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Biology

पूर्व Vivo Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिम्फ नोड संरचना और सेलुलर स्थानीयकरण कल्पना

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59335
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Gastrointestinal Biology, Federal University of Minas Gerais
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल अंग संरचना में परिवर्तन के बिना लिम्फ नोड्स draining में विभिन्न सेल आबादी छवि के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है.

Abstract

लिम्फ नोड्स (LNs) शरीर के भीतर फैले हुए अंग हैं, जहां सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाअनुकूली प्रतिरक्षा के साथ जुड़ सकती है। वास्तव में, LNs रणनीतिक लसीका वाहिकाओं के रास्ते में interposed रहे हैं, LN में सभी निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ ऊतक प्रतिजनों के अंतरंग संपर्क की अनुमति. इस प्रकार, सेलुलर संरचना, वितरण, स्थान और पूर्व vivo पूरे LN इमेजिंग का उपयोग कर बातचीत को समझने कैसे शरीर स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं निर्देशांक पर ज्ञान के लिए जोड़ देगा. इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी है कि पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप और शेयर अभिकर्मकों का उपयोग करके एक बहुत reproducible और आसान करने के लिए प्रदर्शन पद्धति की अनुमति देता है की एक vivo प्रशासन के बाद एक पूर्व vivo इमेजिंग रणनीति से पता चलता है. एंटीबॉडी के subcutaneous इंजेक्शन के माध्यम से, यह ऊतक संरचनाओं है कि संभावित रूप से एक पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीक से क्षतिग्रस्त हो सकता है को प्रभावित किए बिना LNs draining में विभिन्न सेल आबादी लेबल करने के लिए संभव है.

Introduction

लिम्फ नोड्स (LNs) सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पाटने के महत्वपूर्ण समारोह के साथ पूरे शरीर में व्यापक रूप से मौजूद ओवॉइड आकार के अंग हैं। एल एन एस विदेशी कणों और कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लसीका को फिल्टर करता है ताकि उनके खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंटकिया जासके 1 . एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs), टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए (ह्यूमरल प्रतिरक्षा) और साइटोटॉक्सिक लिम्फोसाइटों (सेलुलर प्रतिरक्षा) विदेशी कणों और कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए2. इस प्रकार, लसीका प्रणाली में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को समझने के टीके के विकास और कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा।

नए शंखऔर सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप सहित शक्तिशाली सूक्ष्मदर्शी के आगमन ने यह समझने में असाधारण प्रगति की अनुमति दी है कि विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका की आबादी अपने मूल वातावरण में किस प्रकार व्यवहार करती है3. अब आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ जांच के संयोजन का उपयोग करके कई एक साथ सेल उपप्रकारों की छवि करना संभव है जो विशिष्ट लक्ष्यों के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं4,5. वास्तव में, उच्च आयामी तकनीक, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री और बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह विश्लेषण सहित स्वास्थ्य और रोग6में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका commentalization और कार्यक्षमता पर हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण किया गया है, 7. तथापि, इन तकनीकों के लिए नमूने तैयार करने के लिए, ऊतकों पाचन की जरूरत है और कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक वातावरण से अलग कर रहे हैं सेल निलंबन में विश्लेषण किया जा करने के लिए. इन सीमाओं को पार करने और जीव विज्ञान में एक बेहतर अनुवाद की अनुमति देने के लिए, यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल का लक्ष्य छवि पूर्व vivo पूरे लिम्फ नोड्स के लिए एक सीधी पद्धति लागू करने के लिए बेहतर गति के लाभ के साथ शेयर confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहा है, ऊतक संरचना संरक्षण, और सेल व्यवहार्यता पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की तुलना में. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम यह दिखाने में सक्षम थे कि चूहों की कमी के लिए जेड टी कोशिकाओं, टी लिम्फोसाइट के एक उपप्रकार रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक रक्षा की मेजबानी में शामिल4, follicles और टी सेल क्षेत्रों के रूप में जंगली प्रकार चूहों की तुलना में समझौता किया है. इन निष्कर्षों ने हमें एक अध्ययन करने की अनुमति दी जिसमें हमने यह प्रदर्शित किया कि लसीकाभ अंगों के होमियोस्टेसिस और हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया4में टी कोशिकाएं महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं . इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल जांच और एंटीबॉडी लिम्फ नोड तक पहुँचने के लिए के लिए एक शारीरिक मार्ग प्रदान करता है, के रूप में वे subcutaneously प्रशासित रहे हैं और ऊतक लसीका परिसंचरण के माध्यम से नष्ट, पिछले रिपोर्ट है कि situ लेबलिंग में इस्तेमाल किया पर निर्माण एंटीबॉडी के साथ लसीका-संबद्ध संरचनाओं की कल्पना करने के लिए8,9, germinal केंद्र गतिशीलता10,11,12, और लक्ष्य रक्त प्रवाह के लिए आसानी से सुलभ13 ,14,15.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को हार्वर्ड मेडिकल स्कूल और ब्रिघम और महिला अस्पताल, प्रोटोकॉल 2016N0000230 में जानवरों पर स्थायी समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया चूहे

