Summary
Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung pharmakologischer Reaktionen bei prostataepitheliale Organoide vorgestellt. Organoide ähneln der in vivo-Biologie und rekapitulieren die Genetik der Patienten, was sie zu attraktiven Modellsystemen macht. Prostata-Organoide können aus Wildtyp-Prostata, gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden.
Abstract
Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Pharmakodynamik, des Stammzellpotenzials und der Krebsdifferenzierung in Prostataepithelialorganoiden vorgestellt. Prostata-Organoide sind Androgen-responsive, dreidimensionale (3D) Kulturen in einem definierten Medium gewachsen, die dem Prostataepithel ähnelt. Prostata-Organoide können aus Wildtyp- und gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden. Wichtig ist, dass von Patienten abgeleitete Organoide Tumoren in der Genetik und in vivo Tumorbiologie sehr ähnlich sind. Darüber hinaus können Organoide mit CRISPR/Cas9- und shRNA-Systemen genetisch manipuliert werden. Diese kontrollierte Genetik macht die Organoidkultur als Plattform attraktiv, um die Auswirkungen von Genotypen und Mutationsprofilen auf pharmakologische Reaktionen schnell zu testen. Experimentelle Protokolle müssen jedoch speziell an die 3D-Natur von organoiden Kulturen angepasst werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Beschrieben sind detaillierte Protokolle für die Durchführung von Seeding-Assays, um die Organoidbildungsfähigkeit zu bestimmen. Anschließend zeigt dieser Bericht, wie medikamentöse Behandlungen durchgeführt und pharmakologische Reaktionen durch Durchführbarkeitsmessungen, Proteinisolation und RNA-Isolation analysiert werden können. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie Organoide für Xenografting und nachfolgende In-vivo-Wachstumstests mit subkutaner Transplantation vorbereitet werden. Diese Protokolle liefern hochreproduzierbare Daten und sind weithin auf 3D-Kultursysteme anwendbar.
Introduction
Arzneimittelresistenz ist eines der größten klinischen Probleme in der Krebsbehandlung. Die Behandlung von metastasierendem Prostatakrebs (PCa) richtet sich in erster Linie an die Androgen-Signalachse. Anti-Androgen-Therapien der nächsten Generation (z. B. Enzalutamid und Abirateron) haben große klinische Erfolge gezeigt, aber praktisch alle PCa entwickelt sich schließlich in Richtung eines Androgen-unabhängigen Zustands oder kastrationsresistenten Prostatakrebses (CRPC).
Jüngste genomische und transkriptomische Profilierung von CRPC ergab, dass es drei allgemeine Mechanismen der Resistenz bei Prostatakrebs: 1) aktivierende Mutationen, die in der Wiederherstellung des Androgenrezeptors (AR) Signalisierung1; 2) Aktivierung der Bypass-Signalisierung, wie in einem präklinischen Modell für Anti-Androgen-Therapieresistenz der nächsten Generation veranschaulicht, in der die Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors (GR) den Verlust der AR-Signalisierung2kompensieren kann; und 3) den kürzlich identifizierten Prozess der Linienplastizität, bei dem Tumorzellen Resistenzen erlangen, indem sie Linien von einem vom Wirkstoffziel abhängigen Zelltyp auf einen anderen Zelltyp umstellen, der nicht davon abhängig ist (der in PCa als AR-negativ dargestellt wird und/oder neuroendokrine Erkrankung [NEPC])3,4. Die molekularen Mechanismen, die Arzneimittelresistenzen verursachen, werden jedoch nicht verstanden. Darüber hinaus, erworbene Anti-Androgen-Resistenz kann zu therapeutischen Schwachstellen führen, die ausgenutzt werden können. Daher ist es wichtig, Arzneimittelreaktionen in Modellsystemen zu bewerten, die Phänotypen und Genotypen von Patienten imitieren.
