Summary
Представлен протокол для изучения фармакологических реакций в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды очень напоминают биологию виво и резюмировать генетику пациентов, делая их привлекательными модельных систем. Органоиды простаты могут быть установлены из дикого типа простаты, генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты.
Abstract
Здесь представлен протокол для изучения фармакодинамики, потенциала стволовых клеток и дифференциации рака в эпителиальных органоидах простаты. Органоиды простаты являются андрогенов отзывчивые, трехмерные (3D) культуры, выращенные в определенной среде, которая напоминает простатический эпителий. Органоиды простаты могут быть созданы из диких и генетически модифицированных моделей мыши, доброкачественных тканей человека, и передовых рака простаты. Важно отметить, что полученные организмом пациенты очень похожи на опухоли в генетике и биологии опухолей in vivo. Кроме того, органоиды могут быть генетически манипулировать с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA систем. Эти контролируемые генетики делают органоидную культуру привлекательной в качестве платформы для быстрого тестирования влияния генотипов и мутационных профилей на фармакологические реакции. Однако экспериментальные протоколы должны быть специально адаптированы к 3D-природе органоидных культур для получения воспроизводимых результатов. Описаны здесь подробные протоколы для выполнения посевных анализов для определения способности органоидного образования. Впоследствии, этот доклад показывает, как выполнять медикаментозное лечение и анализировать фармакологические реакции с помощью измерений жизнеспособности, изоляции белка, и изоляции РНК. Наконец, протокол описывает, как подготовить органоиды для ксенотрансплантации и последующих анализов роста in vivo с использованием подкожной прививки. Эти протоколы дают высоковоспроизводимые данные и широко применимы к системам 3D-культуры.
Introduction
Лекарственная устойчивость является одной из основных клинических проблем в лечении рака. Метастатический рак предстательной железы (PCa) лечение в первую очередь направлено на андроген-сигнальных оси. Антиандрогенная терапия нового поколения (например, энзалутамид и абиратерон) показали большой клинический успех, но практически все PCa в конечном итоге прогрессирует в направлении андрогенно-независимого состояния, или кастрации устойчивый рак предстательной железы (CRPC).
Недавнее геномное и транскриптомическое профилирование CRPC показало, что существует три общих механизма резистентности при раке предстательной железы: 1) активация мутаций, приводящих к восстановлению андрогенных рецепторов (AR), сигнализирующих1; 2) активация шунтирования сигнализации, как это можно прославить в доклинической модели для устойчивости антиандрогенной терапии следующего поколения, при которой активация глюкокортикоидного рецептора (ГР) может компенсировать потерю AR сигнализации2; и 3) недавно выявленный процесс пластичности линии, в котором опухолевые клетки приобретают устойчивость, переключая линии от типа клеток, зависимых от цели препарата, к другому типу клеток, который не зависит от этого (который, в PCa, представлен как AR-отрицательный и/или нейроэндокринное заболевание (NEPC)3,4. Однако молекулярные механизмы, вызывающие лекарственную устойчивость, не изучены. Кроме того, приобретенная устойчивость к антиандрогену может привести к терапевтической уязвимости, которую можно использовать. Поэтому важно оценить реакцию препарата в модельных системах, имитирующих фенотипы и генотипы пациентов.
Органоиды простаты являются органотипическими культурами, выращенными в 3D-белковой матрице с определенной средой. Важно отметить, что органоиды простаты могут быть установлены из доброкачественных и раковых тканей мурин или человеческого происхождения, и они сохраняют фенотипические и генотипические особенности, найденные в vivo5,6. Важно отметить, что как анти-андроген чувствительных PCa и CRPC клетки представлены в текущем компендиуме органоидов. Кроме того, органоиды простаты легко генетически манипулируют с помощью CRISPR/Cas9 и shRNA5. Таким образом, органоиды простаты являются подходящей моделью системы для тестирования лекарственных реакций и выяснений механизмов резистентности. Здесь описан подробный протокол для проведения тестирования на наркотики и анализа фармакологических реакций с использованием органов простаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся работа, описанная в этом протоколе, была выполнена с ранее установленными муринорганидами и органоидами, полученными от пациента. Все работы на животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Научно-исследовательского животного ресурсного центра Мемориального онкологического центра Слоун Кеттеринг (IACUC: 06-07-012). Все ткани, полученные из числа пациентов, были собраны в соответствии с правилами и положениями онкологического центра Memorial Sloan Kettering (IRB: 12001).