  1. एंटीबॉडी मिश्रण प्रशासन के लिए B6 पृष्ठभूमि पर 8 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला चूहों का प्रयोग करें.
  2. का प्रयोग करें CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT चूहों निर्धारित करने के लिए कि क्या पूर्व vivo पूरे LN इमेजिंग भी एंटीबॉडी मिश्रण प्रशासन के बिना रिपोर्टर चूहों के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच करने के लिए, एंटीजन पेश सहित कोशिकाओं और phagocytes, और LN में उनके वितरण.
    नोट: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT रिपोर्टर चूहों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) CX3CR1 और CCR2 प्रमोटरों के नियंत्रण में डाला, क्रमशः है. रिपोर्टर चूहों के साथ या एंटीबॉडी मिश्रण के इंजेक्शन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है. कृपया एक रिपोर्टर माउस में एंटीबॉडी मिश्रण इंजेक्शन के लिए संदर्भ4 देखें. कोई एंटीबॉडी इंजेक्शन किया जाएगा, तो सर्जरी के लिए आगे बढ़ें।

2. एंटीबॉडी मिश्रण तैयारी और इंजेक्शन

नोट: चरण 1.1 में वर्णित चूहों पर इन चरणों को निष्पादित करें।

  1. शानदार बैंगनी (बीवी) 421 विरोधी CD4 (GK1.5) के विलेय 1:10; 0.2 mg/mL), 1:10 शानदार नीले (बीबी) 515 विरोधी CD19 (1D3; 0.2 mg/mL) और 1:20 phycoerythrin (पीई) विरोधी F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) पीबीएस में अंतिम मात्रा के साथ भीतर में इंजेक्ट करने के लिए (उच्च) में इंजेक्ट करने के लिए छवि inguinal) या पंजा पैड में (छवि popliteal करने के लिए) लसीका.
    नोट: isotypes के रूप में प्रयोग करें: BV421 माउस IgG2b, कश्मीर Isotype नियंत्रण (R35-38; 0.2 mg/mL); पीई चूहा IgG2a, [ इसोटाइप नियंत्रण (R35-95; 0.2 mg/ BB515 चूहा IgG2a, ] इसोटाइप नियंत्रण (R35-95; 0.2 mg/ यदि धुंधला एंटीबॉडी बदलने, सही आइसोटाइप का उपयोग करें.
  2. वानुकारी एलएन की छवि बनाने के लिए, एंटीबॉडी मिश्रण का 100 डिग्री सेल्सियस भीतरी जांघ में इंजेक्ट करें (चित्र 1क)। वैकल्पिक रूप से, छवि popliteal LN के लिए पंजा पैड में एंटीबॉडी मिश्रण के 50 डिग्री एल subcutaneously इंजेक्ट (चित्र 2A). नाजुक 1 एमएल इंसुलिन सिरिंजों का उपयोग करें, (इंसुलिन यू-100) आकार की सुई के साथ 0.30 मिमी ] 13 मिमी (30 गेज $ 1 $2 इंच).
    नोट: सुनिश्चित करें कि वंकिय एलएन धुंधला के लिए इंजेक्शन subaneous है और इंट्रामस्क्युलर नहीं (i.m.), एंटीबॉडी मिश्रण के रूप में ठीक से सूखा नहीं होगा अगर i.m. प्रशासन किया जाता है.
  3. एंटीबॉडी मिश्रण इंजेक्शन से पहले जानवरों anesthetize मत करो।
  4. अंगों को हटाने के लिए कम से कम 3 एच (इंगुइनल डीएलएन) और 12 एच (पॉपलाइटियल डीएलएन) पोस्ट इंजेक्शन के लिए प्रतीक्षा करें।
  5. यदि LN सेल लेबलिंग पूरी तरह से इस तरह के शानदार बैंगनी या शानदार नीले रंग के रूप में बड़े बहुलक फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग नहीं मनाया जाता है, एक विकल्प के रूप में फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइन (FITC), पीई और एलोफोसाइएनिन (एपीसी) सहित छोटे फ्लोरोफोर्स का उपयोग करें।

