Summary
Presentert her er en protokoll for å studere farmakologiske responser i prostata epitel organoids. Organoids ligner i vivo biologi og recapitulate pasienten genetikk, noe som gjør dem attraktive modellsystemer. Prostata organoids kan etableres fra wildtype prostates, genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft.
Abstract
Presentert her er en protokoll for å studere farmakodynamikk, stilk cellen potensial, og kreft differensiering i prostata epitel organoids. Prostata organoids er androgen responsive, tredimensjonale (3D) kulturer dyrket i et definert medium som ligner på prostata epitel. Prostata organoids kan etableres fra vill-type og genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft. Viktigere, pasient avledet organoids ligner svulster i genetikk og in vivo tumor biologi. Videre kan organoids bli genetisk manipulert ved hjelp av CRISPR/Cas9 og shRNA systemer. Disse kontrollerte genetikk gjør organoid kulturen attraktiv som en plattform for raskt å teste effekten av genotyper og mutational profiler på farmakologiske responser. Imidlertid må eksperimentelle protokoller være spesielt tilpasset 3D natur organoid kulturer å få reproduserbar resultater. Beskrevet her er detaljerte protokoller for å utføre seeding analyser for å bestemme organoid formasjon kapasitet. Deretter viser denne rapporten hvordan du utfører medikament behandling og analyserer farmakologisk respons via levedyktighet målinger, protein isolasjon, og RNA isolasjon. Til slutt beskriver protokollen hvordan man skal forberede organoids for xenografting og påfølgende in vivo vekst analyser ved hjelp av subkutan pode. Disse protokollene gir svært reproduserbar data og er allment anvendelig for 3D-kultur systemer.
Introduction
Drug motstand er en av de store kliniske problemer i kreft behandling. Metastatisk prostata kreft (PCa) behandling er primært rettet mot androgen-signalering aksen. Neste generasjons anti-androgen behandling (f. eks, enzalutamid og abirateron) har vist stor klinisk suksess, men nesten alle PCa etter hvert utvikler seg mot en androgen-uavhengig stat, eller kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC).
Aktuelle genomisk og transcriptomic profilering av CRPC avslørt er det tre generelle mekanismer for resistens i prostata kreft: 1) aktivering mutasjoner resulterer i restaurering av androgen reseptor (AR) signalering1; 2) aktivering av bypass signalering, som illustrert i en pre-klinisk modell for neste generasjons anti-androgen terapi motstand der aktivering av glukokortikoid reseptor (GR) kan kompensere for tap av AR signalering2; og 3) den nylig identifiserte prosessen med avstamning plastisitet, der tumorceller erverve motstand ved å bytte linjene fra en celle type avhengig av stoffet målet til en annen celle type som ikke er avhengig av dette (som i PCa, er representert som AR-negative og/eller Nevroendokrine sykdom [NEPC])3,4. Men den molekylære mekanismer som forårsaker resistens er ikke forstått. Videre ervervet anti-androgen motstand kan føre til terapeutiske sårbarheter som kan utnyttes. Derfor er det viktig å evaluere narkotika responser i modellsystemer som etterligner pasientens fenotyper og genotyper.
Prostata organoids er organotypic kulturer dyrket i en 3D protein matrise med et definert medium. Viktigere, prostata organoids kan etableres fra godartet og kreft vev av murine eller menneskelig opprinnelse, og de beholder fenotypiske og genotypisk funksjoner funnet i vivo5,6. Viktigere, både anti-androgen sensitive PCa og CRPC celler er representert i dagens samling av organoids. Videre prostata organoids er lett genetisk manipulert bruker CRISPR/Cas9 og shRNA5. Dermed prostata organoids er et passende modell system for testing narkotika responser og Elucidating motstand mekanismer. Her er en detaljert protokoll beskrevet for å utføre narkotika testing og analysere farmakologiske reaksjoner ved hjelp av prostata organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbeid som er beskrevet i denne protokollen er utført med tidligere etablerte murine organoids og pasient-avledet organoids. Alle dyr arbeidet ble utført i samsvar med retningslinjene for Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Alle pasient-avledet vev ble samlet i samsvar med regler og forskrifter av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. middels og buffer forberedelse
- Tine matrise for kjeller membran (f.eks. Matrigel) ved 4 ° c over natten før eksperimentet startes. Oppbevar den på is under bruk.
