Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om farmacologische reacties te bestuderen in prostaat epitheel organoïden. Organoïden lijken nauw in vivo biologie en even patiënt genetica, waardoor ze aantrekkelijk modelsystemen. Prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit wild type prostates, genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker.
Abstract
Hier gepresenteerd is een protocol voor het bestuderen van farmacodynamica, stamcel potentieel, en kanker differentiatie in prostaat epitheel organoïden. Prostaat organoïden zijn androgeen responsieve, driedimensionale (3D) culturen geteeld in een gedefinieerd medium dat lijkt op het prostaat epitheel. Prostaat organoïden kunnen worden opgebouwd uit wild-type en genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker. Belangrijk, patiënt afgeleide organoïden sterk lijken op tumoren in de genetica en in vivo tumor biologie. Bovendien kunnen organoïden genetisch gemanipuleerd worden met behulp van CRISPR/Cas9 en shRNA systemen. Deze gecontroleerde genetica maken de organoïde cultuur aantrekkelijk als een platform voor het snel testen van de effecten van genotypen en mutationele profielen op farmacologische reacties. Experimentele protocollen moeten echter specifiek worden aangepast aan de 3D-aard van organoïde culturen om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Hier beschreven zijn gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van zaaien testen om te bepalen van de organoïde vorming capaciteit. Vervolgens laat dit rapport zien hoe u medicamenteuze behandelingen uitvoert en de farmacologische respons analyseert via de levensvatbaarheid metingen, eiwit isolatie en RNA-isolatie. Ten slotte wordt in het protocol beschreven hoe organoïden voor xenografting en daaropvolgende in vivo groei testen worden bereid met subcutane enten. Deze protocollen leveren zeer reproduceerbare gegevens op en zijn algemeen toepasbaar op 3D-kweeksystemen.
Introduction
Resistentie tegen geneesmiddelen is een van de belangrijkste klinische problemen bij de behandeling van kanker. De behandeling met gemetastaseerde prostaatkanker (PCa) is primair gericht op de androgeen-signalering van de as. De volgende generatie anti-androgeen therapieën (bijv. enzalutamide en abirateron) hebben een groot klinisch succes aangetoond, maar vrijwel alle PCa vordert uiteindelijk in de richting van een androgeen onafhankelijke staat of castratieresistente prostaatkanker (CRPC).
Recente genomische en transcriptomische profilering van CRPC onthuld er zijn drie algemene mechanismen van resistentie bij prostaatkanker: 1) activerende mutaties resulterend in het herstel van de androgeen receptor (AR) signalering1; 2) activering van bypass signalering, zoals geïllustreerd in een pre-klinisch model voor de volgende generatie anti-androgeen therapie resistentie waarbij activering van de glucocorticoide receptor (GR) kan compenseren voor verlies van AR signalering2; en 3) het recent geïdentificeerde proces van de afstamming plasticiteit, waarin tumorcellen weerstand verwerven door het overschakelen van de lijn van een celtype afhankelijk van het doel van de drug naar een ander celtype dat niet afhankelijk is van deze (die, in PCa, wordt weergegeven als AR-negatieve en/of neuro-endocriene ziekte [nepc])3,4. Echter, de moleculaire mechanismen die drug resistentie veroorzaken zijn niet begrepen. Bovendien, verworven anti-androgeen resistentie kan leiden tot therapeutische kwetsbaarheden die kunnen worden uitgebuit. Daarom is het essentieel om te evalueren van drug reacties in modelsystemen die patiënten fenotypes en genotypes nabootsen.
