Summary
这里介绍的是一个协议，研究在前列腺上皮器官的药理反应。有机体与体内生物学非常相似，并重述了患者基因，使它们成为有吸引力的模型系统。前列腺器官可以从野生型前列腺、基因工程小鼠模型、良性人体组织和晚期前列腺癌中建立。
Abstract
这里介绍的是研究前列腺上皮器官的药效动力学、干细胞潜力和癌症分化的一个方案。前列腺有机体是雄激素反应，三维（3D）培养生长在定义的介质，类似于前列腺上皮。前列腺器官可以从野生型和基因工程小鼠模型、良性人体组织和晚期前列腺癌中建立。重要的是，患者衍生的有机物在遗传学和体内肿瘤生物学中与肿瘤非常相似。此外，有机物可以使用CRISPR/Cas9和shRNA系统进行基因操作。这些受控遗传学使有机体培养具有吸引力，成为快速测试基因型和突变型对药理反应的影响的平台。然而，实验协议必须特别适应有机体培养的3D特性，以获得可重复的结果。此处介绍了用于执行种子测定以确定有机体形成能力的详细协议。随后，本报告展示了如何通过可行性测量、蛋白质分离和RNA分离来进行药物治疗和分析药理反应。最后，该协议描述了如何使用皮下移植制备异种移植和后续体内生长测定的有机物。这些协议产生高度可重复的数据，并广泛适用于3D培养系统。
Introduction
耐药性是癌症治疗的主要临床问题之一。转移性前列腺癌（PCa）治疗主要针对雄激素信号轴。下一代抗雄激素疗法（例如，苯甲酰胺和阿比拉酮）在临床上取得了巨大的成功，但几乎所有PCa最终都朝着雄激素独立状态，即抗雄激素前列腺癌（CRPC）发展。
最近CRPC的基因组和转录组谱显示前列腺癌有三种一般抗药性机制：1）激活突变，导致雄激素受体（AR）信号1的恢复;2） 旁路信号激活，如下一代抗雄激素治疗抗性临床前模型，其中糖皮质激素受体（GR）的激活可以补偿AR信号2的损失;3） 最近确定的谱系可塑性过程，其中肿瘤细胞通过从依赖药物靶向的细胞类型转换到不依赖于此的另一种细胞类型（在PCa中，表现为AR阴性）获得抗药性和/或神经内分泌疾病[NEPC]）3，4.然而，引起耐药性的分子机制并不为人所知。此外，获得抗雄激素耐药性可能导致治疗脆弱性，可以加以利用。因此，在模拟患者表型和基因型的模型系统中评估药物反应至关重要。
前列腺有机体是在具有定义介质的3D蛋白质基质中生长的器官培养物。重要的是，前列腺器官可以从鼠的良性和癌性组织或人类起源建立，它们保留在体内5，6中发现的体型和基因状特征。重要的是，抗雄激素敏感PCa和CRPC细胞都表现在当中有机物简编中。此外，前列腺器官很容易使用CRISPR/Cas9和shRNA5进行基因操作。因此，前列腺器官是测试药物反应和阐明抗药性机制的合适模型系统。在这里，详细的协议描述，以执行药物测试和分析使用前列腺有机体的药理反应。
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Protocol
本协议中描述的所有工作均使用先前建立的鼠类器官和患者衍生的有机体执行。所有动物工作均按照纪念斯隆凯特林癌症中心研究动物资源中心（IACUC：06-07-012）的准则进行。所有患者衍生组织均按照纪念斯隆凯特林癌症中心（IRB： 12001）的规则和规定进行收集。
1. 中度和缓冲液制备
- 在开始实验前，在4°C过夜解冻基底膜基质（例如，Matrigel）。在使用过程中将其放在冰上。
- 在实验前将培养板置于37°C下24小时。这将有助于基底膜基质圆顶（以下简称矩阵圆顶）聚合。电镀有机物在步骤 2.1.2 中描述。
- 根据既定的协议5制备有机体介质。
- 在不添加表皮生长因子的情况下制备有机体介质（EGF;有关成分的材料表）。EGF抑制AR转录输出，并产生抗雄激素电阻5。
- 用10%的胎儿牛血清（FBS）制备Dulbeco的改良鹰培养基（DMEM）。