- Plasser kultur plater ved 37 ° c i 24 timer før eksperimenter. Dette vil hjelpe kjelleren membran matrise kuppel (heretter referert til som matrise kuppel) til polymeres. Plating organoids er beskrevet i trinn 2.1.2.
- Klargjør organoid medium i henhold til den etablerte protokoll5.
- Klargjør organoid medium uten tilsetning av epidermal vekstfaktor (EGF; se tabell over materialer for komponenter). EGF undertrykker AR transcriptional output og tildeler anti-androgen motstand5.
- Forbered Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum (FBS).
Merk: dette mediet brukes til å hemme enzymatisk fordøyelsen med Trypsin utskifting i seksjoner 2-4. - Forbered narkotika løsninger i henhold til produsentens protokoll. For enzalutamid/mdv3100 (heretter referert til som andre generasjons anti-androgen), utarbeide en lagerløsning av 100 μM i dimethyl sulfoxide (DMSO). Aksjen kan oppbevares ved-20 ° c i inntil 6 måneder og må ikke gjøres fersk.
2. isolasjon, enzymatisk fordøyelse, og etablering av organoids
- Isolere prostata organoids fra mus eller menneskelig vev i henhold til tidligere etablerte protokoller5,7. Du finner en kort beskrivelse nedenfor.
- Hakke og enzymatisk fordøye prostata vev å produsere en enkelt celle suspensjon. I dette eksperimentet, 1 mL 5 mg/mL kollagenase type II i ADMEM/F12 ble brukt for fordøyelsen av 50 mg prostata vev.
- Samle celler ved sentrifugering på 300 x g for 5 min, telle cellene, resuspend dem i kjelleren membran matrise, og plate på den aktuelle tettheten5,7 i Matrix Domes på pre-varmet organoid kultur plater (plating metoden er vist i figur 1A).
- La kupler stivne og legge Media på toppen av kupler slik at de er helt dekket.
- Vokse organoids til ønsket mengde for nedstrøms applikasjoner. Celle tall kan bestemmes av standard opptellings metoder. Se den applikasjonsspesifikke delen av protokollen for mer informasjon om tetthet.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, tegner du mediet og pipette opp og ned for å avbryte. Når kjelleren membran matrise er fullstendig forstyrret, overføre suspensjonen til en 15 mL konisk rør. Ikke plasser mer enn 10 kupler per enkelt 15 mL konisk rør. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og vask celle pellet med 5 mL PBS. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og resuspend pellet i 4 mL Trypsin erstatning. Digest for 5-10 min med risting ved 37 ° c. Legg til et likt volum av organoid medium + 10% FBS å hemme Trypsin utskifting. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og resuspend i 1 mL PBS.
- Filtrer fjæringen med et 40 μm-filter for å sikre en enkelt celle oppheng. Kvantifisere celle nummeret ved hjelp av en hemocytometer eller tilsvarende telleenhet.
Merk: Hvis innhenting levedyktige enkeltceller er vanskelig, bruk flyt sortering å få en enkelt celle løsning.
3. vurdering av kapasitet for organoid formasjon
Merk: for å bestemme prosentandelen av celler som kan generere en organoid, en seeding analysen kan utføres som en proxy for stammen/stamfar potensial. Den organoid formasjon kapasiteten er også viktig for å definere et celle seeding tall for levedyktighet analysene.
- Fortynne celle fjæringen innhentet i trinn 2,7 til 100 celler per 10 μL av suspensjonen ved hjelp av organoid medium som inneholder 10 μM Rho kinase inhibitor Y-27632.
- Overfør 1 100-celler (110 μL av fjæring) til et nytt konisk rør.
- Tilsett 285 μL av matrise for kjeller membran og resuspend cellene. Dette vil resultere i en ~ 70% matrise konsentrasjon.
