Summary
Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.
Abstract
Apresentado aqui é um protocolo para estudar farmacodinâmica, potencial de células-tronco e diferenciação de câncer em organóides epitelia da próstata. Organóides da próstata são culturas orrógenas e tridimensionais (3D) cultivadas em um meio definido que se assemelha ao epitélio prostático. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, tecido humano benigno e câncer de próstata avançado. Importante, os organóides derivados pacientes assemelham-se pròxima a tumores na genética e na biologia in vivo do tumor. Além disso, os organóides podem ser manipulados geneticamente usando sistemas CRISPR/Cas9 e shRNA. Essas genéticas controladas tornam a cultura organóide atraente como uma plataforma para testar rapidamente os efeitos dos genótipos e perfis mutacionais nas respostas farmacológicas. No entanto, os protocolos experimentais devem ser especificamente adaptados à natureza 3D das culturas organóides para obter resultados reprodutíveis. Descritos aqui são protocolos detalhados para a realização de ensaios de semeada para determinar a capacidade de formação organóide. Posteriormente, este relatório mostra como realizar tratamentos medicamentosos e analisar a resposta farmacológica através de medições de viabilidade, isolamento de proteínas e isolamento de RNA. Finalmente, o protocolo descreve como preparar organóides para xenoenxerto e subsequentes ensaios de crescimento in vivo usando enxerto subcutâneo. Esses protocolos produzem dados altamente reproduzíveis e são amplamente aplicáveis a sistemas de cultura 3D.
Introduction
A resistência aos medicamentos é um dos principais problemas clínicos no tratamento do câncer. O tratamento metastático do câncer de próstata (PCa) é direcionado principalmente para o eixo de sinalização de andrógenos. Terapias anti-andrógenos de última geração (por exemplo, enzalutamida e abiraterona) mostraram grande sucesso clínico, mas praticamente todas as PCa eventualmente progridem em direção a um estado independente de andrógeno, ou câncer de próstata resistente à castração (CRPC).
Perfil genômico e transcriptômico recente do CRPC revelou que existem três mecanismos gerais de resistência no câncer de próstata: 1) ativando mutações, resultando na restauração do receptor andrógeno (AR) sinalização1; 2) ativação da sinalização de bypass, como exemplificado em um modelo pré-clínico para a resistência à terapia anti-andrógeno de última geração em que a ativação do receptor glicocorticoide (GR) pode compensar a perda de sinalização ar2; e 3) o processo recentemente identificado de plasticidade da linhagem, em que as células tumorais adquirem resistência ao alternar linhagens de um tipo de célula dependente do alvo da droga para outro tipo de célula que não depende disso (que, em PCa, é representado como AR-negativo e/ou doença neuroendócrina [NEPC])3,4. No entanto, os mecanismos moleculares que causam resistência aos medicamentos não são compreendidos. Além disso, a resistência antiandrógena adquirida pode levar a vulnerabilidades terapêuticas que podem ser exploradas. Portanto, é essencial avaliar as respostas de medicamentos em sistemas modelo que imitam fenótipos e genótipos de pacientes.
Organóides da próstata são culturas organotípicas cultivadas em uma matriz de proteína 3D com um meio definido. Importante, organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de tecido benigno e canceroso de urina ou origem humana, e eles mantêm características erofópicas e genotípicas encontradas in vivo5,6. É importante ressaltar que tanto as células sensíveis ao PCa e crpc antiandrógenas estão representadas no atual compêndio de organóides. Além disso, os organóides da próstata são facilmente manipulados geneticamente usando CRISPR/Cas9 e shRNA5. Assim, organóides da próstata são um sistema modelo adequado para testar respostas de medicamentos e elucidar mecanismos de resistência. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para realizar testes de drogas e analisar as respostas farmacológicas usando organóides da próstata.