Prostata-Organoide sind organotypische Kulturen, die in einer 3D-Proteinmatrix mit einem definierten Medium angebaut werden. Wichtig ist, Prostata-Organoide können aus gutartigem und krebsartigem Gewebe murinen oder menschlichen Ursprungs nachgewiesen werden, und sie behalten phänotypische und genotypische Merkmale, die in vivo gefunden werden5,6. Wichtig ist, sowohl Anti-Androgen-empfindliche PCa- als auch CRPC-Zellen sind im aktuellen Kompendium von Organoiden dargestellt. Darüber hinaus lassen sich Prostata-Organoide mit CRISPR/Cas9 und shRNA5leicht genetisch manipulieren. So sind Prostata-Organoide ein geeignetes Modellsystem, um Arzneimittelreaktionen zu testen und Resistenzmechanismen aufzuklären. Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben, um Arzneimitteltests durchzuführen und pharmakologische Reaktionen mit Prostataorganoiden zu analysieren.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Arbeiten wurden mit zuvor etablierten murinen Organoiden und patientenabgeleiteten Organoiden durchgeführt. Alle tierischen Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Research Animal Resource Center des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012) durchgeführt. Alle patientenabgeleiteten Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001) gesammelt.
1. Mittel- und Puffervorbereitung
- Vor Beginn des Experiments die Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) bei 4 °C über Nacht auftauen. Halten Sie es während des Gebrauchs auf Eis.
- Kulturplatten vor Experimenten für 24 h bei 37 °C platzieren. Dies wird der Kellermembran-Matrixkuppel (im Folgenden als Matrixkuppel bezeichnet) helfen, polymerisieren zu können. Die Beschichtung von Organoiden wird in Schritt 2.1.2 beschrieben.
- Bereiten Sie das organoide Medium gemäß dem etablierten Protokoll5vor.
- Bereiten Sie das organoide Medium ohne Zugabe eines epidermalen Wachstumsfaktors vor (EGF; siehe Tabelle der Materialien für Komponenten). EGF unterdrückt die AR-Transkriptionsausgabe und verleiht Anti-Androgen-Resistenz5.
- Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) vor.
HINWEIS: Dieses Medium wird verwendet, um die enzymatische Verdauung mit Trypsin-Ersatz in abschnitt2-4 zu hemmen. - Bereiten Sie Arzneimittellösungen gemäß dem Herstellerprotokoll vor. Für Enzalutamid/mdv3100 (im Folgenden als Antiandrogen der zweiten Generation bezeichnet) wird eine Stammlösung von 100 M in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereitet. Der Vorrat kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden und muss nicht frisch gemacht werden.
2. Isolierung, enzymatische Verdauung und Etablierung von Organoiden
- Isolieren Sie Prostata-Organoide aus Maus oder menschlichem Gewebe nach den zuvor festgelegten Protokollen5,7. Eine kurze Beschreibung finden Sie unten.
- Mince und enzymatisch verdauen Prostatagewebe, um eine einzellige Suspension zu produzieren. In diesem Experiment wurde 1 ml von 5 mg/ml Kollagenase Typ II in ADMEM/F12 zur Verdauung von 50 mg Prostatagewebe verwendet.
- Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min, zählen Sie die Zellen, setzen Sie sie in der Kellermembranmatrix wieder auf und Platten mit der entsprechenden Dichte5,7 in den Matrixkuppeln auf vorgewärmten organoiden Kulturplatten (Plating Methode ist in Abbildung 1Adargestellt.
- Lassen Sie die Kuppeln verfestigen und fügen Sie Medien auf die Oberseiten der Kuppeln, so dass sie vollständig abgedeckt sind.
- Wachsen Sie Organoide auf die gewünschte Menge für nachgeschaltete Anwendungen. Die Zellennummer kann durch Standardzählmethoden bestimmt werden. Weitere Informationen zur Dichte finden Sie im anwendungsspezifischen Abschnitt des Protokolls.
- Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten zu stören. Wenn die Kellermembranmatrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml konisches Rohr. Platzieren Sie nicht mehr als 10 Kuppeln pro einzelnem 15 ml konischen Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min mit Schütteln bei 37 °C verdauen. Fügen Sie ein gleiches Volumen organoiden Medium + 10% FBS, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie ihn in 1 ml PBS wieder auf.
- Filtern Sie die Suspension mit einem 40-mm-Filter, um eine Einzelzellensuspension zu gewährleisten. Quantifizieren Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer oder einem gleichwertigen Zählgerät.
