細胞をCD4(緑色;を用いて染色した。T細胞)およびCD19(赤色;Bセル);スケールバー = 60 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:食細胞を示す非免疫ナイーブマウスの鼠径リンパ節全体の代表的な共焦点顕微鏡画像。
(A-C)LN Bおよび咽頭細胞をCD19(緑色;を用いて染色した。B細胞)およびF4/80(青、咽頭細胞);スケールバー = 100 μm;(D-F)LN Tおよび咽頭細胞をCD3(緑色;を用いて染色した。T細胞)およびF4/80(白、咽頭細胞);スケールバー = 100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:遺伝子組み換えCX3CR1の鼠径リンパ節全体の共焦点顕微鏡画像GFP/+CCR2RFP/+抗体マスターミックス注射なしのマウス。
(A-C)LNセル分布は、CX3CR1(緑色)とCCR2(赤色)で評価した。スケールバー = 100 μm。(D-F)20倍の目的を持つ特定の領域の増幅;スケールバー = 50 μm。(G-I)リンパ節部生床におけるLN細胞分布;スケールバー = 100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:遺伝子組み換えCX3CR1の全ポプライトリンパ節の共焦点顕微鏡画像GFP/+CCR2RFP/+抗体マスターミックス注射なしのマウス。
(A-C)LNセル分布は、CX3CR1(緑色)とCCR2(赤色)で評価した。スケールバー = 200 μm。(D-F)10倍の目的を持つ臓器全体の増幅;スケールバー = 100 μm。(G-I)20倍の目的を持つ特定の領域の増幅;スケールバー = 50 μm。(J-L)リンパ節部生床におけるLN細胞分布;スケールバー = 100 μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:TおよびB細胞染色の特異性(右クリックしてダウンロード)。
| レーザー | レーザーパワー | 得る | オフセット | ピンホール |
| 406nm | 20% | 65 | -5 | 60μm |
| 488nm | 25% | 50 | -5 | 60μm |
| 561nm | 25% | 65 | -10 | 60μm |
表 1: 画像の取得設定。
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Discussion
イメージングと分子生物学や高次元免疫表現型を含む他の技術との組み合わせは、免疫細胞をネイティブの文脈で調べる能力を高めています。実際、他のアプローチでは組織の消化と細胞の単離が必要になる場合がありますが、組織の完全性を失う可能性がありますが、生体内またはex vivoイメージングを使用すると、地理的な方法で異なる細胞サブタイプを調査する上で大きな利点が得られます3,16.細胞が異なる蛍煙を発現するために特異的に標的とされる遺伝子組み換えマウス株の利用可能性が急速に増加しているのは驚くべきことではない。重要なことに、レポーターマウスと抗体ミックスの注射の組み合わせは、同じ器官4内の異なる細胞集団を染色する強力なツールである。さらに、CRISPR/Cas9のような遺伝子編集ツールの普及により、異なるグループがマウス株をカスタマイズすることができ、事実上あらゆる細胞型が彼らの正真正の位置17で画像化できるようになりました。このアプローチを使用して、異なる細胞タイプ間の空間的および機能的な関係を詳細に評価することができます。しかし、生体内の細胞運動や動的事象のイメージングが必須でない場合は、より複雑でない実験的アプローチを使用できます。この場合、抗体およびプローブは生体内で送達され、器官(またはサンプル)は顕微鏡で直接視覚化される。
ここでは、組織の凍結保存と凍結切除の使用を分配し、臓器構造に影響を与える可能性があり、生体内投与に続くリンパ節内の免疫細胞の鑑定を可能にする簡単なプロトコルを説明しました。蛍光標識抗体。これらのプロトコルは、最小限の技術的および外科的スキルを必要とし、元の場所で事実上任意の免疫細胞を視覚化するために適応することができました。重要なことに、我々は、抗原と細胞が免疫応答中に移動するのと同じ経路を使用してリンパ節に到達する方法で抗体を投与することを提案した。皮下空間に蛍光抗体を注入することにより、生体内で見つかったすべての組織および造語的障壁を模倣し、抗原消散の年表を推定することが可能であった。この応用に加えて、この方法は、蛍光標識薬物の生体分布および蛍光標識ナノ粒子の細胞標的化研究に適用され、有用である。
ただし、この方法には制限があります。必要な抗体の量は、従来の機関科法に比べて高い。しかし、従来の免疫蛍光顕微鏡は、技術を最適化し、良好な画像を得るために組織の調製と染色の数ラウンドを必要とするので、従来の顕微鏡検査のコストは潜在的に高いコストを克服することができます我々のプロトコルで採用されている抗体濃度。次に、リンパ節9、18へのリンパ系抗原排水の既知の特性に基づいて、標識試薬の大きさに起因するリンパ性血管系までの距離に伴って標識の効率が急速に低下する可能性がある。採用。実際、画像の一部の黒い領域は、組織の浸透不良から生じる可能性があります。LNの共焦点イメージングでは、深さが40~100μmしか実現できないため、表面的なLN領域のみを可視化できます。少なくとも部分的にこの問題を克服する1つの方法は、顕微鏡によるより良い励起と検出で蛍煙を使用することです。別の別のアプローチは、深部組織イメージングの鍵を握り、共焦点単光子レーザーで観察された重度の光散乱問題を回避することが示された近赤外励起波長を有する多光子レーザー顕微鏡を使用することです。顕微鏡検査19.生体内で送達された抗体によって染色された画像化細胞の場合、細胞表面に発現される抗原のみを標的とすることができる。使用される抗体がまだ検証されていない場合は、自己蛍光を排除し、標識を検証するために、対応するアイソタイプ制御染色を行うことが重要になります。これは、同じ動物、すなわち、逆に注入されたイプシトラルおよびアイソタイプ制御ミックスを注入した細胞標的抗体ミックスで行うことができる。さらに、生体内の細胞を効率的に染色するために必要な抗体の量は、実験と細胞株の間で異なり、この制限に対する代替アプローチは、遺伝的標的蛍光発現を使用することである。
結論として、我々は、組織の建築の完全性を維持し、再現性があり、容易であり、従来の共焦点顕微鏡を使用する全リンパ節イメージングのための新しいプロトコルを提案する。この技術は、単純な方法が、通常の実験室構造が免疫システム調査の大きな進歩を可能にする多機能プラットフォームとして機能する方法を示しています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この作品はNIH(R01 AI43458~H.L.W.)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | - | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | - | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | - | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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