1. Средняя и буферная подготовка
- Оттепель подвалм мембранной матрицы (например, Matrigel) на 4 кв с ночь перед началом эксперимента. Держите его на льду во время использования.
- Поместите культурные тарелки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 ч до экспериментов. Это поможет подвалу мембраны матричного купола (в дальнейшем называют матричной купол) для полимеризации. Органоиды для покрытия описаны в шаге 2.1.2.
- Подготовка органоидной среды в соответствии с установленным протоколом5.
- Подготовьте органоидную среду без добавления эпидермального фактора роста (EGF; см. Таблица материалов для компонентов). EGF подавляет транскрипционный выход AR и придает устойчивость к антиандрогену5.
- Подготовка Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) с 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это средства массовой информации используется для ингибирования ферментативного пищеварения с заменой трипсина в разделах 2-4. - Подготовка лекарственных растворов в соответствии с протоколом производителя. Для enzalutamide/mdv3100 (далее называют анти-андроген второго поколения), подготовить запас раствор 100 мкм в диметил сульфодоксид (DMSO). Запас ы может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев и не должен быть свежим.
2. Изоляция, ферментативное пищеварение и создание органоидов
- Изолировать органоиды простаты из мыши или ткани человека в соответствии с ранее установленными протоколами5,7. Краткое описание приведено ниже.
- Фарш и ферментативно переваривают ткани простаты для получения одноклеточной суспензии. В этом эксперименте для переваривания 5 мг/мл коллагеназа II типа ADMEM/F12 использовалась для переваривания 50 мг ткани предстательной железы.
- Собирайте клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, подсчитайте клетки, переприостановите их в подвальной мембранной матрице, и пластине при соответствующей плотности5,7 в матричных куполах на предварительно разогретых органоидных плитах культуры (покрытие метод показан на рисунке 1A).
- Разрешить купола затвердеть и добавить средства массовой информации на вершинах куполов, так что они полностью покрыты.
- Выращивайте органоиды до нужного количества для применения ниже по течению. Номер ячейки может быть определен стандартными методами подсчета. Дополнительную информацию о плотности можно узнать в специальном разделе протокола для приложения.
- Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить. Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку 15 мл. Не размещайте более 10 куполов на одну коническую трубку 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Снимите супернатант и промойте клеточные гранулы 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин с тряской при 37 градусах Цельсия. Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS.
- Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка номера ячейки с помощью гемоцитометра или эквивалентного прибора подсчета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение жизнеспособных одиночных ячеек трудно, используйте сортировку потока для получения одноклеточного раствора.
3. Оценка способности органоидного образования
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить процент клеток, которые могут генерировать органоид, посевной анализ может быть выполнен в качестве прокси для стволовых / прародитель потенциал. Способность органоидного образования также важна для определения числа клеток для анализов жизнеспособности.
- Разбавить клеточную суспензию, полученную в шаге от 2,7 до 100 клеток на 10 л суспензии, с помощью органоидной среды, содержащей ингибитор 10 мкм рокиназы Y-27632.
- Перенесите 1100 ячеек (110 л суспензии) в новую коническую трубку.
- Добавьте 285 л мембранной матрицы и переприостановите клетки. Это приведет к концентрации матрицы в 70%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление мембранной матрицы подвала во время посева значительно уменьшает изменение размера купола, вызванное вязкостью белковой матрицы. - Семенные клетки в 35 мтричных куполах в предварительно разогретой 24 скважине, в результате чего 200 клеток/колодца. Плита 3-5 репликирует на образец (также см. метод покрытия на рисунке 1А и шаг 2.1.2).
- Чтобы убедиться, что клетки остаются в пределах матричного купола, переверните пластину и поместите ее в клеточный инкубатор, чтобы укрепить мембранную матрицу подвала.
- Через 10 минут выньте пластину из инкубатора и добавьте среду, содержащую ингибитор киназы Rho.
- Освежать среду каждые 2 дня. Через 7 дней, количественное количество органоидов. Держите ингибитор Родкиназы в средствах массовой информации на протяжении всего эксперимента.