Prostaat-organoïden zijn organotypische culturen die worden gekweekt in een 3D-eiwit matrix met een gedefinieerd medium. Belangrijk is dat prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit goedaardig en kanker weefsel van Murine of menselijke oorsprong, en ze behouden fenotypische en genotypische kenmerken die in vivo5,6worden aangetroffen. Belangrijk is dat zowel de anti-androgeen gevoelige PCa-en CRPC-cellen worden vertegenwoordigd in het huidige compendium van organoïden. Bovendien zijn prostaat organoïden gemakkelijk genetisch gemanipuleerd met CRISPR/Cas9 en shRNA5. Dus, prostaat organoïden zijn een geschikt modelsysteem voor het testen van drug reacties en verhelderende resistentiemechanismen. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om medicijn testen uit te voeren en farmacologische reacties te analyseren met behulp van prostaat organoïden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven werkzaamheden zijn uitgevoerd met eerder vastgestelde muriene organoïden en door de patiënt afgeleide organoïden. Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het onderzoek dierlijke hulpbronnen centrum van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Alle weefsels van de patiënt afgeleide werden verzameld in overeenstemming met de regels en voorschriften van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. middelmatige en buffer voorbereiding
- Het ontdooien van de kelder membraan matrix (bv. Matrigel) bij 4 °C 's nachts voor aanvang van het experiment. Houd het op ijs tijdens het gebruik.
- Plaats cultuur platen bij 37 °C gedurende 24 uur voorafgaand aan experimenten. Dit zal helpen de kelder membraan matrix koepel (hierna aangeduid als matrix Dome) te polymerize. Het bekleden van organoïden wordt beschreven in stap 2.1.2.
- Bereid het organoïde medium volgens het vastgestelde protocol5.
- Bereid het organoïde medium zonder toevoeging van epidermale groeifactor (EFG; Zie tabel van materialen voor componenten). EFG onderdrukt de AR transcriptionele output en verleent anti-androgeen resistentie5.
- Bereid Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS).
Opmerking: deze media worden gebruikt voor de remming van de enzymatische spijsvertering met trypsine-vervanging in secties 2-4. - Bereid drugs oplossingen volgens het Protocol van de fabrikant. Voor enzalutamide/mdv3100 (hierna "tweede generatie anti-androgeen" genoemd), bereidt u een stamoplossing van 100 μM voor in dimethylsulfoxide (DMSO). De voorraad kan maximaal 6 maanden bij-20 °C worden bewaard en hoeft niet vers te worden gemaakt.
2. isolatie, enzymatische spijsvertering en oprichting van organoïden
- Isoleer de prostaat organoïden van de muis of het menselijk weefsel volgens de eerder vastgestelde protocollen5,7. Hieronder vindt u een korte beschrijving.
- Mince en enzymatisch verteren prostaatweefsel om een enkelvoudige celsuspensie te produceren. In dit experiment werd 1 mL van 5 mg/mL Collagenase type II in ADMEM/F12 gebruikt voor de vertering van 50 mg prostaatweefsel.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten, Tel de cellen, regeer ze in de kelder membraan matrix en plaat op de juiste dichtheid5,5in de matrix koepels op voorverwarmde organoïde-kweek platen (plating methode wordt weergegeven in Figuur 1A).
- Laat de koepels stollen en voeg media toe op de toppen van de koepels zodat ze volledig bedekt zijn.
- Kweek organoïden naar de gewenste hoeveelheid voor downstreamtoepassingen. Het celnummer kan worden bepaald door standaard tellings methoden. Zie de toepassingsspecifieke sectie van het protocol voor meer informatie over dichtheid.
- Gebruik een P1000 pipet en trek het medium en de pipet omhoog en omlaag om te verstoren. Wanneer de kelder membraan matrix volledig is verstoord, breng de suspensie over naar een conische buis van 15 mL. Plaats niet meer dan 10 koepels per enkele 15 mL conische buis. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek de supernatant uit en was de celpellet met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek het supernatant uit en rebreng de pellet in 4 mL trypsine-vervanging. Verteren voor 5-10 min met schudden bij 37 °C. Voeg een gelijk volume organoïde medium + 10% FBS toe om de vervanging van trypsine te remmen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek de supernatant uit en rebreng in 1 mL PBS.
- Filter de suspensie met een 40 μm filter om een enkelvoudige celsuspensie te garanderen. Kwantificeer het aantal cellen met een hemocytometer of een gelijkwaardig telapparaat.