3. सर्जरी प्रक्रिया inguinal draining लिम्फ नोड को दूर करने के लिए

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 asphyxiation का उपयोग कर चूहों Euthanize.
  2. चिपकने वाला टेप के साथ एक्रिलिक चरण पर चूहों को स्थिर और चीरा के आसपास फर जमाव को रोकने के लिए पेट की त्वचा के लिए एक कपास झाड़ू के साथ खनिज तेल लागू होते हैं (चित्र 1बी)। फर हटाने की आवश्यकता नहीं है.
  3. प्यूबीसे से जिफोइड प्रक्रिया तक पेट में माइक्रोसर्जरी घुमावदार कैंची (11.5 सेमी) और माइक्रोसर्जरी घुमावदार बल (12.5 सेमी) का उपयोग करते हुए एक मिडलाइन चीरा निष्पादित करें (चित्र 1ब्)।
  4. उदर की पेशी को त्वचा से अलग कर दिया जाता है (चित्र 1D)
  5. ब्याज के पक्ष में त्वचा फ्लैप बनाने के लिए ऊर्ध्वाधर चीरा लाइन के ऊपर और नीचे क्षैतिज त्वचा चीरा बनाओ (एंटीबॉडी मिश्रण इंजेक्शन के पक्ष के अनुसार) और लिम्फ नोड कल्पना करने के लिए त्वचा फ्लैप (चित्र 1E)।
  6. एक्रिलिक प्लेट पर त्वचा-फ्लैप टेप करें (चित्र 1 F)।
  7. माइक्रोसर्जरी वक्रित संदंश का उपयोग करके कान्गुइनल draining लिम्फ नोड को निकालें (चित्र 1 एफ)। लिम्फ नोड त्वचा के नीचे एक translucid, आमतौर पर bilobular, क्षेत्र के रूप में दिखाई देगा.

4. सर्जरी प्रक्रिया popliteal draining लिम्फ नोड को दूर करने के लिए

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 asphyxiation का उपयोग कर चूहों Euthanize.
  2. चिपकने वाला टेप के साथ एक्रिलिक चरण पर एक प्रवण स्थिति में चूहों को स्थिर और बछड़ा और घुटने में एक कपास झाड़ू के साथ खनिज तेल लागू (चित्र 2ए डी).
  3. एड़ी से घुटने तक बछड़े में मध्यरेखा चीरा लगाना (चित्र2ई, एफ)।
  4. बछिया की मांसपेशियों को त्वचा से अलग करें (चित्र 2 एफ,जी)।
  5. पॉपलाइटल खात का पर्दाफाश (चित्र 2जी) Popliteal लिम्फ नोड popliteal खात में एक translucid क्षेत्र के रूप में दिखाई देगा.
  6. माइक्रोसर्जरी वक्र बलप्स का उपयोग करके पॉपलाइटल लिम्फ नोड निकालें (चित्र 2जी)।
  7. वैकल्पिक रूप से, supine स्थिति पर माउस बारी, और biceps femoris और popliteal LN हटाने के लिए popliteal LN हटाने के लिए के बीच popliteal खात दृष्टिकोण एड़ी से घुटने के लिए एड़ी से घुटने में एक midline चीरा प्रदर्शन द्वारा बछड़ा के वियोजन के बाद त्वचा से पेशी.
    नोट: Popliteal खात घुटने के संयुक्त के पीछे स्थित एक उथले अवसाद है. पॉपलाइटल लिम्फ नोड को देखने के लिए सावधानी से खोलें।