HINWEIS: Wenn es schwierig ist, lebensfähige Einzelzellen zu erhalten, verwenden Sie die Durchflusssortierung, um eine Einzelzellenlösung zu erhalten.
3. Beurteilung der Organoidbildungskapazität
HINWEIS: Um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die ein Organoid erzeugen können, kann ein Seeding-Assay als Proxy für das Stamm-/Vorläuferpotential durchgeführt werden. Die Organoidbildungskapazität ist auch wichtig für die Definition einer Zellsäzahl für die Lebensfähigkeits-Assays.
- Verdünnen Sie die in Schritt 2,7 bis 100 Zellen pro 10 l der Suspension erhaltene Zellsuspension mit organoiden Mitteln, die 10 M Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 enthalten.
- Übertragen Sie 1.100 Zellen (110 L Suspension) in ein neues konisches Rohr.
- Fügen Sie 285 L Kellermembranmatrix hinzu und suspendieren Sie die Zellen. Dies führt zu einer Matrixkonzentration von 70 %.
HINWEIS: Die Verdünnung der Kellermembranmatrix während der Aussaat reduziert die Streuung der Kuppelgröße, die durch die Viskosität der Proteinmatrix verursacht wird, erheblich. - Samenzellen in 35 L Matrixkuppeln in einer vorgewärmten 24-Well-Platte, was zu 200 Zellen/Well führt. Platte 3-5 repliziert pro Probe (siehe auch Beschichtungsmethode in Abbildung 1A und Schritt 2.1.2).
- Um sicherzustellen, dass die Zellen innerhalb der Matrixkuppel verbleiben, kippen Sie die Platte um und legen Sie sie in einen Zellinkubator, um die Kellermembranmatrix zu erstarren.
- Nach 10 min entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor hinzu.
- Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage. Nach 7 Tagen, quantifizieren Sie die Anzahl der Organoide. Halten Sie den Rho-Kinase-Inhibitor in den Medien während des gesamten Experiments.
- Zählen Sie die Anzahl der pro Kuppel eingerichteten Organoide und berechnen Sie den Prozentsatz der Organoide, die aus der Gesamtzahl der plattierten Zellen (200 Zellen) gebildet werden.
HINWEIS: Die Organoiden-Betriebsverhältnisse variieren je nach Zelltyp und Genotyp zwischen 3%und 60%.
4. Bestimmung der pharmakologischen Reaktionen von Organoiden
- Weiter von Schritt 2.7, Samen 1.000-10.000 Zellen in einer Matrixkuppel. Verwenden Sie die Organoidbildungseffizienz und Wachstumsgeschwindigkeit als Proxy für die Bestimmung der endgültigen Zellzahl.
HINWEIS: Empfohlene Zellennummern sind in Tabelle 1angegeben. Verwenden Sie drei bis fünf Replikationen pro Bedingung pro Analyse. Verwenden Sie eine Endkonzentration von 70% Kellermembranmatrix, um Pipettierfehler zu reduzieren, die durch die Viskosität induziert werden. - Saat 35 l Matrixkuppeln in einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Kuppeln wie in Abschnitt 3 verfestigen (siehe auch Beschichtungsverfahren in Abbildung 1A und Schritt 2.1.2). Fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor und Medikament der Wahl. Diese Methode kann auf alle Medikamente angewendet werden, aber in diesem Protokoll wird ein Anti-Androgen der zweiten Generation bei 10 M für ein Beispiel verwendet. Um die halbmaximale hemmende Konzentration (IC50) zu bestimmen, führen Sie eine log10 inkrementelle, und als Kontrolle, verwenden Sie das Fahrzeug, in dem das Medikament gelöst wurde.
- Erfrischen Sie das Medium alle zwei oder drei Tage und analysieren Sie die Organoide am 7. Tag, um die pharmakologische Reaktion des Arzneimittels zu bestimmen. Die Zeitpunkte können je nach Experiment und Medikament variieren.
HINWEIS: Organoide müssen nicht versucht werden, um diese Assays durchzuführen. - Um Organoide intakt zu halten, mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören.