Opmerking: als het verkrijgen van levensvatbare afzonderlijke cellen moeilijk is, gebruikt u stroom sortering om een oplossing met één cel te verkrijgen.
3. beoordeling organoïde vorming capaciteit
Opmerking: om het percentage cellen te bepalen dat een organoïde kan genereren, kan een zaaien test worden uitgevoerd als een proxy voor de stam-/voorloper mogelijkheden. De organoïde formatie capaciteit is ook belangrijk voor het definiëren van een cel zaaien nummer voor de levensvatbaarheid testen.
- Verdun de celsuspensie die is verkregen in stap 2,7 tot 100 cellen per 10 μL van de suspensie met behulp van organoïde medium dat 10 μM Rho kinase remmer Y-27632 bevat.
- Breng 1.100 cellen (110 μL suspensie) over in een nieuwe conische buis.
- Voeg 285 μL van de kelder membraan matrix toe en hervat de cellen. Dit zal resulteren in een ~ 70% matrix concentratie.
Opmerking: verdunning van de kelder membraan matrix tijdens het zaaien sterk vermindert de variatie in koepel grootte, veroorzaakt door de viscositeit van de eiwit matrix. - Zaadcellen in 35 μL matrix koepels in een voorverwarmde 24-goed plaat, resulterend in 200 cellen/goed. Plaat 3-5 repliceert per monster (Zie ook de beplating methode in Figuur 1A en stap 2.1.2).
- Om ervoor te zorgen dat de cellen binnen de matrix koepel blijven, moet u de plaat omdraaien en in een celincubator plaatsen om de kelder membraan matrix te stollen.
- Na 10 min, verwijder de plaat van de incubator en voeg medium met de Rho kinase remmer.
- Vernieuw het medium elke 2 dagen. Kwantificeer na 7 dagen het aantal organoïden. Houd de Rho kinase remmer in de media tijdens het experiment.
- Tel het aantal organoïden dat per koepel is vastgesteld en bereken het percentage van de organoïden dat is gevormd uit het totale aantal cellen dat is verguld (200 cellen).
Opmerking: Organoïde-inrichting ratio's variëren van 3%-60%, afhankelijk van het celtype en het genotype.
4. bepaling van de farmacologische reacties van organoïden
- Voortzetting van stap 2,7, zaad 1000-10000 cellen in een matrix koepel. Gebruik de organoïde formatie efficiëntie en groeisnelheid als een proxy voor het bepalen van het uiteindelijke celnummer.
Opmerking: aanbevolen celnummers zijn beschikbaar in tabel 1. Gebruik drie tot vijf replicaties per voorwaarde per analyse. Gebruik een eindconcentratie van 70% kelder membraan matrix om Pipetteer fouten geïnduceerd door de viscositeit te verminderen. - Zaai 35 μL matrix koepels in een 24-pits plaatje en laat de koepels stollen zoals gedaan in rubriek 3 (Zie ook de plating methode in Figuur 1a en stap 2.1.2). Voeg medium met de Rho kinase remmer en drug van keuze. Deze methode kan worden toegepast op alle drugs, maar in dit protocol, een tweede generatie anti-androgeen wordt gebruikt bij 10 μM voor een voorbeeld. Om de helft van de maximale remmende concentratie (IC50) te bepalen, voert u een log10 incrementeel uit en gebruikt u als controle het voertuig waarin het geneesmiddel is opgelost.
- Vernieuw het medium om de twee of drie dagen en analyseer de organoïden op dag 7 om de farmacologische reactie van het medicijn te bepalen. De tijdspunten kunnen variëren tussen de keuze van het experiment en de drug.
Opmerking: Organoïden hoeven niet te worden trypsinized om deze testen uit te voeren. - Om organoïden intact te houden met behulp van een P1000 Pipet, stelt u het medium en de pipet omhoog en omlaag in om de kelder membraan matrix te verstoren.
- Wanneer de kelder membraan matrix volledig verstoord is, breng de suspensie over naar een conische buis van 15 mL. Breng niet meer dan 10 matrix koepels aan per 15 mL conische buis.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Trek de supernatant uit en was met 5 ml PBS.