注：此介质用于在第 2-4 节中用胰蛋白酶替换来抑制酶消化。 - 根据制造商的协议准备药物溶液。对于苯甲酰胺/mdv3100（以下简称第二代抗雄激素），制备二甲基亚硫酸盐（DMSO）中100μM的库存溶液。库存可在-20°C下储存长达6个月，不需要新鲜。
2. 隔离、酶消化和器官的建立
- 根据先前确立的协议5，7从小鼠或人体组织分离前列腺器官。下面提供了简要说明。
- 敏敏和酶消化前列腺组织，产生单个细胞悬浮液。在本实验中，ADMEM/F12中5mg/mL胶原酶的1mL用于消化50mg的前列腺组织。
- 在300 x g下收集细胞5分钟，计算细胞，将其重新悬浮在基底膜基质中，并在预加热的有机物培养板上的基质圆顶以适当的密度5、7板方法如图1A所示。
- 允许圆顶凝固，并将介质添加到圆顶顶部，以便完全覆盖。
- 将有机物生长到下游应用所需的数量。细胞数可以通过标准计数方法确定。有关密度的其他详细信息，请参阅协议特定于应用程序的部分。
- 使用 P1000 移液器，向上和向下绘制介质和移液器以中断。当基底膜基质完全中断时，将悬架转移到15 mL锥形管中。不要放置超过 10 圆顶每 15 mL 锥形管。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，用5 mL的PBS洗涤细胞颗粒。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，在4 mL的胰蛋白酶更换中重新悬浮颗粒。消化5-10分钟，在37°C下摇动。加入同等体积的有机物介质 + 10% FBS，以抑制胰蛋白酶的替换。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮。
- 使用 40 μm 过滤器过滤悬架，以确保单个电池悬浮液。使用血细胞计或等效计数设备量化细胞数量。
注：如果难以获取可行的单个细胞，请使用流排序来获取单个单元解。
3. 评估器官形成能力
注：要确定可生成有机体的细胞的百分比，可以作为茎/祖细胞电位代理进行种子测定。有机体形成能力对于确定细胞种子数对于可行性测定也很重要。
- 使用含有10μM Rho激酶抑制剂Y-27632的有机体培养基，稀释在步骤2.7至100个悬浮液中获得的细胞悬浮液。
- 将 1，100 个细胞（110 μL 的悬浮液）转移到新的锥形管中。
- 加入285μL的基底膜基质，重新悬浮细胞。这将导致±70%的基质浓度。
注：在播种过程中，基底膜基质的稀释大大减少了由于蛋白质基质粘度引起的圆顶尺寸的变化。 - 种子细胞在预加热的24孔板中的35μL基质圆顶中，产生200个细胞/孔。每个样品的板 3-5 复制（另请参阅图1A和步骤 2.1.2 中的电镀方法）。
- 为了确保细胞留在基质圆顶内，翻转板并将其放入细胞培养箱中，以巩固基底膜基质。
- 10分钟后，从培养箱中取出板，加入含有Rho激酶抑制剂的培养基。
- 每 2 天刷新一次媒体。7天后，量化器官的数量。在整个实验中，将Rho激酶抑制剂保存在介质中。
- 计算每个圆顶建立的器官数量，并计算从镀层细胞总数（200个细胞）中形成的器官百分比。
注： 组织建立比率从 3%-60% 取决于细胞类型和基因型。
4. 确定有机体的药理反应
- 从步骤 2.7 开始，在矩阵圆顶中培育 1，000-10，000 个细胞。使用有机体形成效率和生长速度作为确定最终细胞数的代理。
注：表1中提供了推荐的单元格编号。每个分析使用每个条件三到五个复制。使用最终浓度为 70% 的基底膜基质，以减少粘度引起的移液误差。 - 种子 35 μL 的基质圆顶在 24 孔板中，让圆顶凝固，如第 3 节所示（另请参阅图 1A和步骤 2.1.2 中的电镀方法）。添加含有Rho激酶抑制剂和首选药物的培养基。此方法可应用于所有药物，但在此协议中，以 10 μM 时使用第二代抗雄激素为例。要确定半最大抑制浓度 （IC50），执行对 10 增量，并作为控制，使用药物溶解的车辆。
- 每隔两三天刷新一次介质，并在第7天分析有机物，以确定药物的药理反应。时间点可能因实验和药物的选择而异。