Merk: fortynning av kjelleren membran matrise under seeding sterkt reduserer variasjonen i kuppel størrelse, forårsaket av viskositet av protein matrise. - Seed celler i 35 μL av matrisen kupler i en pre-varmet 24 brønn plate, noe som resulterer i 200 celler/brønn. Plate 3-5 replikerer per prøve (se også plating metode i figur 1A og Step 2.1.2).
- For å sikre at cellene forblir innenfor matrisen kuppelen, snu platen og legg den i en celle inkubator å stivne kjelleren membran matrise.
- Etter 10 min, Fjern platen fra inkubator og tilsett medium som inneholder Rho kinase inhibitor.
- Oppdater mediet hver 2 dager. Etter 7 dager, kvantifisere antall organoids. Behold Rho kinase inhibitor i Media gjennom hele eksperimentet.
- Count antall organoids etablert per kuppel og beregne prosent av organoids dannet av det totale antall celler belagt (200 celler).
Merk: Organoid etablerings forhold varierer fra 3%-60%, avhengig av celle type og genotype.
4. fastsettelse av farmakologiske responser på organoids
- Fortsetter fra trinn 2,7, frø 1000-10000 celler i en matrise kuppel. Bruk organoid dannelse effektivitet og vekst hastighet som en proxy for å bestemme det endelige celle tallet.
Merk: anbefalte celle tall er angitt i tabell 1. Bruk tre til fem replikerer per betingelse per analyse. Bruk en endelig konsentrasjon av 70% kjelleren membran matrise for å redusere pipettering feil indusert av viskositet. - Seed 35 μL av matrise kupler i en 24 brønn plate og la kupler stivne som gjort i § 3 (se også plating metode i figur 1a og Step 2.1.2). Legg medium som inneholder Rho kinase inhibitor og medikament av valget. Denne metoden kan brukes på alle rusmidler, men i denne protokollen, en andre generasjons anti-androgen brukes ved 10 μM for et eksempel. For å bestemme halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50), utføre en log10 inkrementell, og som en kontroll, bruke bilen der stoffet ble oppløst.
- Oppdater mediet hver to eller tre dager og analysere organoids på dag 7 for å bestemme den farmakologiske responsen av stoffet. Tidspunkter kan variere blant valg av eksperiment og narkotika.
Merk: Organoids trenger ikke å være trypsinized for å utføre disse analysene. - For å holde organoids intakt, ved hjelp av en P1000 pipette, trekke opp mediet og pipette opp og ned for å forstyrre kjelleren membran matrise.
- Når kjelleren membran matrise er fullstendig forstyrret, overføre suspensjonen til en 15 mL konisk rør. Ikke Overfør mer enn 10 matrise kupler per 15 mL konisk rør.
- Sentrifuger på 300 x g i 5 min. tegn av supernatanten og vask med 5 ml PBS.
- Resuspend organoids i 1 mL PBS og forstyrrer organoids ved hjelp av trituration og et glass Pasteur-pipette.
- Kvantifisere antall organoid fragmenter. Frø 5 replikerer inneholder 100 organoid fragmenter som beskrevet i trinn 2.1.2.
- Utfør celle levedyktigheten analysen som beskrevet nedenfor i avsnitt 7.
5. RNA isolering fra organoids
Merk: de kolonne-baserte metodene som er tilgjengelige på markedet gir god kvantitet og kvalitet på RNA. For å sikre god kvantum RNA, bruk minst en kuppel per prøve; men ved hjelp av tre kupler anbefales, som kan bli sådd i en enkelt brønn av en 12 brønn plate.
- Legg til ß-mercaptoethanol (1%) glutation lyseringsbuffer i RNA isolasjons settet.
- Trekk av mediet fra kjeller membran kupler som inneholder organoids og tilsett 750 μL av denne bufferen. Pipetter opp og ned med en P1000 pipette. Sjekk at alle kjelleren membran matrise er oppløst.
- Tilsett 750 μL av 70% etanol og bland med pipettering. Deretter overføres 700 μL av blandingen til søylen, sentrifuger ved 12 000 x g for 1 min, og gjenta med resten av lysat.
- Utfør vasker og på-kolonne DNase behandling i henhold til produsentens instruksjoner. Eluere RNA i 30-50 av RNAse-fritt vann.