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Protocol
Todo o trabalho descrito neste protocolo foi executado com organóides previamente estabelecidos do murine e organoids paciente-derivados. Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com as diretrizes do Centro de Recursos Animais de Pesquisa do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Todos os tecidos derivados do paciente foram coletados em conformidade com as regras e regulamentos do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. Preparação média e tampão
- Descongele a matriz da membrana do porão (por exemplo, Matrigel) a 4 °C durante a noite antes de iniciar o experimento. Mantê-lo no gelo durante o uso.
- Coloque as placas de cultura a 37 °C por 24 h antes dos experimentos. Isso ajudará a cúpula da matriz de membrana do porão (a partir daí referida como cúpula matriz) a polimerizar. Os organóides de revestimento são descritos na etapa 2.1.2.
- Prepare o meio organóide de acordo com o protocolo estabelecido5.
- Prepare o meio organóide sem a adição do fator de crescimento epidérmico (EGF; consulte tabela de materiais para componentes). EGF suprime a saída transcricional AR e confere resistência anti-andrógeno5.
- Prepare o meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com o soro bovino fetal de 10% (FBS).
NOTA: Esta mídia é usada para inibir a digestão enzimática com substituição de trippsina nas seções 2-4. - Prepare soluções de medicamentos de acordo com o protocolo do fabricante. Para enzalutamide/mdv3100 (posteriormente referido como anti-andrógeno de segunda geração), prepare uma solução de estoque de 100 μM em dimetil sulfoxide (DMSO). O estoque pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses e não precisa ser feito fresco.
2. Isolamento, digestão enzimática e estabelecimento de organóides
- Isolar organóides da próstata do rato ou tecido humano de acordo com os protocolos previamente estabelecidos5,7. Uma breve descrição é fornecida abaixo.
- Mince e enzimaticamente digerir tecido da próstata para produzir uma única suspensão celular. Neste experimento, 1 mL de 5 mg/mL collagenase tipo II em ADMEM/F12 foi utilizado para a digestão de 50 mg de tecido da próstata.
- Coletar células por centrífuga a 300 x g por 5 min, contar as células, resuspendê-las na matriz da membrana do porão e placa na densidade apropriada5,7 nas cúpulas matricia em placas de cultura organóide pré-aquecida (chapeamento método é mostrado na Figura 1A).
- Permita que as cúpulas se solidiem e adicionem mídia nos topos das cúpulas para que elas estejam completamente cobertas.
- Crescer organóides para a quantidade desejada para aplicações a jusante. O número celular pode ser determinado por métodos de contagem padrão. Veja a seção específica do protocolo para obter detalhes adicionais sobre densidade.
- Usando uma pipeta P1000, elaborar o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper. Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não coloque mais de 10 cúpulas por único tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Desenhe o supernatant e lave a pelota da pilha com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Resumo para 5-10 min com agitação a 37 °C. Adicione um volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS.
- Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantifique o número da célula usando um hemocytometer ou dispositivo de contagem equivalente.
NOTA: Se a obtenção de células únicas viáveis é difícil, use a classificação do fluxo para obter uma solução de célula única.
3. Avaliação da capacidade de formação organóide
NOTA: Para determinar a porcentagem de células que podem gerar um organóide, um ensaio de semeadura pode ser realizado como um proxy para o potencial de tronco/progenitor. A capacidade de formação organóide também é importante para definir um número de semeadura celular para os ensaios de viabilidade.
- Diluir a suspensão celular obtida na etapa 2,7 a 100 células por 10 μL da suspensão usando o meio organóide contendo 10 μM Rho kinase inibidor Y-27632.
- Transfira 1.100 células (110 μL de suspensão) para um novo tubo cônico.
- Adicione 285 μL de matriz de membrana do porão e resuspenda as células. Isso resultará em uma concentração de matriz de ~70%.
NOTA: Diluição da matriz de membrana do porão durante a semeanação reduz muito a variação no tamanho da cúpula, causada pela viscosidade da matriz proteica. - Células de sementes em 35 μL de cúpulas matricias em uma placa de 24 poços pré-aquecida, resultando em 200 células/poço. Placa 3-5 replica por amostra (também ver o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2).
- Para garantir que as células permaneçam dentro da cúpula da matriz, vire a placa e coloque-a em uma incubadora celular para solidificar a matriz da membrana do porão.