- Respendeer organoïden in 1 mL PBS en ontwer de organoïden met behulp van trituratie en een glazen Pasteur pipet.
- Kwantificeer het aantal organoïde fragmenten. Zaad 5 repliceert met 100 organoïde fragmenten zoals beschreven in stap 2.1.2.
- Voer de test van de levensvatbaarheid van de cel uit zoals hieronder beschreven in rubriek 7.
5. RNA-isolatie van organoïden
Opmerking: in de handel verkrijgbare methoden op basis van kolommen leveren een goede hoeveelheid en kwaliteit van RNA. Om te zorgen voor een goede hoeveelheid RNA, gebruik een minimum van één koepel per monster; echter, met behulp van drie koepels wordt aanbevolen, die kan worden geseeid in een enkele put van een 12 goed plaat.
- ß-mercaptoethanol toevoegen (1%) aan de glutathion lysisbuffer in de RNA Isolation Kit.
- Trek het medium uit de kelder membraan koepels met organoïden en voeg 750 μL van deze buffer toe. Pipetteer op en neer met een P1000 pipet. Controleer of alle kelder membraan matrix is opgelost.
- Voeg 750 μL van 70% ethanol toe en meng door Pipetting. Breng vervolgens 700 μL van het mengsel naar de kolom, centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 1 minuut en herhaal dit met de rest van het lysaat.
- Voer wast en DNase behandeling op de kolom uit volgens de instructies van de fabrikant. Elute RNA in 30-50 μL RNAse-vrij water.
- Meet de concentraties met behulp van een fluor meter bij OD = 260 nm en 280 nm en bewaar bij-80 °C of ga verder met downstreamtoepassingen.
6. eiwit isolatie van organoïden
Opmerking: voor eiwit isolatie bereidt u standaard RIPA-buffer met fosfatase-en proteaseremmers (tabel met materialen). Het gebruik van ten minste drie koepels wordt aanbevolen, die kunnen worden gesest in een enkele 12 goed.
- Met behulp van een P1000 Pipet, het medium uit de cel met de kelder membraan koepels met organoïden en pipet op en neer te verstoren de kelder membraan matrix.
- Wanneer het volledig verstoord is, breng de suspensie over in een conische buis van 15 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek de supernatant af en was met 5 mL ijskoude PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek het supernatant uit en rebreng de pellet in 4 mL trypsine-vervanging. Verteren voor 5-10 min tijdens het schudden bij 37 °C.
- Voeg een gelijk volume organoïde medium + 10% FCS toe om de vervanging van trypsine te remmen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
Opmerking: Postcentrifugeren, geen kelder membraan matrix moet zichtbaar zijn in de pellet. - Trek de supernatant af en was met 5 mL ijskoude PBS. Trek het supernatant uit en regeer de celpellet in 300 μL lysisbuffer met behulp van een P1000 pipet en breng vervolgens over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Incuberen op ijs gedurende 10 minuten en vervolgens soniceren 2x voor 30 s elk bij gekoeld water met een temperatuur van 4 °C. Plaats de buis weer op ijs en voer eiwit kwantificering uit met behulp van standaardmethoden.
- Denatureren van het eiwit door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS) met laad kleurstof en kook gedurende 5 minuten bij 95 °C. Bewaar lysaten bij-80 °C of ga verder met downstreamtoepassingen.
7. cellevens vatbaarheid test met organoïden
Opmerking: de levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld aan de hand van de in de handel verkrijgbare testkit en een luminometer. Buffers voorbereiden volgens de instructies van de fabrikant. Vijf replicaten per aandoening wordt aanbevolen: één replicaat bestaande uit 1 35 μL kelder membraan matrix koepel in een put van een 24 goed plaat.
- Trek het medium van de organoïde cultuur uit en zorg ervoor dat de matrix koepels intact blijven.
- Voeg 65 μL PBS toe en Pipetteer omhoog en omlaag om de matrix koepel te verstoren.