- Mål konsentrasjonen ved hjelp av en fluorometer ved OD = 260 NM og 280 NM og lagre ved-80 ° c eller fortsette med nedstrøms applikasjoner.
6. protein isolasjon fra organoids
Merk: for protein isolering klargjør du standard RIPA-buffer som inneholder fosfatase og protease hemmere (tabell med materialer). Bruk av minst tre kupler anbefales, som kan bli sådd i en enkelt 12 brønn.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, trekke opp mediet fra cellen med kjelleren membran kupler som inneholder organoids og pipette opp og ned for å forstyrre kjelleren membran matrise.
- Når fullstendig forstyrret, overføre suspensjonen til en 15 mL konisk rør. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Tegn av supernatanten og vask med 5 mL iskald PBS. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og resuspend pellet i 4 mL Trypsin erstatning. Digest for 5-10 min mens risting ved 37 ° c.
- Legg til et likt volum av organoid medium + 10% FCS å hemme Trypsin utskifting. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
Merk: post-sentrifugering, ingen kjeller membran matrise skal være synlig i pellet. - Tegn av supernatanten og vask med 5 mL iskald PBS. Trekk av supernatanten og resuspend celle pellet i 300 μL av lyseringsbuffer ved hjelp av en P1000-Pipet, og Overfør deretter til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
- Ruge på is i 10 min og deretter sonikere 2x for 30 s hver på avkjølt vann med en temperatur på 4 ° c. Plasser røret tilbake på isen og utføre protein kvantifisering ved hjelp av standard metoder.
- Denaturere proteinet ved å tilsette natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) som inneholder laste fargestoff og kok i 5 minutter ved 95 ° c. Oppbevar lysater ved-80 ° c eller Fortsett med nedstrøms applikasjoner.
7. celle levedyktighet analysen med organoids
Merk: Cell levedyktighet kan vurderes ved hjelp av kommersielt tilgjengelige cellen levedyktighet analysen Kit og en luminometeret. Klargjør buffere i henhold til produsentens instruksjoner. Fem replikerer per betingelse anbefales: en replikere bestående av 1 35 μL kjeller membran matrise kuppel i en brønn av en 24 brønn plate.
- Tegn av mediet for den organoid kulturen, og pass på å forlate matrisen kupler intakt.
- Tilsett 65 μL av PBS og pipette opp og ned for å forstyrre matrisen kuppelen.
- Tilsett 100 μL av celle levedyktighet analysen Kit buffer og resuspend av pipettering.
- Ruge ved romtemperatur (RT) i 10 min med risting.
- Overføring 100 μL av blandingen til en ikke-gjennomskinnelig plate egnet for luminometeret og utføre lesing i henhold til produsentens instruksjoner for cellen levedyktighet analysen Kit.
8. utarbeidelse av organoids for xenografting
Merk: Organoids er også mottagelig for subkutan pode i både uimottakelig kompromittert dyr, så vel som, isogenic mus. For å sikre injisert organoids er gjenkjennelig i Vivo, etikett organoids med en constitutively uttrykker fluoroforen5. Det anbefales å utføre et pilot eksperiment for pode bruke 5 x 105 celler til 2 x 106 celler per injeksjon, med trinn på 5 x 106 celler, som pode effektivitet varierer mellom organoid linjer.
- Bruke en P1000 pipette, trekke opp medium og pipette opp og ned for å forstyrre kjelleren membran matrise. Når fullstendig forstyrret, overføre suspensjonen til en 15 mL konisk rør. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
Merk: ikke Overfør mer enn 10 Matrix kupler per 15 mL konisk rør. - Trekk av supernatanten og vask med 5 mL PBS. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og resuspend pellet i 4 mL Trypsin erstatning. Digest for 5-10 min mens risting ved 37 ° c.
- Legg til like volum av organoid medium + 10% FBS å hemme Trypsin erstatning. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Trekk av supernatanten og resuspend i 1 mL PBS. Filtrer fjæringen med et 40 μm-filter for å sikre en enkelt celle oppheng. Kvantifisere celler ved hjelp av standard metoder.