- Подсчитайте количество органоидов, установленных на купол, и вычислите процент органоидов, образуювшихся из общего числа клеток, покрытых (200 клеток).
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидные отношения учреждения варьируются от 3%-60% в зависимости от типа клеток и генотипа.
4. Определение фармакологических реакций органоидов
- Продолжая со ступени 2.7, семена 1000-10000 клеток в матричном куполе. Используйте эффективность образования органоидов и скорость роста в качестве прокси для определения конечного номера ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые номера клеток приведены в таблице 1. Используйте от трех до пяти репликаций на условие в анализе. Используйте окончательную концентрацию 70% подвальной мембранной матрицы, чтобы уменьшить ошибки трубаций, вызванные вязкостью. - Семя 35 зл и пляскивных куполов в 24 хорошо пластины и пусть купола затвердеть, как это делается в разделе 3 (также см. метод покрытия на рисунке 1И шаг 2.1.2). Добавьте среду, содержащую ингибитор родкиназы и препарат выбора. Этот метод может быть применен ко всем препаратам, но в этом протоколе, анти-андроген второго поколения используется на 10 мкм для примера. Чтобы определить половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50), выполнить бревенчатый 10 инкрементный, и в качестве контроля, использовать транспортное средство, в котором препарат был растворен.
- Освежать среду каждые два или три дня и анализировать органоиды на 7-й день, чтобы определить фармакологическую реакцию препарата. Временные точки могут варьироваться в зависимости от выбора эксперимента и препарата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды не должны быть trypsinized для выполнения этих анализов. - Чтобы сохранить органоиды нетронутыми, используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
- Когда мембранная матрица подвала полностью нарушена, перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Снимите супернатант и промойте 5 мл PBS.
- Приостанавливай органоиды в 1 мл PBS и нарушить органоиды с помощью тритурации и стекла Пастер пипетка.
- Количества фрагментов органоидов. Семена 5 реплицируют 100 органоидных фрагментов, описанных в шаге 2.1.2.
- Выполните результаты переживаний клеток, описанные ниже в разделе 7.
5. Изоляция РНК от органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные методы на основе столбцов дают хорошее количество и качество РНК. Для обеспечения хорошего количества РНК, используйте как минимум один купол на образец; однако рекомендуется использовать три купола, которые могут быть посеяны в одном колодце из 12 хорошо пластины.
- Добавить ке-меркаптоэтанол (1%) к буферу лютатиона лиза в комплекте изоляции РНК.
- Нарисуйте среду из мембранных куполов подвала, содержащих органоиды, и добавьте 750 зл. Пипетка вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Убедитесь, что все мембраны подвала матрицы была распущена.
- Добавьте 750 л 70% этанола и перемешайте путем пипетки. Затем перенесите 700 л смеси в столбец, центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин и повторите с остатком лизата.
- Выполните моющие и на колонке DNase лечения в соответствии с инструкциями производителя. Elute РНК в 30-50 Л без РНЗа воды.
- Измерьте концентрации с помощью флюорометра при OD 260 нм и 280 нм и храните при -80 градусах по Цельсию или продолжайте использовать приложения вниз по течению.
6. Белковая изоляция от органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции белка, подготовить стандартный буфер RIPA, содержащий фосфатазы и ингибиторы протеазы (Таблица материалов). Рекомендуется использовать по крайней мере три купола, которые могут быть посеяны в одном 12 скважины.
- Используя пипетку P1000, оформить среду из клетки с подвалом мембранных куполов, содержащих органоиды и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы.
- При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FCS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постцентрифугация, не подвал мембранной матрицы должны быть видны в гранулы. - Снимите супернатант и промойте 5 мл ледяного PBS. Снимите супернатант и перенапрягия клеточные гранулы в 300 злицисном буфере с помощью пипетки P1000, а затем перенесите в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл.
- Инкубировать на льду в течение 10 мин, а затем sonicate 2x на 30 с каждый при охлажденной воде с температурой 4 градусов по Цельсию. Поместите трубку обратно на лед и выполнять количественную оценку белка с помощью стандартных методов.