- Voeg 100 μL van de cel levensvatbaarheid assay buffer en respenderen door pipetteren.
- Incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten met schudden.
- Breng 100 μL van het mengsel over naar een niet-doorschijnende plaat die geschikt is voor de luminometer en voer de meting uit volgens de instructies van de fabrikant voor de cel-levensvatbaarheid-assay kit.
8. bereiding van organoïden voor xenotransplanteren
Opmerking: Organoïden zijn ook vatbaar voor subcutaan enten in zowel immuungecompromitteerde dieren, als voor isogene muizen. Om ervoor te zorgen dat geïnjecteerde organoïden in vivo te onderscheiden zijn, etiket organoïden met een constitutief uitdrukken van de5. Het wordt aanbevolen om een proef experiment uit te voeren voor het enten met 5 x 105 cellen tot 2 x 106 cellen per injectie, met een veelvoud van 5 x 106 cellen, aangezien het enten van de transplantatie-efficiëntie varieert tussen organoïde lijnen.
- Gebruik een P1000 pipet en trek het medium en de pipet omhoog en omlaag om de kelder membraan matrix te verstoren. Wanneer het volledig verstoord is, breng de suspensie over in een conische buis van 15 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
Opmerking: Breng niet meer dan 10 matrix koepels per 15 mL conische buis over. - Trek de supernatant uit en was met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek het supernatant uit en rebreng de pellet in 4 mL trypsine-vervanging. Verteren voor 5-10 min tijdens het schudden bij 37 °C.
- Voeg gelijk volume organoïde medium + 10% FBS toe om trypsine-vervanging te remmen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Trek de supernatant uit en rebreng in 1 mL PBS. Filter de suspensie met een 40 μm filter om een enkelvoudige celsuspensie te garanderen. Kwantificeer cellen met behulp van standaardmethoden.
- Spin naar beneden en regeer de cellen in PBS + Rho-remmer tot een concentratie van 2 x 106 cellen per 100 μL (Zie tabel 2 voor celconcentraties en absoluut celgetal dat nodig is voor verschillende concentraties). Gebruik een gelijk volume van de kelder membraan matrix om een 1:1 suspensie te genereren. Plaats de suspensie op ijs.
- Injecteer cellen volgens standaardprotocollen en bewaak de groei van xenotransplantaat met behulp van standaardmethoden8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seeding efficiency
De organoïde vorming wordt bepaald door fenotype en genotype. Wild-type (WT) prostaat basale cellen toonde superieure organoïde vorming capaciteit (30%-40%) vergeleken met Luminale cellen (3%) (Figuur 1A). Na organoïde inrichting nam de capaciteits formatie drastisch toe. Normaalgesproken kan 25%-30% van de cellen afgeleid van een GEW organoïde een nieuwe organoïde vormen (Figuur 1B). CRISPR/Cas9-gemedieerd verlies van Pten (PtenΔ/δ) of p53 (p53δ/δ) resulteerde in een geringe toename van de organoïde formatie capaciteit. Verlies van zowel p53 als Pten verdere toegenomen vorming capaciteit (Figuur 1B).
Farmacologische respons
Op basis van de zaaien-efficiëntie is het zaaien van 1000-10000 cellen in 35 μL van de kelder membraan matrix koepel in een 24-put-plaat uitgevoerd. Aanbevolen celseeding getallen op basis van de efficiëntie van organoïde vorming wordt gegeven in tabel 1. Echter, organoïde proliferatie snelheden kunnen verschillen sterk afhankelijk van genotype. Aanvullende wijzigingen in het nummer van de cel zaaien kunnen worden gemaakt op basis van proliferatie.
In Figuur 2werden de effecten van anti-androgene moleculen op de groei getest in muriene organoïden met verschillende genotypes. Een totaal van 2.500 cellen werden van muriene organoïden gescheiden met een WT genotype, p53 Loss, Pten verlies, of dubbele p53 en Pten verlies. p53 en Pten Loss werd geïnitieerd door lentiviral introductie van een gRNA gericht op de p53 en/of pten Locus in organoïden constitutief uiten Cas9 onder de controle van de Rosa26 promotor met een C57/Bl6 genetische achtergrond9.