- Snurr ned og resuspend cellene i PBS + Rho inhibitor til en konsentrasjon på 2 x 106 celler per 100 μL (se tabell 2 for celle konsentrasjoner og absolutt celle nummer som trengs for varierende konsentrasjoner). Bruk et likt volum av kjelleren membran matrise for å generere en 1:1 suspensjon. Plasser suspensjonen på isen.
- Injiser celler i henhold til standardprotokoller og Overvåk xenograft vekst ved hjelp av standard metoder8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seeding effektivitet
Organoid formasjon kapasitet bestemmes av fenotype og genotype. Wild-type (WT) prostata basal celler viste overlegen organoid formasjon kapasitet (30%-40%) sammenlignet med luminal celler (3%) (Figur 1A). Etter organoid etablering, økte dannelsen kapasiteten drastisk. Vanligvis kan 25%-30% av celler avledet fra en WT organoid danne en ny organoid (figur 1B). CRISPR/Cas9-mediert tap av Pten (PtenΔ/Δ) eller p53 (p53Δ/Δ) resulterte i en mindre økning i organoid formasjon kapasitet. Tap av både p53 og Pten ytterligere økt dannelse kapasitet (figur 1B).
Farmakologisk respons
Basert på seeding effektivitet, såing av 1000-10000 celler i 35 μL av kjelleren membran matrise kuppel i en 24 brønn plate ble utført. Anbefalte celle seeding tall basert på organoid formasjon effektivitet er gitt i tabell 1. Imidlertid kan organoid sprednings hastigheter variere sterkt avhengig av genotype. Ytterligere endringer i celle seeding nummeret kan gjøres basert på spredning.
I figur 2, effekten av anti-androgene molekyler på vekst ble testet i murine organoids med ulike genotyper. Totalt 2 500 celler ble sådd fra murine organoids med en WT genotype, p53 tap, Pten tap, eller dual p53 og Pten tap. p53 og Pten tap ble initiert av lentiviral innføring av en gRNA rettet mot p53 og/eller Pten geometrisk i organoids constitutively uttrykker Cas9 under kontroll av Rosa26 arrangøren med en C57/Bl6 genetisk bakgrunn9.
Tap av p53 ikke forårsaker motstand mot anti-androgene molekyler. Tap av Pten økt motstand mot anti-androgene sammensatte, som vist tidligere10. Dobbelt tap av p53 og Pten, men resulterte i fullstendig motstand mot andre generasjons anti-androgen (figur 2A). AR hemming også endret organoid fenotyper. I kontroll Cas9+/+ organoids, samt P53Δ/Δ-slettet og PtenΔ/Δ organoids, en nedgang i Organoid lumen størrelse ble observert (figur 2B). p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids var phenotypically upåvirket (figur 2B). I tråd med disse resultatene, når 1 x 106 celler ble podet subkutant i flanken, bare p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids vokste (figur 2C). Samlet disse resultatene viser at p53Δ/Δ PtenΔ/Δ co-sletting resultater i motstand mot andre generasjons anti-androgen i murine organoids.
Pasient-avledet PCa organoids er heterogen i fenotypeog genotype; Derfor kan tiltak mot rusmidler variere mye mellom den menneskelige PCa-organoid linjer. I Figur 3, den anti-androgene molekyler respons av to forskjellige menneskelige PCa ORGANOIDS, MSKPCA2 og MSKPCA3 vises. Spredning av MSKPCA2 organoids ble sterkt hemmet av anti-androgene molekyler, mens MSKPCA3 organoids forble upåvirket (Figur 3A, B). MSKCPCA2 organoids uttrykte høye nivåer av AR og AR-Target FKBP5, og de uttrykte kjennetegn luminal proteiner som CK8 og CK18. I kontrast MSKPCA3 organoids også uttrykt basal (CK5) og mesenchymal (vimentin) markører og viste ingen uttrykk for FKBP5. Disse resultatene tyder på at disse organoids modellen en ikke-luminal androgen-uavhengige fenotype.