- Após 10 min, retire a placa da incubadora e adicione o meio contendo o inibidor da quinase Rho.
- Refresque o meio a cada 2 dias. Após 7 dias, quantifique o número de organóides. Mantenha o inibidor da quinase Rho na mídia durante todo o experimento.
- Conte o número de organóides estabelecidos por cúpula e calcule a porcentagem de organóides formados a partir do número total de células banhadas (200 células).
NOTA: As proporções de estabelecimento organóide variam de 3% a 60%, dependendo do tipo celular e do genótipo.
4. Determinando respostas farmacológicas de organóides
- Continuando a partir do passo 2.7, sementes 1.000-10.000 células em uma cúpula matriz. Use a eficiência de formação organóide e velocidade de crescimento como um proxy para determinar o número final da célula.
NOTA: Os números de celular recomendados são fornecidos na Tabela 1. Use três a cinco replica por condição por análise. Use uma concentração final de 70% de matriz de membrana do porão para reduzir os erros de tubulação induzidos pela viscosidade. - Semente 35 μL de cúpulas matricezem em uma placa de 24 poços e deixe as cúpulas solidificarem como feito na seção 3 (também veja o método de revestimento na Figura 1A e passo 2.1.2). Adicione o meio contendo o inibidor de quinase Rho e a droga de escolha. Este método pode ser aplicado a todas as drogas, mas neste protocolo, um anti-andrógeno de segunda geração é usado em 10 μM por exemplo. Para determinar a concentração inibidora máxima (IC50), realize um log10 incremental e, como controle, use o veículo no qual a droga foi dissolvida.
- Refresque o meio a cada dois ou três dias e analise os organóides no dia 7 para determinar a resposta farmacológica da droga. Os pontos de tempo podem variar entre a escolha do experimento e da droga.
NOTA: Organóides não precisam ser trypsinizados para realizar esses ensaios. - Para manter os organóides intactos, usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.
- Quando a matriz da membrana do porão é interrompida inteiramente, transfira a suspensão a um tubo cónico de 15 mL. Não transfira mais de 10 cúpulas matricadas por tubo cônico de 15 mL.
- Centrífuga a 300 x g por 5 min. Tire o supernatant e lave com 5 mL de PBS.
- Resuspenda organóides em 1 mL de PBS e interrompa os organóides usando trituração e uma pipeta pasteur de vidro.
- Quantificar o número de fragmentos organóides. Semente 5 replica contendo 100 fragmentos organóides, conforme descrito no passo 2.1.2.
- Realize o ensaio de viabilidade celular descrito abaixo na seção 7.
5. Isolamento de RNA de organóides
NOTA: Os métodos baseados em colunas comercialmente disponíveis produzem boa quantidade e qualidade de RNA. Para garantir rna de boa quantidade, use um mínimo de uma cúpula por amostra; no entanto, o uso de três cúpulas é recomendado, que pode ser semeado em um único poço de uma placa de 12 poços.
- Adicionar ß-mercaptoetanol (1%) para o tampão de linéia glutationa no kit de isolamento RNA.
- Retire o meio das cúpulas de membrana do porão contendo organóides e adicione 750 μL deste buffer. Pipeta para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Verifique se toda a matriz de membrana do porão foi dissolvida.
- Adicione 750 μL de 70% de etanol e misture por pipetting. Posteriormente transferir 700 μL da mistura para a coluna, centrífuga em 12.000 x g por 1 min, e repita com o restante do lysate.
- Executar laves e tratamento de DNase na coluna de acordo com as instruções do fabricante. Elute RNA em 30-50 μL de água livre de RNAse.
- Medir as concentrações usando um flódromo em OD = 260 nm e 280 nm e armazenar a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.
6. Isolamento proteico de organóides
NOTA: Para o isolamento de proteínas, prepare o amortecedor RIPA padrão contendo inibidores de fósforoe protease(Mesa de Materiais). Usando pelo menos três cúpulas é recomendada, que pode ser semeada em um único 12 bem.