- Wenn die Kellermembranmatrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension auf ein 15 ml konisches Rohr. Übertragen Sie nicht mehr als 10 Matrixkuppeln pro 15 ml konischem Rohr.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Den Überstand abziehen und mit 5 ml PBS waschen.
- Organoide in 1 ml PBS wieder aufsetzen und die Organoide mit Trituration und einer gläsernen Pasteurpipette stören.
- Quantifizieren Sie die Anzahl der organoiden Fragmente. Seed 5 repliziert, die 100 organoide Fragmente enthalten, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben.
- Führen Sie den Zelllebensfähigkeitstest wie unten in Abschnitt 7 beschrieben durch.
5. RNA-Isolierung von Organoiden
HINWEIS: Kommerziell erhältliche säulenbasierte Methoden liefern eine gute Quantität und Qualität der RNA. Um eine gute RNA-Menge zu gewährleisten, verwenden Sie mindestens eine Kuppel pro Probe; Es wird jedoch empfohlen, drei Kuppeln zu verwenden, die in einem einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte gesät werden können.
- ß-Mercaptoethanol hinzufügen (1%) glutathionlyse puffer im RNA-Isolationskit.
- Ziehen Sie das Medium aus den Kellermembrankuppeln mit Organoiden ab und fügen Sie 750 l dieses Puffers hinzu. Pipette nach oben und unten mit einer P1000 Pipette. Überprüfen Sie, ob die gesamte Kellermembranmatrix aufgelöst wurde.
- 750 L Ethanol hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Anschließend 700 l des Gemischs auf die Säule übertragen, bei 12.000 x g 1 min zentrifugieren und mit dem Rest des Lysats wiederholen.
- Führen Sie Wähungen und eine On-Column-DNase-Behandlung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Elute-RNA in 30-50 l RNAse-freiem Wasser.
- Messen Sie die Konzentrationen mit einem Fluorometer bei OD = 260 nm und 280 nm und lagern Sie bei -80 °C oder setzen Sie sich mit nachgelagerten Anwendungen fort.
6. Proteinisolation von Organoiden
HINWEIS: Für die Proteinisolierung bereiten Sie den Standard-RIPA-Puffer vor, der Phosphatase- und Proteaseinhibitoren enthält (Materialtabelle). Es wird empfohlen, mindestens drei Kuppeln zu verwenden, die in einem einzigen 12 Brunnen gesät werden können.
- Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium aus der Zelle mit den Keller Membrankuppeln mit Organoiden und Pipetten nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören.
- Wenn sie vollständig gestört ist, übertragen Sie die Aufhängung auf ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Den Überstand abziehen und mit 5 ml eiskaltem PBS waschen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min verdauen, während sie bei 37 °C schütteln.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen des organoiden Mediums + 10% FCS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollte keine Kellermembranmatrix im Pellet sichtbar sein. - Den Überstand abziehen und mit 5 ml eiskaltem PBS waschen. Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Zellpellet in 300 l Lysepuffer mit einer P1000 Pipet wieder ab und übertragen Sie es dann in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- 10 min auf Eis bebrüten und anschließend 2x für je 30 s bei gekühltem Wasser bei einer Temperatur von 4 °C beschallen. Legen Sie die Röhre wieder auf Eis und führen Sie die Proteinquantifizierung mit Standardmethoden durch.
- Denaturieren Sie das Protein durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS), das Belastungsfarbstoff enthält, und kochen Sie 5 min bei 95 °C. Lysate bei -80 °C lagern oder mit nachgeschalteten Anwendungen fortfahren.
7. Zelllebensfähigkeitstest mit Organoiden
HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit kann mit dem handelsüblichen Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit und einem Luminometer beurteilt werden. Bereiten Sie Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Es werden fünf Replikationen pro Zustand empfohlen: eine Replikation, die aus einer 35-L-Kellermembran-Matrixkuppel in einem Brunnen einer 24-Well-Platte besteht.
- Zeichnen Sie das Medium der organoiden Kultur ab, wobei Sie darauf achten, die Matrixkuppeln intakt zu lassen.
- Fügen Sie 65 L PBS und Pipette nach oben und unten hinzu, um die Matrixkuppel zu stören.