注：有机体不必被试穿以执行这些检测。 - 为了保持有机物完好无损，使用P1000移液器，绘制介质和移液器上下，以破坏地下室膜基质。
- 当基底膜基质完全中断时，将悬架转移到15 mL锥形管中。不要每15 mL锥形管传输超过10个矩阵圆顶。
- 在 300 x g下离心 5 分钟，从下抽出上清液，用 5 mL 的 PBS 清洗。
- 在 1 mL 的 PBS 中重新悬浮有机物，并使用三聚体和玻璃巴斯德移液器破坏有机体。
- 量化有机体片段的数量。种子5复制包含100个有机体片段，如步骤2.1.2所述。
- 执行细胞活力测定，如下第7节所述。
5. RNA从有机体分离
注：市售的柱基方法可产生良好的RNA数量和质量。为了确保良好的RNA数量，每个样品至少使用一个圆顶;但是，建议使用三个圆顶，可以在 12 孔板的单口井中播种。
- 添加 β-甲氧基甲醇 （1%）到RNA分离试剂盒中的谷胱甘肽莱沙缓冲液。
- 从含有有机物的地下室膜圆顶中抽出介质，并加入该缓冲液的750 μL。使用 P1000 移液器上下移液器。检查所有基底膜基质已溶解。
- 加入750 μL的70%乙醇，通过移液混合。随后将700μL的混合物转移到柱中，在12，000 x g下离心1分钟，然后与莱沙的余下部分重复。
- 根据制造商的说明进行乳处理和列内 DNase 处理。无RNAE水30-50μL中的Elute RNA。
- 在 OD = 260 nm 和 280 nm 处使用荧光计测量浓度，并在 -80°C 下存储，或继续下游应用。
6. 蛋白质与有机体分离
注：对于蛋白质分离，准备含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的标准RIPA缓冲液（材料表）。建议使用至少三个圆顶，可以在单个 12 口井中播种。
- 使用 P1000 移液器，从包含有机物和移液器的基底膜圆顶从细胞中抽出介质，以破坏地下室膜基质。
- 完全中断时，将悬架转移到 15 mL 锥形管中。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，用5mL的冰冷的PBS洗涤。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，在4 mL的胰蛋白酶更换中重新悬浮颗粒。消化5-10分钟，同时在37°C下摇动。
- 加入同等体积的有机物介质 + 10% FCS，以抑制胰蛋白酶的替换。在 300 x g下离心 5 分钟。
注：离心后，不应在颗粒中可见基底膜基质。 - 抽出上清液，用5mL的冰冷的PBS洗涤。使用 P1000 移液器抽出上清液，在 300 μL 的赖沙缓冲液中重新悬浮细胞颗粒，然后转移到 1.5 mL 微离心管中。
- 在冰上孵育10分钟，然后在4°C的冷却水中，每次声波2次，每次30秒。将管子放回冰上，使用标准方法进行蛋白质定量。
- 通过加入含有加载染料的硫酸钠（SDS）来变性蛋白质，并在95°C下煮5分钟。将分在-80°C或继续下游应用。
7. 用有机物进行细胞活力测定
注：可以使用市售的细胞活力测定试剂盒和光度计来评估细胞的生存能力。根据制造商的说明准备缓冲器。建议每个条件进行五次复制：一个复制，包括 24 孔板的一个孔中的一个 35 μL 基底膜基质圆顶。
- 抽出有机物培养的介质，小心保持矩阵圆顶完好无损。
- 向上和向下添加 65 μL 的 PBS 和移液器，以破坏矩阵圆顶。
- 加入100 μL的细胞活力测定试剂盒缓冲液，并通过移液重新悬浮。
- 在室温 （RT） 下孵育 10 分钟，摇动。
- 将 100 μL 的混合物转移到适合灯具仪的非半透明板，并根据制造商对电池活力测定试剂盒的说明进行读数。
8. 异种移植的有机物制备
注：有机体也适合在免疫受损的动物以及异体小鼠进行皮下移植。为了确保注射的有机物在体内是可区分的，用构成表达荧光5的有机体标记。建议使用5 x 105细胞进行每次注射2 x 106细胞的移植试验，增量为5 x 106细胞，因为移植效率因器官线而异。