Figur 1: måle organoid dannelse utbredelsen av menneskelige og mus prostata celler. (A) skjematisk oversikt over celle blanding i kjelleren membran matrise (venstre) og organoid seeding i matrisen kupler (høyre). (B) relative organoid dannelse av menneskelig (CD49f +)-avledet basal og (CD26 +)-avledet luminal celler (%, y-aksen; MEAN ± SD) i nærvær av 1 nM DHT. Totalt 200 celler ble sådd og antall organoids var kvantifisert 7 dager etter seeding (n = 3, * * * p < 0,01, t-test). (C) relativ organoid dannelse av murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, og P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids (%, y-aksen; Mean ± SD) i nærvær av 1 nM DHT. Totalt 200 celler ble sådd og antall organoids var kvantifisert 7 dager etter seeding (n = 3). p53 og Pten tap ble formidlet av gRNA målretting av P53 og/eller Pten geometrisk i organoids uttrykke Cas9 constitutively under en Rosa26 promoter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vurdere den farmakologiske responsen av organoids avledet fra genetisk konstruerte mus. (A) relativ celle spredning av murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, og P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids (y-akse, gjennomsnitt ± SD, målt ved celle levedyktighet analysen Kit) av 2 500 celler 7 dager etter etablering av organoids; (n = 3, * p < 0,05, t-test) med 1 nM DHT eller 10 μM av andre generasjons antiandrogen som indikert. (B) representative brightfield bilder av WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, og P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoid kulturer behandlet med 1 nM DHT eller 10 μM andre generasjons anti-androgen som indikert. (C) representativ vekst kurve av WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, og P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids injisert subkutant i flanken av isogenic C57/Bl6 mus. Bare P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids viste vekst. Totalt 1 x 106 celler ble injisert. Tre uavhengige kurver av P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids er vist å vise heterogenitet i vekst hastighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vurdere den farmakologiske responsen av organoids avledet menneskelig prostata kreft biopsier. (A) relativ celle spredning av pasient-avledet MSKPCA2 og MSKPCA2 organoids (y-AKSEN, gjennomsnittlig ± SD, målt ved celle levedyktighet analysen Kit) av 5 000 celler 7 dager etter etablering av organoids (n = 4, * p < 0,05, t-test) med 1 NM DHT eller 10 μM andre generasjons anti-androgen som indikert. (B) representative brightfield bilder av MSKPCA2 og MSKPCA3 organoids kulturer behandlet med 1 nM DHT eller 10 μM andre generasjons anti-androgen som indikert. (C) Western Blot analyse av AR, FKBP5 (AR-Target genet), CK8 og CK18 (luminal markører), CK5 (basal markør), og vimentin (mesenchymal markør) i MSKPCA2 og MSKPCA3 organoids. GAPDH ble brukt som en laste kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Organoid seeding effektivitet (%) | Tall for celle seeding (per kuppel) |
| 1-10 prosent | 100000 |
| 10-20 prosent | 5000 |
| 20-60 prosent | 2500 |
| 60-100 prosent | 1000 |
Tabell 1: celle seeding tall som brukes til å vurdere farmakologisk respons basert på organoid formasjon kapasitet. Tabell for kolonne (venstre til høyre) inneholder organoid formasjon kapasitetsområder og tilsvarende antall celler til frø per matrise kuppel.
| Totalt celle nummer | PBS0 + Y-27632 | Matrigel volum | celle konsentrasjon/injeksjon |
| 5 x 106 | 500 μL | 500 μL | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μL | 500 μL | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μL | 500 μL | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μL | 500 μL | 2 x 106 |
Tabell 2: anbefalte celle tall for organoid xenografting eksperimenter. Kolonner fra venstre til høyre inkluderer absolutt totalt celle nummer for 10 injeksjoner, totalt volum av PBS + Y-27632 for 10 injeksjoner, kjeller membran matrise volum, og celle nummer per injeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forstå molekylære mekanismer underliggende anti-androgen motstand og oppdage potensielle terapeutiske sårbarheter krever testing av farmakologiske reaksjoner i modellsystemer etterligne prostatakreft. Beskrevet her er en detaljert protokoll for pålitelig analyse av farmakologiske reaksjoner i pasient-avledet og genetisk konstruert prostata organoids og utarbeidelse av disse organoid prøvene for nedstrøms applikasjoner.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å bestemme seeding effektivitet og vekstrate av organoids. Organoid vekst hastighet varierer sterkt. Dette er avhengig av arter, som murine avledet organoids vokse om to ganger raskere enn menneske-avledet organoids. Bortsett fra arter, vekst hastighet er avhengig av genotype og fenotype. Men når seeding effektivitet og vekst hastighet er bestemt, kan denne protokollen tilpasses alle prostata organoid typer.