- Денатурная белка путем добавления сульфата натрия додецил (SDS), содержащего погрузочный краситель и кипятить в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Храните lysates при -80 градусах по Цельсию или продолжайте работать с приложениями ниже по течению.
7. Переживание клеточной жизнеспособности с помощью органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток может быть оценена с помощью коммерчески доступного набора для оценки жизнеспособности клеток и люминометра. Подготовка буферов в соответствии с инструкциями производителя. Рекомендуется пять репликаций на одно условие: одна реплика, состоящая из одного мембранного купола мембраны 35 Л в одном колодце 24 скважины.
- Нарисуйте среду органоидной культуры, стараясь оставить матричные купола нетронутыми.
- Добавьте 65 КЛ PBS и пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить матричный купол.
- Добавьте 100 кл.л. буфера набора асссеев жизнеспособности ячейки и повторно приостановите путем пипеттинга.
- Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут с встряхиванием.
- Передача 100 л смеси на непрозрачную пластину, подходящую для светинометра, и выполняйте чтение в соответствии с инструкциями производителя для набора для асссы для системы ассеции жизнеспособности клеток.
8. Подготовка органоидов для ксенотрансвтинга
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды также поддаются для подкожной прививки как иммунных скомпрометированных животных, а также, изогенных мышей. Для обеспечения вводили органоиды различаются in vivo, этикетки органоидов с составно выражающим флюорофор5. Рекомендуется провести экспериментальный эксперимент по прививке с использованием 5 х 105 клеток до 2 х 106 клеток на инъекцию, с шагом 5 х 106 клеток, так как эффективность прививки варьируется между органоидными линиями.
- Используя пипетку P1000, составить средний и пипетка вверх и вниз, чтобы нарушить подвал мембраны матрицы. При полном нарушении перенесите подвеску на коническую трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не передавайте более 10 матричных куполов на коническую трубку 15 мл. - Нарисуйте супернатант и промыть 5 мл PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Нарисуйте супернатант и resuspend гранулы в 4 мл замены трипсина. Дайджест в течение 5-10 мин при встряхивании при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте равный объем органоидной среды и 10% FBS, чтобы ингибировать замену трипсина. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
- Нарисуйте супернатант и resuspend в 1 мл PBS. Фильтр подвески с фильтром 40 мкм для обеспечения одной подвески ячейки. Количественная оценка клеток с использованием стандартных методов.
- Спин вниз и повторной концентрации клеток в ИНГибитор PBS и Ро до концентрации 2 х 106 клеток на 100 QL (см. Таблица 2 для концентрации клеток и абсолютное число клеток, необходимых для различных концентраций). Используйте равный объем подвальной мембранной матрицы для создания 1:1 подвески. Поместите подвеску на лед.
- Вводить клетки в соответствии со стандартными протоколами и контролировать рост ксенотрансплантата с помощью стандартных методов8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность посева
Способность органоидного образования определяется фенотипом и генотипом. Базальные клетки дикого типа (WT) показали превосходную способность органоидного образования (30%-40%) по сравнению с светящимися клетками (3%) (Рисунок 1А). После органоидного установки способность к образованию резко возросла. Как правило, 25%-30% клеток, полученных из органоида WT может образовывать новыйорганоид (Рисунок 1B). CRISPR/Cas9-опосредованные потери Pten (Ptenq /)) или p53 (p53q /)) привели к незначительному увеличению мощности образования органоидов. Потеря как p53, так и Pten дополнительно увеличила мощность образования(рисунок 1B).
Фармакологический ответ
На основе эффективности посева было выполнено посев 1000-10 000 клеток в 35 злител мембранной матричной купола в 24 скважинах. Рекомендуемые номера посева клеток на основе эффективности образования органоидов предусмотрены в таблице 1. Однако, скорость распространения органоидов может сильно отличаться в зависимости от генотипа. Дополнительные изменения в номер елочного посева могут быть сделаны на основе пролиферации.
На рисунке 2влияние антиандрогенных молекул на рост были протестированы в мурин органоидов с различными генотипами. В общей сложности 2500 клеток были посеяны из мурин органоидов с генотипом WT, потеря p53, Pten потери, или двойной p53 и Pten потери. p53 и Pten потеря была инициирована лентивирного введения gRNA ориентации p53 и / или Pten локус в органоидов, составляющих Cas9 под контролем промоутера Rosa26 с C57/Bl6 генетический фон9.