- Usando uma pipeta P1000, elabore o meio da célula com as cúpulas de membrana do porão contendo organóides e pipetos para cima e para baixo para interromper a matriz da membrana do porão.
- Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.
- Adicione um volume igual de meio organóide + FCS de 10% para inibir a substituição da trippsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
NOTA: Pós-centrífugação, nenhuma matriz de membrana do porão deve ser visível na pelota. - Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS gelado. Desenhe o supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 300 μL do amortecedor da lyse usando um pipet de P1000, a seguir transfira a um tubo do microcentrífuga de 1.5 mL.
- Incubar no gelo por 10 min e, posteriormente, sonicate 2x para 30 s cada em água resfriada com uma temperatura de 4 °C. Coloque o tubo de volta no gelo e realizar quantificação de proteína usando métodos padrão.
- Desnaturar a proteína adicionando sulfato dodcyl de sódio (SDS) contendo tinuoso de carregamento e deixe ferver por 5 min a 95 °C. Armazenar lysates a -80 °C ou continuar com aplicações a jusante.
7. Ensaio de viabilidade celular com organóides
NOTA: A viabilidade celular pode ser avaliada usando o kit de ensaio de viabilidade celular disponível comercialmente e um luminomômetro. Prepare buffers de acordo com as instruções do fabricante. Recomenda-se cinco réplicas por condição: uma réplica consistindo de uma cúpula de matriz de membrana de porão de 35 μL em um poço de uma placa de 24 poços.
- Desenhe o meio da cultura organóide, tendo o cuidado de deixar as cúpulas matricia intactas.
- Adicione 65 μL de PBS e pipeta para cima e para baixo para interromper a cúpula matriz.
- Adicione 100 μL do buffer do kit de ensaio de viabilidade celular e resuspenda por pipetting.
- Incubar à temperatura ambiente (RT) para 10 min com agitação.
- Transfira 100 μL de mistura para uma placa não translúcida adequada para o lumimosômetro e execute a leitura de acordo com as instruções do fabricante para o kit de ensaio de viabilidade celular.
8. Preparação de organóides para xenoenxerto
NOTA: Organóides também são passíveis de enxerto subcutâneo em ambos os animais imunocomprometidos, bem como, ratos isógênicos. Para garantir que os organóides injetados sejam in vivo, rotule organóides com um fluorofiforre constitutivamenteexpressor 5. Recomenda-se realizar um experimento piloto para enxertia usando 5 x 105 células para 2 x 106 células por injeção, com incrementos de 5 x 106 células, já que a eficiência do enxerto varia entre as linhas organóides.
- Usando uma pipeta P1000, elabore o meio e pipeta para cima e para baixo para interromper a matriz de membrana do porão. Quando totalmente interrompido, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
NOTA: Não transfira mais de 10 cúpulas matrica por tubo cônico de 15 mL. - Desenhe o supernatant e lave com 5 mL de PBS. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Tire o supernatant e resuspender a pelota em 4 mL de substituição trypsin. Dime por 5-10 min enquanto treme a 37 °C.
- Adicione o volume igual de meio organóide + 10% FBS para inibir a substituição de tripsina. Centrífuga a 300 x g por 5 min.
- Desenhe o supernatant e resuspenda em 1 mL de PBS. Filtrar a suspensão com um filtro de 40 μm para garantir uma única suspensão celular. Quantificar as células usando métodos padrão.
- Desça e resuspenda as células do inibidor pbs + rho para uma concentração de 2 x 106 células por 100 μL (ver Tabela 2 para concentrações celulares e número de células absoluta necessária para diferentes concentrações). Use um volume igual de matriz de membrana do porão para gerar uma suspensão 1:1. Coloque a suspensão no gelo.
- Injetar células de acordo com protocolos padrão e monitorar o crescimento xenoenxerto usando métodos padrão8.