Verlies van p53 veroorzaakt geen resistentie tegen de anti-androgene moleculen. Verlies van Pten verhoogde weerstand tegen anti-androgene verbinding, zoals eerder weergegeven10. Dubbel verlies van p53 en Pten resulteerde echter in volledige weerstand tegen de tweede generatie anti-androgeen (Figuur 2A). AR-remming veranderde ook organoïde fenotypes. In Control Cas9+/+ organoïden, evenals P53δ/δ-deleted en PtenΔ/δ organoïden, werd een afname van de organoïde lumen grootte waargenomen (Figuur 2B). p53δ/δ PtenΔ/δ organoïden waren fenotypisch onaangetast (Figuur 2B). In lijn met deze resultaten groeide, wanneer 1 x 106 cellen subcutaan in de flank werden geënt, alleen p53δ/δ PtenΔ/Δ organoïden (Figuur 2C). Over het geheel genomen tonen deze resultaten aan dat p53δ/δ PtenΔ/δ co-deletie resulteert in resistentie tegen de tweede generatie anti-androgeen in muriene organoïden.
Door patiënten afgeleide PCA-organoïden zijn heterogeen in fenotype en genotype11,12; Daarom, reacties op drugs kunnen sterk verschillen tussen menselijke PCA organoïde lijnen. In Figuur 3, de anti-androgene moleculen reactie van twee verschillende menselijke PCA organoïden, MSKPCA2 en MSKPCA3 worden weergegeven. Proliferatie van MSKPCA2 organoïden werd sterk geremd door anti-androgene moleculen, terwijl MSKPCA3 organoïden onaangetast bleven (Figuur 3A, B). MSKCPCA2 organoïden uitgedrukt hoge niveaus van AR en de AR-target FKBP5, en ze uitgedrukt Hallmark luminal eiwitten zoals CK8 en CK18. MSKPCA3 organoïden gaven daarentegen ook basale (CK5) en mesenchymale (Vimentin) markeringen weer en toonden geen expressie van FKBP5. Deze resultaten suggereren dat deze organoïden model een niet-luminaal androgeen-onafhankelijk fenotype.
Figuur 1: meten van de organoïde vorming van humane en muis prostaat cellen. (A) schematisch overzicht van de celresuspensie in de kelder membraan matrix (links) en organoïde zaaien in matrix koepels (rechts). B) relatieve organoïde vorming van humane (CD49f +)-afgeleide basale en (CD26 +)-afgeleide Luminale cellen (%, y-as; gemiddelde ± SD) in aanwezigheid van 1 nm DHT. In totaal werden 200 cellen geseerd en het aantal organoïden werd 7 dagen na het zaaien (n = 3, * * * p < 0,01, t-test) vastgesteld. C) relatieve organoïde vorming van Murine WT, PtenΔ/δ, P53δ/δen P53δ/δ PtenΔ/δ organoïden (%, y-as; gemiddelde ± SD) in aanwezigheid van 1 nm DHT. In totaal werden 200 cellen geseerd en het aantal organoïden werd 7 dagen na het zaaien (n = 3) vastgesteld. p53 en pten Loss werd gemedieerd door de grna's targeting van de P53 en/of pten Locus in Organoïden die Cas9 constitutief uitdrukken onder een Rosa26 promotor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: beoordeling van de farmacologische respons van organoïden die zijn afgeleid van genetisch gemanipuleerde muizen. A) relatieve celproliferatie van MURINE WT, PtenΔ/δ, P53δ/Δen P53δ/δ PtenΔ/δ ORGANOÏDEN (y-as, gemiddelde ± SD, gemeten door de levensvatbaarheid van de cel) van 2.500 cellen 7 dagen na de oprichting van organoïden (n = 3, * p < 0,05, t-test) met 1 nM DHT of 10 μM van de tweede generatie Antiandrogeen zoals aangegeven. B) representatieve brightfield-beelden van WT, PtenΔ/δ, P53δ/δen P53δ/δ PtenΔ/δ organoïde culturen behandeld met 1 nm DHT of 10 μM