Det andre kritiske trinnet arbeider med protein-matrise-basert 3D-kultur for å forberede seg til påfølgende nedstrøms applikasjoner. Innføringen av seeding variasjon ved viskositet av kjelleren membran matrise under plating kan unngås ved hjelp av fortynnet (70%) kjeller membran matrise, som beskrevet. Riktig bryte opp polymerisert matrise uten overdrevet forstyrrer organoids er også beskrevet i detalj. Denne protokollen muliggjør forstyrrelse av matrisen uten å innføre variasjon i organoid avlesning, som kan tilpasses for screening av legemiddel biblioteker for ulike genetiske bakgrunner i PCa. Videre, ved å utføre CRISPR/Cas9-eller shRNA-basert uttrykk interferens, gener overdragelse resistens kan spørres.
Et punkt av hensyn er at mediet sammensetningen av prostata organoid kultur kan påvirke farmakologisk respons. For eksempel, EGF, en komponent i både murine og menneskelig prostata organoid kultur, i stor grad reduserer følsomheten for anti-androgen. Derfor er EGF utelatt i denne protokollen fra mediet, og følsomhet for anti-androgen er gjenopprettet. Det anbefales å finne ut om noen organoid ingredienser påvirke følsomheten for stoffet blir testet. Dette gjelder særlig for den komplekse menneskelige prostata organoid kultur medium, som (bortsett fra EGF, noggin, R-spondin1, DHT, og A83-001 [sammensetningen av murine organoid medium]) inneholder Fibroblast vekstfaktor 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, nikotinamid, og p38i-hemmer SB202190.
Den organoid medium sammensetning favoriserer veksten av godartet prostata epitel over kreft vev, og dermed ingen primære hormon følsom PCa organoid linjer har blitt etablert. For øyeblikket er alle PCa-organoids avledet fra pasienter med avansert metastatisk anti-androgen-motstandsdyktig PCa; Derfor, de fleste av disse linjene er anti-androgen motstandsdyktig og egnet for å identifisere nye behandlinger. Som proof-of-konseptet, delta-lignende 3 (DLL3) har blitt identifisert som et terapeutisk mål ved hjelp av pasient-avledet NEPC organoids som er kan målrettes med rovalpituzumab tesirine13. Denne metoden er egnet for disse typer eksperimenter og er også egnet for prostata organoids fra normalt godartet vev, primære prostatakreft, og CTC.
En brist av prostata organoid kultur er fraværet av en mobiltelefon nisje. Dermed kan bidrag til resistens av ikke-tumorceller ikke bli studert ved hjelp av gjeldende plattform. Men co-kulturer av tykktarmskreft og lungekreft organoids med autologous T-celler har nylig blitt etablert, slik at studier av interaksjoner mellom tumor og immunsystem14. Andre co-kultur systemer kan etableres for videre studier ikke-celle-autonome interaksjoner.
Avslutningsvis gir denne rapporten en detaljert protokoll for reproduserbar vurdering av farmakologiske responser i prostata organoids og påfølgende nedstrøms applikasjoner. Viktigst, er denne protokollen bredt gjeldende og kan brukes til organoid kulturer av andre organer, inkludert kolon15, tynntarmen16 , mage17,18, lever19, bukspyttkjertel20, nyre21, og bryst kjertel22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C. L. S tjener i styret i Novartis; er en cofounder av ORIC Pharmaceuticals og coinventor av enzalutamid og apalutamide; er en vitenskap rådgiver til Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, tåkelur, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra, og PMV; og er en cofounder av Seragon, kjøpt av Genentech/Roche i 2014. W.R.K. er en coinventor og patent innehaver av organoid teknologi.
Acknowledgments
K.P. er støttet av NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. støttes av HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; og Starr Cancer Consortium. W.R.K. støttes av nederlandske Cancer Foundation/KWF BUIT 2015-7545 og prostata Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