- Fügen Sie 100 L des Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit-Puffers hinzu und setzen Sie sie durch Pipettieren wieder auf.
- Bei Raumtemperatur (RT) 10 min mit Schütteln inkubieren.
- Übertragen Sie 100 l gemisch auf eine nicht transluzente Platte, die für das Luminometer geeignet ist, und führen Sie das Lesen gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit durch.
8. Zubereitung von Organoiden für xenografting
HINWEIS: Organoide sind auch für subkutane Transplantationen bei immungeschwächten Tieren sowie isogenen Mäusen geeignet. Um sicherzustellen, dass in vivo injizierte Organoide unterscheidbar sind, kennzeichnen Sie Organoide mit einem konstitutiv exzierenden Fluorophor5. Es wird empfohlen, ein Pilotexperiment für die Transplantation mit 5 x 105 Zellen bis 2 x 106 Zellen pro Injektion durchzuführen, mit Schritten von 5 x 106 Zellen, da die Pfropfeffizienz zwischen organoiden Linien variiert.
- Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören. Wenn sie vollständig gestört ist, übertragen Sie die Aufhängung auf ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
HINWEIS: Übertragen Sie nicht mehr als 10 Matrixkuppeln pro 15 ml konischem Rohr. - Den Überstand abziehen und mit 5 ml PBS waschen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min verdauen, während sie bei 37 °C schütteln.
- Fügen Sie gleicheVolumen des organoiden Mediums + 10% FBS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie ihn in 1 ml PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 40-mm-Filter, um eine Einzelzellensuspension zu gewährleisten. Quantifizieren Sie Zellen mit Standardmethoden.
- Drehen Sie die Zellen im PBS+ Rho-Inhibitor auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen pro 100 l aus (siehe Tabelle 2 für Zellkonzentrationen und absolute Zellzahl, die für unterschiedliche Konzentrationen erforderlich sind). Verwenden Sie ein gleiches Volumen der Kellermembranmatrix, um eine 1:1 Suspension zu erzeugen. Legen Sie die Suspension auf Eis.
- Injektion von Zellen nach Standardprotokollen und Überwachung des Xenograft-Wachstums mit Standardmethoden8.
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Representative Results
Seeding-Effizienz
Die Organoidbildungsfähigkeit wird durch Phänotyp und Genotyp bestimmt. Wildtyp (WT) Prostata-Basalzellen zeigten eine überlegene Organoidbildungskapazität (30%-40%) im Vergleich zu Leuchtzellen (3%) (Abbildung 1A). Nach der organoiden Etablierung nahm die Formationskapazität drastisch zu. In der Regel können 25%-30% der Zellen, die aus einem WT-Organoid gewonnen werden, ein neues Organoid bilden (Abbildung 1B). Der CRISPR/Cas9-vermittelte Verlust vonPten (Pten) oder p53 (p53) führte zu einer geringfügigen Erhöhung der Organoidbildungskapazität. Verlust von p53 und Pten weiter erhöhte Formationskapazität (Abbildung 1B).
Pharmakologische seratologisches Ansprechen
Basierend auf der Aussaateffizienz wurde die Aussaat von 1.000-10.000 Zellen in 35 L Kellermembran-Matrixkuppel in einer 24-Well-Platte durchgeführt. Empfohlene Zellsäzahlen auf der Grundlage der Organoidbildungseffizienz sind in Tabelle 1angegeben. Die Organoidproliferationsgeschwindigkeiten können jedoch je nach Genotyp stark variieren. Zusätzliche Änderungen an der Zelle Sänummer kann auf der Grundlage der Proliferation vorgenommen werden.
In Abbildung 2wurden die Auswirkungen antiandrogener Moleküle auf das Wachstum in murinen Organoiden mit verschiedenen Genotypen getestet. Insgesamt 2.500 Zellen wurden aus murinen Organoiden mit einem WT-Genotyp, p53-Verlust, Pten-Verlust oder dualen p53- und Pten-Verlust gesät. p53 und Pten-Verlust wurde durch die lentivirale Einführung einer gRNA eingeleitet, die auf die p53 und/oder Pten-Heuschrecke bei Organoiden abzielte, die Cas9 unter der Kontrolle des Rosa26-Promotors mit einem C57/Bl6-Genhintergrund konstitutiv ausdrückten9.