Потеря p53 не вызвала резистентности к антиандрогенным молекулам. Потеря Птена повышенной устойчивостью к антиандрогенным соединениям, как показано ранее10. Двойная потеря p53 и Pten, однако, привела к полной устойчивости к антиандрогену второго поколения(рисунок 2A). ИНгибирование АР также изменило фенотипы органоидов. В управлении Cas9 - органоидов, а также P53/'-удаленныеи Pten/ органоиды, снижение размера проема органоида наблюдалось ( Рисунок 2B). p53/ Птен /- органоиды были фенотипически незатронутыми(Рисунок 2B). В соответствии с этими результатами, когда 1 х 106 клеток были привиты подкожно на фланге, только p53/ Pten/ органоиды выросли (Рисунок 2C). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что p53/Pten //-совместное удаление приводит к резистентности к антиандрогену второго поколения в мурин органоидов.
Органоиды PCa, полученные из пациента, неоднородны в фенотипе и генотипе11,12; поэтому, реакции к снадобьям могут отличать больш между людскими линиями pCa органоидными. На рисунке 3показана антиандрогенная реакция молекул двух различных органов PCa, MSKPCA2 и MSKPCA3. Распространение органов MSKPCA2 сильно подавлялось антиандрогенными молекулами, в то время как органоиды MSKPCA3 оставались без изменений(рисунок 3A,B). Органоиды MSKCPCA2 выражали высокий уровень AR и AR-целевой FKBP5, и они выражали отличительные черты светящихся белков, таких как CK8 и CK18. В отличие от этого, органоиды MSKPCA3 также выразили базальные (CK5) и мезенхимальные (Vimentin) маркеры и не показали выражение FKBP5. Эти результаты свидетельствуют о том, что эти органоиды модели несветящиеся андроген-независимый фенотип.
Рисунок 1: Измерение показателей органоидного образования клеток простаты человека и мыши. (A) Схематический обзор повторной подвески клеток в подвальной мембранной матрице (слева) и органоидном посеве в матричных куполах (справа). (B) Относительное органоидное образование человека (CD49f) полученных базальных и (CD26) полученных светящихся клеток (%, y-оси; среднее SD) в присутствии 1 нМ DHT. В общей сложности 200 клеток были посеяны и количество органоидов было количественно 7 дней после посева (n No 3, Зп злт; 0,01, t-тест). (C) Относительное органоидное образование мурина WT, Pten q/, P53q /q, и P53/Pten /) органоидов (%, y-оси; среднее SD) в присутствии 1 нМ DHT. В общей сложности 200 клеток были посеяны и количество органоидов было количественно 7 дней после посева (n No 3). p53 и Pten потеря была опосредована gRNA ориентации p53 и / или Pten локус в органоидов, выражающих Cas9 constitutively под промоутер Rosa26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка фармакологического ответа органоидов, полученных из генетически модифицированных мышей. (A) Относительная пролиферация клеток мурина WT, Ptenq /,, P53q /,и P53/ Pten/ органоиды ( y-оси, среднее SD, измеряется набором анализа жизнеспособности клетки 7 дней после установления органоиды; (n No 3, зрп злт; 0,05, t-test) с 1 нМ DHT или 10 мкм антиандрогена второго поколения, как указано. (B) Представитель яркие изображения WT, Pten/ q, P53 / /,и P53/ / /органоидных культур, обработанных с 1 нМ DHT или 10 ММ второго поколения анти-андрогенов, как указано. (C) Представитель кривой роста WT, Ptenq /,P53q /,, и P53/Pten /) органоиды вводили подкожно на фланге изогенных C57/Bl6 мышей. Только P53/Pten /- органоиды показали рост. В общей сложности 1 х 106 клеток были введены. Показано, что три независимые кривые P53/Pten /' organoids демонстрируют неоднородность в скорости роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Оценка фармакологической реакции органоидов, полученных биопсией рака простаты человека. (A) Относительная пролиферация клеток органов MSKPCA2 и MSKPCA2(y-axis,среднее SD, измеренная набором анализа жизнеспособности клеток) 5000 клеток 7 дней после установки органоидов (n No 4, p qlt; 0.05, t-test) с 1 нМ DHT или 10 мкм второго поколения анти-андрогенов, как указано. (B) Представитель ярко-поля изображения MSKPCA2 и MSKPCA3 органоидов культур лечение с 1 нМ DHT или 10 ММ второго поколения анти-андрогенов, как указано. (C) Западный анализ помарка AR, FKBP5 (AR-цель гена), CK8 и CK18 (светящиеся маркеры), CK5 (базальный маркер), и Vimentin (мезенхимальный маркер) в MSKPCA2 и MSKPCA3 органоидов. GAPDH использовался в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Эффективность посева органоидов (%) | Номер посева клеток (на купол) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Таблица 1: Цифры посева клеток, используемые для оценки фармакологического ответа на основе способности органоидного образования. Таблица за колонкой (слева направо) включает в себя диапазоны мощностей органоидного образования и соответствующее количество клеток к семени на матричную купол.