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Representative Results
Eficiência de semeada
A capacidade de formação de organóides é determinada por fenótipo e genótipo. As células basais da próstata do tipo selvagem (WT) apresentaram capacidade superior de formação organóide (30%-40%) em comparação com as células luminais (3%) (Figura 1A). Após o estabelecimento organóide, a capacidade de formação aumentou drasticamente. Normalmente, 25%-30% das células derivadas de um organóide WT podem formar um novo organóide (Figura 1B). A perda mediada por Crispr/Cas9 de Pten (PtenΔ/Δ)ou p53 (p53Δ/Δ)resultou em um pequeno aumento na capacidade de formação organóide. Perda de p53 e Pten aumentou ainda mais a capacidade de formação(Figura 1B).
Resposta farmacológica
Com base na eficiência de semeadura, foi realizada a semeadura de 1.000 a 10.000 células em 35 μL de cúpula de matriz de membrana do porão em uma placa de 24 poços. Os números recomendados de semeadura celular com base na eficiência da formação organóide são fornecidos na Tabela 1. No entanto, as velocidades de proliferação organóide podem diferir muito dependendo do genótipo. Alterações adicionais no número de semeadura celular podem ser feitas com base na proliferação.
Na Figura 2,os efeitos das moléculas antiandrogênicas sobre o crescimento foram testados em organóides de urina com diferentes genótipos. Um total de 2.500 células foram semeadas de organóides murine com um genótipo WT, perda de p53, perda pten, ou perda dupla p53 e Pten. p53 e Pten perda foi iniciada pela introdução lentiviral de um gRNA visando o p53 e / ou pten locus em organóides constitutivamente expressando Cas9 o controle do promotor Rosa26 com um fundo genético C57/Bl69.
A perda de p53 não causou resistência às moléculas antiandrogênicas. A perda de Pten aumentou a resistência ao composto antiandrogênico, como mostrado anteriormente10. A perda dupla de p53 e Pten, no entanto, resultou em resistência completa ao anti-andrógeno de segunda geração (Figura 2A). A inibição da RA também alterou fenótipos organóides. No controle cas9+/+ organóides, bem como P53Δ/Δ-excluídos e ptenδ/δ organóides, observou-se uma diminuição no tamanho dos lumen organóides (Figura 2B). p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids were phenotypically unaffected (Figura 2B). Em linha com estes resultados, quando 1 x 106 células foram enxertadas subcutâneamente no flanco, apenas p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organóides cresceram (Figura 2C). Globalmente, estes resultados demonstram que a co-supressãode δ/δ PtenΔ/Δ resulta em resistência à segunda geração antiandrógena nos organóides de urina.
Organóides PCa derivados do paciente são heterogêneos em fenótipo e genótipo11,12; Portanto, as respostas às drogas podem diferir muito entre as linhas de organóides pcas humanas. Na Figura 3,a resposta das moléculas antiandrogênicas de dois organóides pca humanos distintos, MSKPCA2 e MSKPCA3 são mostrados. A proliferação de organóides MSKPCA2 foi fortemente inibida por moléculas antiandrogênicas, enquanto os organóides MSKPCA3 permaneceram inalterados(Figura 3A,B). Os organóides MSKCPCA2 expressaram altos níveis de AR e fkbp5 alvo ar, e eles expressaram proteínas luminais marca, como CK8 e CK18. Em contraste, organóides MSKPCA3 também expressaram marcadores basais (CK5) e mesenchymal (Vimentin) e não mostraram expressão de FKBP5. Estes resultados sugerem que estes organóides modelam um fenótipo não luminal e independente de andrógeno.