tweede generatie anti-androgeen zoals aangegeven. C) representatieve groeicurve van WT, PtenΔ/δ, P53δ/Δen P53δ/δ PtenΔ/δ organoïden subcutaan geïnjecteerd in de flank van de isogene C57/Bl6 muizen. Alleen P53δ/δ PtenΔ/δ organoïden toonde groei. In totaal werden 1 x 106 cellen geïnjecteerd. Drie onafhankelijke curves van P53δ/δ PtenΔ/Δ organoïden tonen aan dat de heterogeniteit van de groeisnelheid wordt aangetoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: beoordeling van de farmacologische respons van organoïden afgeleide humane prostaatkanker biopsieën. A) relatieve celproliferatie van door de patiënt afgeleide MSKPCA2 en MSKPCA2 organoïden (y-as, gemiddelde ± SD, gemeten met de cel-levensvatbaarheid-assay kit) van 5.000 cellen 7 dagen na de oprichting van organoïden (n = 4, * p < 0,05, t-test) met 1 nm DHT of 10 μM tweede generatie anti-androgeen zoals aangegeven. B) representatieve brightfield-beelden van MSKPCA2 en MSKPCA3 organoïden culturen die behandeld zijn met 1 nm DHT of 10 μM tweede generatie anti-androgeen zoals aangegeven. C) analyse van de Western Blot van AR, FKBP5 (AR-target gen), CK8 en CK18 (luminal markers), CK5 (basale marker) en Vimentine (mesenchymale marker) in MSKPCA2 en MSKPCA3 organoïden. GAPDH werd gebruikt als laadregelaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Organoïde zaaien-efficiëntie (%) | Cel-seeding nummer (per koepel) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Tabel 1: celseeding getallen die worden gebruikt om de farmacologische respons te beoordelen op basis van de organoïde formatie capaciteit. Tabel per kolom (van links naar rechts) omvat organoïde vorming capaciteitsbereik en het overeenkomstige aantal cellen naar zaad per matrix koepel.
| Totaal aantal cellen | PBS0 + Y-27632 | Matrigel volume | celconcentratie/injectie |
| 5 x 106 | 500 μl | 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl | 500 μl | 2 x 106 |
Tabel 2: aanbevolen celaantallen voor organoïde xenografting experimenten. Kolommen van links naar rechts bevatten het absolute totale aantal cellen voor 10 injecties, het totale volume van PBS + Y-27632 voor 10 injecties, het volume van de kelder membraan matrix en het celnummer per injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inzicht in de moleculaire mechanismen onderliggende anti-androgeen resistentie en het ontdekken van potentiële therapeutische kwetsbaarheden vereist testen van farmacologische reacties in modelsystemen nabootsen van prostaatkanker. Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de betrouwbare analyse van farmacologische reacties bij patiënten afgeleide en genetisch gemanipuleerde prostaat organoïden en de bereiding van deze organoïde monsters voor downstreamtoepassingen.
Er zijn twee belangrijke stappen in dit protocol. De eerste is het bepalen van de zaaien efficiëntie en groeisnelheid van organoïden. De organoïde groeisnelheid varieert sterk. Dit is afhankelijk van de soort, aangezien de organoïden van Murine ongeveer tweemaal sneller groeien dan de mens afgeleide organoïden. Naast soorten is de groeisnelheid afhankelijk van genotype en fenotype. Echter, wanneer zaaien efficiëntie en groeisnelheid worden bepaald, dit protocol kan worden aangepast aan alle prostaat organoïde types.