- 使用 P1000 移液器向上和向下绘制介质和移液器，以破坏地下室膜基质。完全中断时，将悬架转移到 15 mL 锥形管中。在 300 x g下离心 5 分钟。
注：不要每15mL锥形管传输超过10个矩阵圆顶。 - 抽出上清液，用 5 mL 的 PBS 清洗。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，在4 mL的胰蛋白酶更换中重新悬浮颗粒。消化5-10分钟，同时在37°C下摇动。
- 加入同等体积的有机物介质 + 10% FBS，以抑制胰蛋白酶的替换。在 300 x g下离心 5 分钟。
- 抽出上清液，在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮。使用 40 μm 过滤器过滤悬架，以确保单个电池悬浮液。使用标准方法量化细胞。
- 在PBS和Rho抑制剂中分解并重新悬浮细胞，使浓度为每100μL2 x 106细胞（参见表2，了解不同浓度所需的细胞浓度和绝对细胞数）。使用相同体积的基底膜基质生成 1：1 悬架。将悬架放在冰上。
- 根据标准协议注射细胞，并使用标准方法监测异种移植物的生长8。
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Representative Results
播种效率
有机体形成能力由表型和基因型决定。野生型 （WT） 前列腺基底细胞表现出卓越的器官形成能力 （30%-40%）与发光细胞（3%）相比（图1A）组织建立后，形成能力大大提高。通常，从WT有机体衍生的25%-30%的细胞可以形成一个新的有机体（图1B）。CRISPR/Cas9介导的Pten（Pten+/+）或p53（p53+/ω）的损耗导致有机体形成能力略有增加。p53 和 Pten 的损耗进一步增加了形成能力 （图 1B）。
药理学反应
根据播种效率，在24孔板的35μL基底膜基质圆顶中进行1，000-10，000个细胞的播种。表1提供了基于有机体形成效率的建议细胞种子编号。然而，有机体增殖速度可能因基因型而异。根据增殖，可以对细胞种子数量进行其他更改。
在图2中，抗雄激素分子对生长的影响在具有不同基因型的鼠类器官中进行了测试。共有2，500个细胞从具有WT基因型、p53损耗、Pten损失或双p53和Pten损耗的鼠类有机体中播种。p53和Pten损失是由慢病毒引入的gRNA靶向p53和/或Pten位点在有机体组成表达Cas9在罗莎26启动子与C57/Bl6遗传背景9。
p53的丢失不会对抗雄性分子产生抗药性。Pten的丧失增加了对抗雄激素化合物的抵抗力，如前10所示。然而，p53和Pten的双重损失导致对第二代抗雄激素的完全抵抗（图2A）。AR抑制也改变了有机体表型。在控制Cas9+/+有机体，以及P53+/+-删除和Pten+/+有机体中，观察到有机体流明尺寸减小（图2B）。p53Ω/= Pten= /=有机物在表风未受影响（图2B）。根据这些结果，当1 x 106细胞在侧翼下分皮移植时，只有p53ω/= Pten= /=有机体生长（图2C）。总体而言，这些结果表明，p53ω/= Pten= /=共删除导致对鼠类中第二代抗雄激素的抗药性。
患者衍生的PCa类物在表型和基因型11、12中是异质的;因此，对药物的反应在人类PCa有机体线之间可能有很大差异。在图3中，显示了两种截然不同的人体PCa类化合物MSKPCA2和MSKPCA3的抗雄性分子反应。MSKPCA2有机物的增殖受到抗雄激素分子的强烈抑制，而MSKPCA3有机体则不受影响（图3A，B）。MSKCPCA2有机体表示高浓度的AR和AR靶向FKBP5，他们表示标志性的发光蛋白，如CK8和CK18。相反，MSKPCA3有机体也表示基底（CK5）和中位体（维门丁）标记，并且没有表现出FKBP5的表达。这些结果表明，这些有机体模型非发光雄激素无关的表型。