5. लिम्फ नोड तैयारी

  1. पूरे अंग को कांच के नीचे (35 मिमी x 10 मिमी) के साथ एक संस्कृति डिश में रखें और माइक्रोसर्जरी घुमावदार बलप्स का उपयोग करके अंग के चारों ओर होने वाली वसा को हटा दें (चित्र 1G-I और चित्र 2H)।
  2. डिश के मध्य में अंग को केन्द्रीकृत करना (चित्र 1J और चित्र 2H)।
  3. अंग को नाजुक कार्य वावरों के एक टुकड़े से ढककर कमरे के तापमान से भिगोकर 0ण्9% अथवा फास्फेट बफर घोल (चित्र1ख-म तथा चित्र 2ह) को भिगोकर रखें।
    नोट: यह हटाने के बाद लिम्फ नोड्स धोने के लिए या हुड में लिम्फ नोड निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं है।

6. पूर्व-विवो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (इमेजिंग)

  1. प्रतिलोमित कंफोकल सूक्ष्मदर्शी स्लॉट में पेट्री डिश को स्थिति दें (चित्र 1छ तथा चित्र 2ह)
  2. एक संफोकल सूक्ष्मदर्शी के अधीन छवि लछ्
  3. सबसे पहले, 4x या 10x उद्देश्य के साथ confocal माइक्रोस्कोप के पारंपरिक प्रकाश का उपयोग करके सही ध्यान प्राप्त करें. फिर प्रकाश समारोह से लेजर मोड में बदल जाते हैं।
    नोट: यदि confocal माइक्रोस्कोप एक 4x उद्देश्य शामिल नहीं है, ध्यान पूरी तरह से 10x उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
  4. लेजर शक्ति को समायोजित करें, ऑफसेट और एक आइसोटाइप-सना हुआ, गैर-स्रंज्ड या गैर-फ्लोरोसेंट नमूना का उपयोग कर लाभ (तालिका 1) इस तरह के रूप में इस छवियों में इस्तेमाल किया छवियों में दिखाया लोगों के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी से autofluorscence और विशिष्ट धुंधला हटाने के लिए पांडुलिपि (बीवी-421 विरोधी CD4, BB515 विरोधी CD19 और पीई विरोधी F4/
  5. लिम्फ नोड में रुचि के क्षेत्र पर क्रमशः माइक्रोमीट्रिक और रथ का उपयोग करते हुए, र् और XY स्थितियों को समायोजित की ंी.
  6. 4x, 10x और 20x उद्देश्यों के तहत छवियों का अधिग्रहण LN संरचना और सेलुलर वितरण पर ध्यान केंद्रित. 1024 x 1024-पिक्सेल परिभाषा का उपयोग करें.
    नोट: प्रति जानवर उद्देश्य प्रति विभिन्न क्षेत्रों में पांच छवियों की एक न्यूनतम प्राप्त करें.
  7. चैनलों को अलग करने के लिए, चैनलों को अलग करने के लिए, पैमाने और रुचि के रंग जोड़ने के लिए, और 3 डी दृश्य के पुनर्निर्माण के लिए एक छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस पांडुलिपि इन अंगों में विशिष्ट कोशिका आबादी दाग करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के इंजेक्शन के बाद उनकी संरचना को नुकसान पहुँचाए बिना inguinal और popliteal लिम्फ नोड्स को दूर करने के लिए तकनीक से पता चलता है (चित्र1 और चित्र ाा 2 ).