Der Verlust von p53 verursachte keine Resistenz gegen die antiandrogenen Moleküle. Verlust von Pten erhöhte Resistenz gegen anti-androgene Verbindung, wie zuvor gezeigt10. Der doppelte Verlust von p53 und Pten führte jedoch zu einer vollständigen Resistenz gegen das Antiandrogen der zweiten Generation (Abbildung 2A). AR-Hemmung veränderte auch Organoid-Phänotypen. Unter Kontrolle Cas9+/+ Organoide, sowie P53- -gelöscht undPten - Organoide, wurde eine Abnahme der organoiden Lumengröße beobachtet (Abbildung 2B). p53- Pten - Organoide waren phänotypisch unbeeinflusst (Abbildung 2B). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wuchsen nur die P53-Zellen , wenn 1 x 10 6 Zellen subkutan in die Flanke gepfropft wurden (Abbildung 2C). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass p53- Pten - Co-Deletion führt zu Resistenz gegen die zweite Generation Anti-Androgen in murinen Organoiden.
Patienten-abgeleitete PCa-Organoide sind heterogen in Phänotyp und Genotyp11,12; Daher können die Reaktionen auf Medikamente zwischen menschlichen PCa-Organoidlinien stark variieren. In Abbildung 3wird die antiandrogene Molekülantwort von zwei unterschiedlichen humanen PCa-Organoiden, MSKPCA2 und MSKPCA3, gezeigt. Die Proliferation von MSKPCA2-Organoiden wurde durch antiandrogene Moleküle stark gehemmt, während MSKPCA3-Organoide nicht betroffen blieben (Abbildung 3A,B). MSKCPCA2-Organoide drückten hohe AR- und AR-Target-FKBP5-Werte aus, und sie drückten markante Leuchtdichteproteine wie CK8 und CK18 aus. Im Gegensatz dazu exprimierte MSKPCA3-Organoide auch basale (CK5) und mesenchymale (Vimentin) Marker und zeigten keinen Ausdruck von FKBP5. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Organoide einen nicht-luminalen Androgen-unabhängigen Phänotyp modellieren.
Abbildung 1: Messung der organoiden Bildungsraten von Prostatazellen bei Menschen und Mäusen. (A) Schematische Übersicht über die Zellresuspension in der Kellermembranmatrix (links) und die organoide Aussaat in Matrixkuppeln (rechts). (B) Relative organoide Bildung von humanen (CD49f+)-abgeleiteten basalen und (CD26+)abgeleiteten Luminalzellen (%, y-Achse; Mittelwert SD) in Gegenwart von 1 nM DHT. Insgesamt wurden 200 Zellen ausgesät und die Anzahl der Organoide wurde 7 Tage nach der Aussaat quantifiziert (n = 3, ***p < 0,01, t-Test). (C) Relative organoide Bildung von muriner WT, Pten, P53, ,und P53, Pten , Organoide (%, y-Achse;Mittelwert SD) in Gegenwart von 1 nM DHT. Insgesamt wurden 200 Zellen ausgesät und die Anzahl der Organoide wurde 7 Tage nach der Aussaat quantifiziert (n = 3). P53 und Pten Verlust wurde durch die gRNA Targeting der p53 und/oder Pten Locus in Organoiden, die Cas9 konstitutiv unter einem Rosa26-Promoter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der pharmakologischen Reaktion von Organoiden, die von gentechnisch veränderten Mäusen stammen. (A) Relative Zellproliferation von murinischem WT, Pten,P53,und P53, Pten , Organoide(y-Achse,Mittelwert SD, gemessen durch Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit) von 2.500 Zellen 7 Tage nach der Etablierung Organoide; (n = 3, *p < 0,05, t-Test) mit 1 nM DHT oder 10 m Antiandrogen der zweiten Generation, wie angegeben. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von WT, Pten,P53, undP53 ,Pten, Organoidkulturen, die mit 1 nM DHT oder 10 M Antiandrogen der zweiten Generation behandelt wurden, wie angegeben. (C) Repräsentative Wachstumskurve von WT, Pten,P53,und P53, Pten, Organoide, subkutan in die Flanke isogener C57/Bl6-Mäuse injiziert. Nur P53 -/-Pten-Organoide zeigten Wachstum. Insgesamt wurden 1 x 106 Zellen injiziert. Es werden drei unabhängige Kurven von P53-Organoiden gezeigt, die Heterogenität in der Wachstumsgeschwindigkeit aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der pharmakologischen Reaktion von Organoiden abgeleiteten menschlichen Prostatakrebsbiopsien. (A) Relative Zellproliferation von vom Patienten abgeleiteten MSKPCA2- und MSKPCA2-Organoiden(y-Achse,Mittelwert sD, gemessen durch Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit) von 5.000 Zellen 7 Tage nach der Etablierung von Organoiden (n = 4, *p < 0,05, t-Test) mit 1 nM DHT oder 10 Anti-Androgen der zweiten Generation wie angegeben. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von MSKPCA2- und MSKPCA3-Organoidkulturen, die wie angegeben mit 1 nM DHT oder 10 M Anti-Androgen der zweiten Generation behandelt wurden. (C) Western Blot Analyse von AR, FKBP5 (AR-Target-Gen), CK8 und CK18 (Luminalmarker), CK5 (Basalmarker) und Vimentin (mesenchymal Marker) in MSKPCA2 und MSKPCA3 Organoiden. GAPDH wurde als Ladesteuerung eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Organoide Saateffizienz (%) | Zellen-Saatzahl (pro Kuppel) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Tabelle 1: Zellsäzahlen, die zur Beurteilung des pharmakologischen Ansprechens auf der Grundlage der Organoidbildungskapazität verwendet werden. Tabelle für Spalte (von links nach rechts) enthält Organoidbildungskapazitätsbereiche und die entsprechende Anzahl von Zellen, die pro Matrixkuppel gesät werden.
| Zellenzahl insgesamt | PBS0+ Y-27632 | Matrigel-Volumen | Zellkonzentration / Injektion |
| 5 x 106 | 500 l | 500 l | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 l | 500 l | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 l | 500 l | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 l | 500 l | 2 x 106 |
Tabelle 2: Empfohlene Zellnummern für organoide Xenografting-Experimente. Die Spalten von links nach rechts enthalten die absolute Gesamtzellzahl für 10 Injektionen, das Gesamtvolumen von PBS + Y-27632 für 10 Injektionen, das Volumen der Kellermembranmatrix und die Zellzahl pro Injektion.
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Discussion
Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Anti-Androgen-Resistenz zugrunde liegen, und um potenzielle therapeutische Schwachstellen zu entdecken, müssen pharmakologische Reaktionen in Modellsystemen getestet werden, die Prostatakrebs imitieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Analyse pharmakologischer Reaktionen bei patientenabgeleiteten und gentechnisch veränderten Prostataorganoiden und zur Herstellung dieser Organoidproben für nachgelagerte Anwendungen beschrieben.
Dieses Protokoll besteht aus zwei wichtigen Schritten. Die erste ist die Bestimmung der Aussaateffizienz und Wachstumsrate von Organoiden. Organoide Wachstumsgeschwindigkeit variiert stark. Dies ist von Arten abhängig, da murinabgeleitete Organoide etwa zweimal schneller wachsen als vom Menschen abgeleitete Organoide. Abgesehen von den Arten ist die Wachstumsgeschwindigkeit von Genotyp und Phänotyp abhängig. Wenn jedoch die Aussaateffizienz und die Wachstumsgeschwindigkeit bestimmt werden, kann dieses Protokoll an alle Prostataorganoidtypen angepasst werden.