De tweede kritieke stap is het werken met de op eiwitten matrix gebaseerde 3D-cultuur om zich voor te bereiden op latere downstreamtoepassingen. De introductie van het zaaien variatie door viscositeit van de kelder membraan matrix tijdens het beplating kan worden vermeden door het gebruik van verdunde (70%) kelder membraan matrix, zoals beschreven. Het correct afbreken van de gepolymeriseerde matrix zonder overdreven verstoring van de organoïden wordt ook gedetailleerd beschreven. Dit protocol maakt verstoring van de matrix mogelijk zonder variatie in de organoïde uitlezen in te voeren, die kan worden aangepast voor de screening van medicijn bibliotheken voor verschillende genetische achtergronden in PCa. Bovendien kan door het uitvoeren van CRISPR/Cas9-of shRNA-gebaseerde expressie-interferentie, genen die de resistentie tegen geneesmiddelen toekennen, worden opgevraagd.
Een punt van overweging is dat de gemiddelde samenstelling van de prostaat organoïde cultuur de farmacologische respons kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld, EGF, een onderdeel van zowel de Murine en menselijke prostaat organoïde cultuur, sterk vermindert de gevoeligheid voor anti-androgeen. Daarom wordt het EFG weggelaten in dit Protocol van het medium en wordt de gevoeligheid voor anti-androgeen hersteld. Het wordt geadviseerd om te bepalen of organoïde ingrediënten de gevoeligheid voor de geteste drug beïnvloeden. Dit geldt met name voor het complexe humane prostaat organoïde kweekmedium, dat (behalve EGF, Noggin, R-spondin1, DHT en A83-001 [de samenstelling van muriene organoïde medium]) fibroblast groeifactor 10 (FGF10), FGF2, prostaglandine E2, Nicotinamide en de p38i-remmer SB202190.
De organoïde medium samenstelling gunsten de groei van goedaardige prostaat epitheel over kanker weefsel, dus geen primaire hormoon gevoelige PCA organoïde lijnen zijn vastgesteld. Momenteel zijn alle humane PCa-organoïden afgeleid van patiënten met geavanceerde metastatische anti-androgeen resistente PCa; Vandaar, de meeste van deze lijnen zijn anti-androgeen resistent en geschikt voor het identificeren van nieuwe behandelingen. Als proof-of-concept, Delta-achtige 3 (DLL3) is geïdentificeerd als een therapeutisch doelwit met behulp van patiënt afgeleide NEPC organoïden die worden getarget met rovalpituzumab tesirine13. Deze methode is geschikt voor dit soort experimenten en is ook geschikt voor prostaat organoïden van normaal goedaardig weefsel, primaire prostaatkanker en Ctc's.
Een tekortkoming van de prostaat organoïde cultuur is de afwezigheid van een cellulaire niche. Zo, bijdragen aan de resistentie van de drug door niet-tumorcellen kan niet worden bestudeerd met behulp van het huidige platform. Echter, co-culturen van colorectale kanker en longkanker organoïden met autologe T-cellen zijn onlangs vastgesteld, waardoor studies van interacties tussen de tumor en het immuunsysteem14. Er kunnen andere co-cultuur systemen worden opgezet om niet-cel-autonome interacties verder te bestuderen.
Concluderend, dit verslag verschaft een gedetailleerd protocol voor de reproduceerbare beoordeling van farmacologische reacties bij prostaat organoïden en daaropvolgende downstreamtoepassingen. Belangrijk is dat dit protocol algemeen toepasbaar is en kan worden gebruikt voor organoïde culturen van andere organen, waaronder de Colon15, dunne darm16 , maag17,18, lever19, alvleesklier20, nier21, en borstklier22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C. L. S dient in de Raad van bestuur van Novartis; is een medeoprichter van ORIC Pharmaceuticals en coinventor van enzalutamide en apalutamide; is een wetenschaps adviseur van Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra en PMV; en is medeoprichter van Seragon, aangekocht door Genentech/Roche in 2014. W.R.K. is een coinventor en patenthouder van organoïde technologie.
Acknowledgments
K.P. wordt ondersteund door NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. wordt ondersteund door HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; en Starr Cancer consortium. W.R.K. wordt ondersteund door de Nederlandse kanker Stichting/KWF buit 2015-7545 en de prostaatkanker Stichting PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