BV421 विरोधी CD4 और BB515 विरोधी CD19 और confocal इमेजिंग विश्लेषण के साथ LN कोशिकाओं के इम्यूनोलेबलिंग के शक्तिशाली संयोजन inguinal और popliteal LNs में टी कोशिकाओं (CD4+) और बी कोशिकाओं (CD19 +) के स्थानीयकरण परिभाषित. दोनों अंगों में बी कोशिका के रोम टी कोशिका की आबादी से घिरे हुए थे (चित्र 3, चित्र 4 और वीडियो 1), एलएन संरचना1की एक पहचान है . संभावना है कि लसीका साइनस अस्तर phagocytes इंजेक्शन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी पर कब्जा कर सकता है और सेल मार्करों के गैर विशिष्ट लेबलिंग में परिणाम को बाहर करने के लिए, पीई विरोधी F4/80 एंटीबॉडी मिश्रण में शामिल किया गया था. जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है, phagocytes इंजेक्शन एंटीबॉडी internalize नहीं किया, यह दर्शाता है कि बी और टी सेल धुंधला विशिष्ट था. इसके अलावा,वीडियो 1 से पता चलता है कि टी और बी सेल धुंधला ओवरलैप नहीं किया, धुंधला विशिष्टता की पुष्टि.

LN में phagocytic मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, वंक्षण और CX3CR1GFP से popliteal LNs / मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को सभी वानुभ्य एलएन में पाए गए, जिसमें उपकैप्सुलर साइनस भी शामिल है। इन कोशिकाओं के बहुमत CX3CR1GFP/ +थे , CCR2RFP/ और डबल सकारात्मक कोशिकाओं (पीला) के बाद (चित्र 6ए-एफ). पॉपलाइटल एलएन में सेल वितरण और सेल फीनोटाइप्स का एक ही पैटर्न देखा गया (चित्र 7ए-I)। दोनों वंक्ुआइनल और पॉपलाइटल LNs CX3CR1GFP/ + CCR2आरएफपी /+, जो लिम्फोसाइटों द्वारा कब्जा कर रहे हैं बिना काले क्षेत्रों से पता चला। इसके अलावा, CX3CR1 + और CCR2 + कोशिकाओं LNs के भीतरी क्षेत्र में दुर्लभ थे और बाहरी क्षेत्र में केंद्रित है, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से LN subcapsular साइनस पर कब्जा (चित्र6जी-I और चित्र ा7J-L). इस प्रकार, प्रस्तावित प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से लिम्फ नोड्स में मौजूद प्रमुख कोशिका आबादी को परिभाषित कर सकते हैं.