Figura 1: Medir as taxas de formação de organóides de células prospílias humanas e de camundongos. (A)Visão geral esquemática da resuspensão celular na matriz da membrana do porão (esquerda) e semeadura organóide em cúpulas matrôneas (direita). (B) Formação relativa organóide de células basais e lumina derivadas de CD49f+(CD26+)(, eixo y; média ± SD) na presença de 1 NM DHT. Um total de 200 células foram semeadas e o número de organóides foi quantificado 7 dias após a semeadura (n = 3, ***p < 0,01, t-test). (C) Formação organóide relativa de murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ,e P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids (, y-axis;média ± SD) na presença de 1 nM DHT. Um total de 200 células foram semeadas e o número de organóides foi quantificado 7 dias após a semeadura (n = 3). p53 e Pten perda foi mediada pela segmentação do gRNA do p53 e / ou pten locus em organóides expressando Cas9 constitutivamente um promotor Rosa26. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Avaliando a resposta farmacológica de organóides derivados de camundongos geneticamente modificados. (A) Proliferação celular relativa de murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, e P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids (y-axis,mean ± SD, medido por kit de ensaio de viabilidade celular) de 2.500 células 7 dias após o estabelecimento de organóides; (n = 3, *p < 0,05, t-test) com 1 nM DHT ou 10 μM de antiandrogende segunda geração, conforme indicado. (B) Imagens representativas de campos brilhantes de WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δ,e P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoid culturas tratadas com 1 nM DHT ou 10 μM de segunda geração anti-andrógeno, como indicado. C) Curva representativa de crescimento de WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δ, e P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organóides injetados subcutaneously no flanco de camundongos isogênicos C57/Bl6. Apenas os organóides P53Δ/Δ PtenΔ/Δ apresentaram crescimento. Um total de 1 x 106 células foram injetadas. Três curvas independentes de P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids são mostradas para mostrar a heterogeneidade na velocidade de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Avaliar a resposta farmacológica de organóides derivadas biópsias humanas de câncer de próstata. (A) Proliferação celular relativa de organóides MSKPCA2 e MSKPCA2 derivados do paciente(y-eixo,média ± SD, medida pelo kit de ensaio de viabilidade celular) de 5.000 células 7 dias após o estabelecimento de organóides (n = 4, *p < 0,05, t-test) com 1 nM DHT ou 10 μM segunda geração anti-andrógeno, como indicado. (B) Imagens representativas de campos brilhantes das culturas de organóides MSKPCA2 e MSKPCA3 tratadas com 1 nM DHT ou 10 μM de segunda geração anti-andrógeno, conforme indicado. (C) Análise ocidental de borrões de AR, FKBP5 (gene AR-alvo), CK8 e CK18 (marcadores luminais), CK5 (marcador basal) e Vimentin (marcador mesenchymal) em órgãos MSKPCA2 e MSKPCA3. Gapdh foi usado como um controle de carga. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Eficiência da semeade organóide (%) | Número de semeadura celular (por cúpula) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Tabela 1: Números de semeadura celular usados para avaliar a resposta farmacológica com base na capacidade de formação organóide. Tabela por coluna (da esquerda para a direita) inclui faixas de capacidade de formação organóide e o número correspondente de células para semente por cúpula matrônea.
| Número total da pilha | PBS0+ Y-27632 PBS0 + Y-27632 | Volume de Matrigel | concentração celular / Injeção |
| 5 x 106 | 500 μl 500 μl | 500 μl 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl 500 μl | 500 μl 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl 500 μl | 500 μl 500 μl | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl 500 μl | 500 μl 500 μl | 2 x 106 |
Tabela 2: Números de células recomendados para experimentos de xenoenxerto organóide. As colunas da esquerda para a direita incluem o número total absoluto da pilha para 10 injeções, o volume total de PBS + Y-27632 para 10 injeções, o volume da matriz da membrana do porão, e o número de pilha por a injeção.
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Discussion
Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência antiandrógena e descobrir potenciais vulnerabilidades terapêuticas requer testes de respostas farmacológicas em sistemas modelo que imitem o câncer de próstata. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a análise confiável das respostas farmacológicas em organóides de próstata derivados e geneticamente modificados do paciente e a preparação dessas amostras organóides para aplicações a jusante.
Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro é determinar a eficiência de semeada e a taxa de crescimento dos organóides. A velocidade de crescimento organóide varia muito. Isto depende de espécies, à medida que os organóides derivados da urina crescem cerca de duas vezes mais rápido do que os organóides derivados do homem. Além das espécies, a velocidade de crescimento depende do genótipo e do fenótipo. No entanto, quando a eficiência de semeada e a velocidade de crescimento são determinadas, este protocolo pode ser adaptado a todos os tipos organóides da próstata.