图1：测量人类和小鼠前列腺细胞的器官形成率。（A） 基底膜基质（左）和基体圆顶（右）中细胞再悬浮的原理概述。（B） 相对有机体形成（CD49f+）衍生基底和（CD26+）衍生的发光细胞（y轴;均值= SD），在存在1 nM DHT的情况下。共播种了200个细胞，在播种后7天对器官的数量进行了量化（n = 3，\p < 0.01，t 检验）。（C） 在存在 1 nM DHT 的情况下，相对组织形态形成鼠WT、Pten+/ω和P53°/= Pten=/=有机体 （%，y -轴;均值 = SD）。 共播种了200个细胞，在播种后7天（n = 3）对器官的数量进行了量化。p53和Pten损失由gRNA在Rosa26促进器下表达Cas9的器官中定位p53和/或Pten位点进行调解。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：评估从基因工程小鼠中提取的有机物的药理反应。（A） 2，500细胞的二元体WT、Pten+/+、P53+/+和P53+/+Pten =/=有机体（y-轴，均值= SD，通过细胞活力测定试剂盒测量）的2，500个细胞的相对细胞增殖。有机物;（n = 3，μp < 0.05， t 测试） 与 1 nM DHT 或 10 μM 的第二代抗雄激素如所示。（B） 代表WT、Pten+/+、P53+/+和P53°/+Pten+/+有机体培养物的明亮场图像，如所示，用1 nM DHT或10 μM第二代抗雄激素处理。 （C） WT、Pten+/+、P53+ /+和 P53° /= Pten=/=有机体在异源性 C57/Bl6 小鼠的侧翼中分皮下注射的代表性生长曲线。只有P53β/= Pten+ /=有机体显示生长。共注射1个x106个细胞。P53Ω/= Pten+ /=有机体的三个独立曲线显示生长速度的异质性。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：评估有机物衍生的人类前列腺癌活检的药理反应。（A） 患者衍生MSKPCA2和MSKPCA2类有机物的相对细胞增殖（y-轴，均值=SD，通过细胞活力测定试剂盒测量）5，000个细胞在器官建立后7天（n = 4，μlt;0.05，t-测试），1 nM DHT或10 μM第二代抗雄激素，如所示。（B） MSKPCA2和MSKPCA3有机体培养物的代表性亮场图像，如所示，用1 nM DHT或10 μM第二代抗雄激素进行治疗。（C） MSKPCA2和MSKPCA3有机体中AR、FKBP5（AR靶基因）、CK8和CK18（发光标记）、CK5（基体标记）和维门丁（间质标记物）的西方印斑分析。GAPDH 被用作装载控制。请点击此处查看此图的较大版本。
| 有机物播种效率（%） | 细胞播种数（每个圆顶） |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
表1：用于根据有机体形成能力评估药理反应的细胞播种数。按列表（从左到右）包括有机体形成能力范围和每个基体圆顶的种子的相应细胞数。
| 单元格总数 | PBS0+ Y-27632 | 母体体积 | 细胞浓度/注射 |
| 5 x 106 | 500 μl | 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1.5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl | 500 μl | 2 x 106 |
表2：有机物异种移植实验的推荐细胞数。从左到右的列包括 10 次注射的绝对总细胞数、10 次注射的 PBS = Y-27632 的总体积、基底膜基质体积以及每次注射的细胞数。