Figure 1
चित्रा 1: इंटूइनल लिम्फ नोड तैयारी।
(क) एफएसीएस एंटीबॉडी मास्टर का उपत्वचा ीय इंजेक्शन आंतरिक जांघ में मिश्रण करता है। (बी) इंजेक्शन के बाद 3 एच, माउस ethanize, चिपकने वाला टेप के साथ एक एक्रिलिक प्लेट पर माउस immobilize और चीरा के आसपास फर जमाव को रोकने के लिए पेट की त्वचा के लिए खनिज तेल लागू होते हैं। (ग) जघन से जिफोइड प्रक्रिया तक पेट में एक मिडलाइन चीरा निष्पादित करें। (घ) पेट की पेशी को त्वचा से अलग कर देते हैं और त्वचा-फ्लाप करते हैं। (ई) एक्रिलिक प्लेट पर त्वचा-फ्लैप को टेप करें। (च) एक माइक्रोसर्जरी घुमावदार बलप्स का उपयोग कर के रूप में वानुकाल लिम्फ नोड निकालें। (जी-एच) अंग को एक संस्कृति डिश (जी) में रखें और अंग के चारों ओर होने वाली वसा को हटा दें (एच) . (मैं) सफाई के बाद अंग के आकार को दर्शाने वाली उदाहरणात्मक तस्वीर। J-M) एक पेट्री डिश ( जम्मू)के बीच में अंग को केंद्रीकृत करें , अंग को नाजुक कार्य वाइपर (कश्मीर) के टुकड़े के साथ कवर करें और गर्म 0.9% नमकीन या 1x पीबीएस (एल, एम) के साथ भिगोए रखें। (छ) पेट्री डिश को सूक्ष्मदर्शी स्लॉट में स्थान दें। (हे) अंग को स्कैन करें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Popliteal लिम्फ नोड तैयारी.
(ए, बी) पंजा पैड में FACS एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के subcutaneous इंजेक्शन. (सी , डी) इंजेक्शन के बाद 3 एच , माउस को इच्छामृत्यु दें , चिपकने वाले टेप (सी) के साथ एक्रिलिक प्लेट पर माउस को स्थिर करें और चीरा (डी) के चारों ओर फर जमाव को रोकने के लिए पेट की त्वचा पर खनिज तेल लगाएं । (ई) एड़ी से घुटने तक बछड़े में मध्यरेखा चीरा लगाना। (एफ) पॉपलाइटल खात को उजागर करें। (जी) माइक्रोसर्जरी-वक्रित संदंश का उपयोग करके पॉपलाइटल लिम्फ नोड निकालें। (एच) अंग को पेट्री डिश में रखें और अंग के चारों ओर होने वाली वसा को हटा दें, पेट्री डिश के बीच में अंग को केंद्रीकृत करें, अंग को नाजुक टास्क वाइपर के टुकड़े के साथ कवर करें और गर्म नमकीन 0.9% या 1x पीबीएस के साथ भिगोए रखें। पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप स्लॉट में रखें और अंग को स्कैन करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: गैर-प्रतिरक्षित भोले चूहों के पूरे वानुकरण लिम्फ नोड्स के प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोपी छवियों.
(ए-सी) LN B और T कोशिकाओं CD4 का उपयोग कर दाग रहे थे (हरा; टी कोशिकाओं) और CD19 (लाल; बी कोशिकाओं; स्केल बार $ 50 डिग्री मी. (डी-I) 10x उद्देश्य के साथ विशिष्ट क्षेत्र का प्रवर्धन; स्केल बार ] 30 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: गैर-प्रतिरक्षित भोले चूहों के पूरे पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स के प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोपी छवियों।
(ए-सी) LN B और T कोशिकाओं CD4 का उपयोग कर दाग रहे थे (हरा; टी कोशिकाओं) और CD19 (लाल; बी कोशिकाओं; स्केल बार - 60 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोपी पूरे inguinal लिम्फ नोड के गैर-प्रतिरक्षित भोले चूहों phagocytes दिखा के चित्र.
(ए-सी) LN बी और phagocytic कोशिकाओं CD19 का उपयोग कर दाग रहे थे (हरा; बी कोशिकाओं) और F4/80 (नीले; phagocytes); स्केल बार $ 100 डिग्री मी; (डी-एफ) एलएन टी और phagocytic कोशिकाओं CD3 का उपयोग कर दाग रहे थे (हरा; टी कोशिकाओं) और F4/80 (सफेद; phagocytes); स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: आनुवंशिक रूप से संशोधित CX3CR1 के पूरे गेहूं लिम्फ नोड्स के Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों जीएफपी/+ सीसीआर 2 आरएफपी/+ चूहों एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण इंजेक्शन के बिना.
(ए-सी) LN सेल वितरण CX3CR1 (हरा) और CCR2 (लाल) के साथ मूल्यांकन किया गया था; स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (डी-एफ) 20x उद्देश्य के साथ विशिष्ट क्षेत्र का प्रवर्धन; स्केल बार $ 50 डिग्री मी. (जी-I) लिम्फ नोड साइनस फर्श में LN सेल वितरण; स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र ााालकृया-संक्षिप् त रूप से संशोधित CX3CR1 के संपूर्ण पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स की संफोकल माइक्रोस्कोपी छवियां जीएफपी/+ सीसीआर 2 आरएफपी/+ चूहों एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण इंजेक्शन के बिना.
(ए-सी) LN सेल वितरण CX3CR1 (हरा) और CCR2 (लाल) के साथ मूल्यांकन किया गया था; स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (डी-एफ) 10x उद्देश्य के साथ पूरे अंग का प्रवर्धन; स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (जी-I) 20x उद्देश्य के साथ विशिष्ट क्षेत्र का प्रवर्धन; स्केल बार $ 50 डिग्री मी. (जे-एल) लिम्फ नोड साइनस फर्श में LN सेल वितरण; स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video 1
वीडियो 1: टी और बी सेल धुंधला की विशिष्टता (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

लेजर लेजर पावर लाभ ऑफ़सेट Pinhole
406एनएम 20% 65 -5 60 डिग्री मी
488एनएम 25% 50 -5 60 डिग्री मी
561nm 25% 65 -10 60 डिग्री मी

तालिका 1: छवि प्राप्ति सेटिंग.