O segundo passo crítico é trabalhar com a cultura 3D baseada em matriz de proteína para se preparar para as subsequentes aplicações a jusante. A introdução da variação de semeanação pela viscosidade da matriz da membrana do porão durante o revestimento pode ser evitada usando diluído (70%) matriz de membrana do porão, conforme descrito. A quebra adequada da matriz polimerada sem perturbar excessivamente os organóides também é descrita em detalhes. Este protocolo permite a ruptura da matriz sem introduzir variação na leitura organóide, que pode ser adaptada para a triagem de bibliotecas de medicamentos para diferentes origens genéticas em PCa. Além disso, realizando interferência de expressão baseada em CRISPR/Cas9 ou shRNA, genes que conferem resistência a medicamentos podem ser consultados.
Um ponto de consideração é que a composição média da cultura organóide da próstata pode influenciar a resposta farmacológica. Por exemplo, o EGF, um componente da cultura organóide da murina e da próstata humana, reduz consideravelmente a sensibilidade ao anti-andrógeno. Assim, o EGF é omitido neste protocolo a partir do meio, e a sensibilidade ao anti-andrógeno é restaurada. É aconselhável determinar se algum ingrediente organóide influencia a sensibilidade para a droga que está sendo testada. Isto é especialmente verdadeiro para o complexo meio de cultura organóide da próstata humana, que (além de EGF, Noggin, R-spondin1, DHT e A83-001 [a composição do murine organóide médio]) contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandina E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandina E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandina E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandina E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, contém fator de crescimento fibroblasto 10 (FGF10), FGF2, prostaglandina E2, nicotinamida e o inibidor de p38i SB202190.
A composição média organóide favorece o crescimento do epitélio benigno da próstata sobre o tecido cancerígeno, portanto, nenhuma linha organóide pca sensível ao hormônio primário foi estabelecida. Atualmente, todos os organóides pca humanos são derivados de pacientes com PCa resistente metastático avançado antiandrógeno; assim, a maioria dessas linhas são resistentes a andrógenos e adequadas para identificar novos tratamentos. Como prova de conceito, delta-like 3 (DLL3) foi identificado como um alvo terapêutico usando organóides NEPC derivados do paciente que são alvo de rovalpituzumab tesirine13. Este método é adequado para estes tipos de experimentos e também é adequado para organóides da próstata a partir de tecido benigno normal, câncer de próstata primário e CTCs.
Uma deficiência da cultura organóide da próstata é a ausência de um nicho celular. Assim, as contribuições à resistência à droga por pilhas do não-tumor não podem ser estudadas usando a plataforma atual. No entanto, co-culturas de câncer colorretal e organóides do câncer de pulmão com células T autólogas foram recentemente estabelecidas, permitindo estudos de interações entre o tumor e o sistema imunológico14. Outros sistemas de cocultura podem ser estabelecidos para estudar interações não autônomas celulares.
Em conclusão, este relatório fornece um protocolo detalhado para a avaliação reproduzível das respostas farmacológicas em organóides da próstata e subsequentes aplicações a jusante. Importante, este protocolo é amplamente aplicável e pode ser usado para culturas organóides de outros órgãos, incluindo o cólon15, intestino delgado16 , estômago17,18, fígado19, pâncreas20, rim21,e glândula mamária22.
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Disclosures
A C.L.S atua no conselho de administração da Novartis; é co-fundador da ORIC Pharmaceuticals e coinventor da enzalutamida e apalutamida; é consultor científico da Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra e PMV; e é co-fundador da Seragon, comprada pela Genentech/Roche em 2014. W.R.K. é um coinventor e detentor de patentes da tecnologia organóide.
Acknowledgments
K.P. é apoiado pelo NIH 1F32CA236126-01. A C.L.S. é apoiada pela HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; e Starr Cancer Consortium. W.R.K. é apoiado pela Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 e pela Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
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