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Discussion
了解抗雄激素耐药性的分子机制并发现潜在的治疗弱点，需要测试模仿前列腺癌的模型系统中的药理反应。本文介绍的是一个详细的方案，用于可靠地分析患者衍生和基因工程前列腺器官中的药理反应，并制备这些有机体样品用于下游应用。
此协议中有两个关键步骤。第一是确定有机物的播种效率和生长速度。有机体生长速度差异很大。这依赖于物种，因为鼠源的有机物的生长速度比人类衍生的有机物快两倍左右。除物种外，生长速度取决于基因型和表型。然而，在确定播种效率和生长速度时，此方案可适用于所有前列腺器官类型。
第二个关键步骤是使用基于蛋白质基质的 3D 培养，为后续的下游应用做好准备。在电镀过程中，通过稀释（70%）可以避免基底膜基质粘度引起的种子变化地下室膜基质，如所述。在未过度干扰有机物的情况下正确分解聚合基质，也作了详细说明。该协议使基质的中断不会引入有机体读出物的变化，该读出可用于筛选PCa中不同遗传背景的药物库。此外，通过执行CRISPR/Cas9-或shRNA的表达干扰，可以查询具有耐药性的基因。
一个考虑点是前列腺有机体培养的介质组成会影响药理反应。例如，EGF是鼠和人前列腺器官培养的成分，大大降低了对抗雄激素的敏感性。因此，本议定书中从介质中省略了EGF，恢复了对抗雄激素的敏感性。建议确定是否有任何有机物成分影响被测药物的敏感性。这尤其适用于复杂的人类前列腺器官培养基，该介质（除EGF、Noggin、R-spondin1、DHT和A83-001[鼠类器官介质的组成]）含有成纤维细胞生长因子10（FGF10）、FGF2、前列腺素E2、烟酰胺和p38i抑制剂SB202190。
有机物介质组成有利于良性前列腺上皮的生长，而不是癌症组织，因此没有建立原发激素敏感PCa有机体线。目前，所有人类PCa有机物均来自晚期转移抗雄激素PCa患者;因此，这些生产线大多具有抗雄激素，适合识别新的治疗方法。作为概念证明，三角洲样3（DLL3）已被确定为治疗靶点，使用患者衍生的NEPC有机体，目标是与罗瓦尔皮苏马布特西林13。该方法适用于这些类型的实验，也适用于来自正常良性组织的前列腺器官、原发性前列腺癌和CTC。
前列腺器官培养的一个缺点是缺乏细胞利基。因此，不能利用当前平台研究非肿瘤细胞对耐药性的贡献。然而，结肠直肠癌和肺癌有机体与自体T细胞的共同培养物最近已经建立，使得肿瘤和免疫系统之间的相互作用研究成为可能。可以建立其他共培养系统，以进一步研究非细胞自主相互作用。
最后，本报告为前列腺器官和随后的下游应用中的药理反应的可重复评估提供了详细的方案。重要的是，该协议是广泛适用的，可用于其他器官的器官培养，包括结肠15，小肠16，胃17，18，肝脏19，胰腺20，肾脏21，和乳腺22。
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Disclosures
C.L.S 在诺华的董事会任职;是ORIC制药公司的联合创始人，也是苯甲酰胺和阿霉素的共同发明者;是阿吉奥斯、贝肯、蓝图、柱组、福格霍恩、豪斯制药、Nextech、KSQ、佩特拉和PMV的科学顾问;是Seragon的联合创始人，于2014年被基因泰克/罗切收购。W.R.K. 是有机物技术的共同发明者和专利持有人。
Acknowledgments
K.P. 由 NIH 1F32CA236126-01 提供支持。C.L.S. 由 HHMI 支持;CA193837;CA092629;CA224079;CA155169;CA008748;和斯塔尔癌症联盟W.R.K. 由荷兰癌症基金会/KWF Buit 2015-7545 和前列腺癌基金会 PCF 17YOUN10 提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
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