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Discussion

आणविक जीव विज्ञान और उच्च आयामी इम्यूनोफेनोटाइपिंग सहित अन्य तकनीकों के साथ इमेजिंग के संयोजन ने हमारे मूल संदर्भ में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच करने की क्षमता को बढ़ाया है। वास्तव में, जबकि अन्य दृष्टिकोण ऊतक पाचन और सेल अलगाव की आवश्यकता हो सकती है - जो ऊतक अखंडता के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं - vivo या पूर्व विवो इमेजिंग में का उपयोग एक भौगोलिक फैशन में विभिन्न सेल उपप्रकारों की जांच में एक महान लाभ अनुदान3 , 16.यह आश्चर्य की बात नहीं है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों की उपलब्धता जिसमें कोशिकाओं को विशेष रूप से विभिन्न फ्लोरोफोर्स व्यक्त करने के लिए लक्षित किया जाता है तेजी से बढ़ रही है। महत्वपूर्ण बात, रिपोर्टर चूहों के संयोजन और एंटीबॉडी मिश्रण के इंजेक्शन एक ही अंग4में विभिन्न सेल आबादी में जीव दाग करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, CRISPR/Cas9 जैसे जीन संपादन उपकरणों के लोकप्रिय होने से विभिन्न समूहों को अपने माउस उपभेदों को इस तरह से अनुकूलित करने की अनुमति मिली है कि वस्तुतः किसी भी प्रकार को अब उनके सदाशयी स्थान17में छवि बना सकते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, विभिन्न सेल प्रकार के बीच स्थानिक और कार्यात्मक संबंध गहरी जानकारी में मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि, अगर कोशिका आंदोलन या विवो में गतिशील घटनाओं की इमेजिंग अनिवार्य नहीं हैं, एक कम जटिल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, एंटीबॉडी और जांच विवो में वितरित कर रहे हैं, और अंग (या एक नमूना) सीधे माइक्रोस्कोप में कल्पना की है.

यहाँ हम एक सीधा प्रोटोकॉल है कि ऊतक cryopservation और cryosectioning है कि संभावित अंग संरचनाओं को प्रभावित कर सकते हैं और के विवो प्रशासन में निम्नलिखित लिम्फ नोड्स के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सराहना की अनुमति का उपयोग वितरित वर्णित फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी. इन प्रोटोकॉल कम से कम तकनीकी और शल्य चिकित्सा कौशल की मांग की और उनके मूल स्थान में लगभग किसी भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, हम प्रस्ताव है कि एंटीबॉडी एक तरह से प्रशासित किया जाना चाहिए कि वे एक ही रास्ते है कि प्रतिजनों और कोशिकाओं को एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान यात्रा का उपयोग कर लिम्फ नोड्स तक पहुंच जाएगा. अधस्त्वक् अंतरिक्ष में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन द्वारा, यह सभी ऊतकों और हीमोडायनामिक बाधाओं vivo में पाया नकल और प्रतिजन क्षय के कालक्रम का अनुमान लगाने के लिए संभव था। इस आवेदन के अलावा, इस विधि लागू किया जा सकता है और फ्लोरोसेंट लेबल नैनोकणों के पुष्प-लेबल दवाओं और सेल-लक्ष्यीकरण अध्ययन के biodistribution के लिए उपयोगी है।