Der zweite kritische Schritt ist die Arbeit mit der Proteinmatrix-basierten 3D-Kultur, um sich auf nachfolgende downstream Anwendungen vorzubereiten. Die Einführung der Saatvariation durch Viskosität der Kellermembranmatrix während der Beschichtung kann durch die Verwendung von verdünnten (70%) vermieden werden. Kellermembranmatrix, wie beschrieben. Das richtige Aufbrechen der polymerisierten Matrix, ohne die Organoide übermäßig zu stören, wird ebenfalls ausführlich beschrieben. Dieses Protokoll ermöglicht eine Störung der Matrix ohne Variation in der Organoid-Auslesung, die für das Screening von Arzneimittelbibliotheken auf unterschiedliche genetische Hintergründe in PCa angepasst werden kann. Darüber hinaus können durch die Durchführung von CRISPR/Cas9- oder shRNA-basierten Expressionsinterferenzen Gene, die eine Arzneimittelresistenz verleihen, abgefragt werden.
Ein Aspekt ist, dass die mittlere Zusammensetzung der Prostataorganoidkultur die pharmakologische Reaktion beeinflussen kann. Zum Beispiel, EGF, eine Komponente der murinen und menschlichen Prostata-Organoid-Kultur, stark reduziert Empfindlichkeit gegenüber Anti-Androgen. Daher wird EGF in diesem Protokoll aus dem Medium weggelassen, und die Empfindlichkeit gegenüber Anti-Androgen wird wiederhergestellt. Es wird empfohlen, festzustellen, ob organoide Inhaltsstoffe die Empfindlichkeit für das getestete Medikament beeinflussen. Dies gilt insbesondere für das komplexe humane Prostataorganoid-Kulturmedium, das (außer EGF, Noggin, R-Spondin1, DHT und A83-001 [die Zusammensetzung des murinen Organoidmediums]) den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 (FGF10), FGF2, Prostaglandin E2, Nicotinamid und den p38i-Inhibitor SB202190.
Die organoide mittlere Zusammensetzung begünstigt das Wachstum von gutartigem Prostataepithel gegenüber Krebsgewebe, so dass keine primären hormonempfindlichen PCa-Organoidlinien festgestellt wurden. Derzeit werden alle humanen PCa-Organoide von Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden Anti-Androgen-resistenten PCa abgeleitet; Daher sind die meisten dieser Linien anti-Androgen resistent und geeignet für die Identifizierung neuer Behandlungen. Als Proof-of-Concept wurde Delta-like 3 (DLL3) als therapeutisches Ziel mit patientenabgeleiteten NEPC-Organoiden identifiziert, die mit rovalpituzumab tesirine13zielbar sind. Diese Methode eignet sich für diese Art von Experimenten und eignet sich auch für Prostata-Organoide aus normalem gutartigem Gewebe, primärem Prostatakrebs und CTCs.
Ein Manko der Prostata-Organoidkultur ist das Fehlen einer zellulären Nische. Daher können Beiträge zur Arzneimittelresistenz durch Nicht-Tumorzellen nicht mit hilfe der aktuellen Plattform untersucht werden. Jedoch, Ko-Kulturen von Dickdarmkrebs und Lungenkrebs Organoide mit autologen T-Zellen wurden vor kurzem etabliert, ermöglicht Studien der Wechselwirkungen zwischen dem Tumor und dem Immunsystem14. Andere Co-Kultur-Systeme können eingerichtet werden, um nicht-zellautonome Wechselwirkungen weiter zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Bericht ein detailliertes Protokoll für die reproduzierbare Bewertung pharmakologischer Reaktionen bei Prostataorganoiden und nachfolgenden nachgelagerten Anwendungen enthält. Wichtig ist, dieses Protokoll ist breit anwendbar und kann für Organoidkulturen anderer Organe verwendet werden, einschließlich des Dickdarms15, Dünndarm16 , Magen17,18, Leber19, Bauchspeicheldrüse20, Niere21und Brustdrüse22.
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Disclosures
C.L.S ist Mitglied des Verwaltungsrats von Novartis; ist Mitbegründer von ORIC Pharmaceuticals und Miterfinder von Enzalutamid und Apalutamid; ist Wissenschaftsberater von Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra und PMV; und ist Mitbegründer von Seragon, das 2014 von Genentech/Roche gekauft wurde. W.R.K. ist Miterfinder und Patentinhaber der Organoidtechnologie.
Acknowledgments
K.P. wird von NIH 1F32CA236126-01 unterstützt. C.L.S. wird von HHMI unterstützt; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; und Starr Cancer Consortium. W.R.K. wird von dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 und Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
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