हालांकि, इस विधि के लिए सीमाएँ हैं। आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा पारंपरिक ऊतक विज्ञान विधियों की तुलना में अधिक है; हालांकि, के बाद से पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसी माइक्रोस्कोपी ऊतक तैयारी और धुंधला के कई दौर की आवश्यकता है ताकि तकनीक का अनुकूलन और अच्छा चित्र प्राप्त करने के लिए, पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की लागत संभावित उच्च की लागत को दूर कर सकते हैं एंटीबॉडी एकाग्रता हमारे प्रोटोकॉल में कार्यरत. अगले, लिम्फ नोड में लसीका प्रतिजन जल निकासी के ज्ञात गुणों के आधार पर9,18, लेबलिंग की दक्षता तेजी से लेबलिंग अभिकर्मक के आकार के कारण लसीका वाहिका विन्यास के लिए दूरी के साथ कम होने की संभावना है कार्यरत. दरअसल, छवियों में से कुछ में काले क्षेत्रों गरीब ऊतक प्रवेश से परिणाम हो सकता है. केवल 40-100 डिग्री गहराई में LN के confocal इमेजिंग के साथ प्राप्त किया जा सकता है, और इस प्रकार केवल सतही LN क्षेत्रों कल्पना की जा सकती है. कम से कम आंशिक रूप से इस मुद्दे को दूर करने के लिए एक तरह से बेहतर उत्तेजना और माइक्रोस्कोप द्वारा पता लगाने के साथ फ्लोरोफोर का उपयोग करने के लिए है. एक अन्य वैकल्पिक दृष्टिकोण के पास-infrared उत्तेजना तरंगदैर्ध्य है कि गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण किया गया है और confocal एकल फोटॉन लेजर के साथ मनाया गंभीर प्रकाश बिखरने मुद्दों को दरकिनार करने के लिए दिखाया गया था के साथ multiphoton लेजर माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए है माइक्रोस्कोपी19| इमेजिंग कोशिकाओं के मामले में एंटीबॉडी कि vivo में वितरित किए गए द्वारा दाग, केवल प्रतिजनों कि सेल की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं लक्षित किया जा सकता है. यदि उपयोग किए गए एंटीबॉडी को अभी तक मान्य नहीं किया गया है, तो ऑटोफ्लोरेसीकोस को बाहर करने और लेबलिंग को मान्य करने के लिए संगत समप्रकार नियंत्रण धुंधला करना महत्वपूर्ण हो जाता है। यह एक ही जानवर में किया जा सकता है, यानी, सेल को लक्षित एंटीबॉडी मिश्रण ipsilaterally और आइसोटाइप नियंत्रण मिश्रण contralaterally इंजेक्शन. इसके अलावा, कुशलता पूर्वक विवो में एक सेल दाग करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा प्रयोगों और सेल लाइनों और इस सीमा के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के बीच भिन्न हो सकते हैं आनुवंशिक लक्षित फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए है.

अंत में, हम पूरे लिम्फ नोड इमेजिंग के लिए एक नया प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जो ऊतक वास्तु अखंडता का कहना है, पुन: उत्पादन योग्य, आसान करने के लिए प्रदर्शन और पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस तकनीक को दर्शाता है कि कैसे सरल तरीकों नियमित रूप से प्रयोगशाला संरचनाओं पाली कार्यात्मक प्लेटफार्मों कि प्रतिरक्षा प्रणाली की जांच में प्रमुख अग्रिम सक्षम के रूप में काम करने की अनुमति दे सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम NIH द्वारा समर्थित किया गया था (R01 AI43458 H.L.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV421 anti-CD4 BD Horizon 562891 GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19 BD Horizon 564509 1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control BD Horizon 564418 R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control BD Horizon 562603 R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish Greiner-Bio 627861 35x10 mm with glass bottom
Insulin syringes BD Plastipak - Insulin U-100
Kimwipes Kimtech Science Brand 7557 size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps WEP Surgical Instruments custom made 12.5 cm
Microsurgery curved scissors WEP Surgical Instruments custom made 11.5 cm
Needle BD PrecisionGlide - 30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head Nikon - loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80 BD Pharmigen 565410 T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control BD Pharmigen 553930 R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope Zeiss - loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)

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References

  1. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  2. Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
  3. David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
  4. Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
  5. Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
  6. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
  7. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  8. McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
  9. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  10. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
  11. Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
  12. Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
  13. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  14. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
  15. Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
  16. Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
  17. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  18. Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
  19. Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).

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जीव विज्ञान अंक 150 Confocal माइक्रोस्कोपी इंगुइनल लिम्फ नोड Popliteal लिम्फ नोड लिम्फ नोड साइनस टी सेल बी सेल.
पूर्व Vivo Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिम्फ नोड संरचना और सेलुलर स्थानीयकरण कल्पना
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Rezende, R. M., Lopes, M. E.,… More

Rezende, R. M., Lopes, M. E., Menezes, G. B., Weiner, H. L. Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e59335, doi:10.3791/59335 (2019).

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