| Общее число ячеек | ПБС0 Y-27632 | Матригель объем | концентрация клеток / инъекция |
| 5 x 106 | 500 л | 500 л | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 л | 500 л | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 л | 500 л | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 л | 500 л | 2 x 106 |
Таблица 2: Рекомендуемые номера клеток для экспериментов по ксенотрансплантации органоидов. Колонки слева направо включают абсолютное общее число клеток для 10 инъекций, общий объем PBS Y-27632 для 10 инъекций, объем матрицы мембраны подвала, и номер клетки на инъекцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе устойчивости к антиандрогену, и обнаружение потенциальных терапевтических уязвимостей требует тестирования фармакологических реакций в модельных системах, имитирующих рак простаты. Описано здесь подробный протокол для надежного анализа фармакологических реакций в пациента полученных и генетически модифицированных органов простаты и подготовки этих органоидных образцов для применения вниз по течению.
В этом протоколе есть два важных шага. Во-первых, определение эффективности посева и темпов роста органоидов. Скорость роста органоидов сильно варьируется. Это зависит от видов, так как мурин производные органоиды растут примерно в два раза быстрее, чем человеческие органоиды. Помимо видов, скорость роста зависит от генотипа и фенотипа. Однако, когда эффективность посева и скорость роста определяются, этот протокол может быть адаптирован ко всем типам органов простаты.
Вторым важным шагом является работа с 3D-культурой на основе белковой матрицы для подготовки к последующим приложениям вниз по течению. Введение вариации посева по вязкости мембранной матрицы подвала во время покрытия можно избежать с помощью разбавленного (70%) подвал мембраны матрицы, как описано. Правильно ероты полимеризированной матрицы без чрезмерного нарушения органоидов также описаны в деталях. Этот протокол позволяет нарушение матрицы без введения изменения в органоидссчите, которые могут быть адаптированы для скрининга библиотек наркотиков для различных генетических фонов в PCa. Кроме того, выполняя CRISPR/Cas9- или shRNA основе экспрессии вмешательства, гены, придающие лекарственной устойчивости могут быть запрошены.
Смысл рассмотрения заключается в том, что средний состав органоидной культуры простаты может влиять на фармакологический ответ. Например, EGF, компонент как мурин, так и органоидной культуры простаты человека, значительно снижает чувствительность к антиандрогену. Таким образом, EGF опущен в этом протоколе из среды, и чувствительность к антиандрогену восстанавливается. Рекомендуется определить, если какие-либо органоидные ингредиенты влияют на чувствительность препарата тестируется. Это особенно верно для сложной среды органоидной культуры простаты человека, которая (кроме EGF, Noggin, R-spondin1, DHT и A83-001 (состав мурин органоидной среды) содержит фактор роста фибробластов 10 (FGF10), FGF2, простагландин E2, никотинамид и ингибитор p38i SB202190.
Органоидный средний состав способствует росту доброкачественного эпителия простаты над раковой тканью, таким образом, не было установлено первичных гормонов PCa органоидных линий. В настоящее время все человеческие органоиды PCa получены от пациентов с развитой метастатической устойчивостью к антиандрогену PCa; следовательно, большинство из этих линий являются анти-андрогенов устойчивостью и подходит для выявления новых методов лечения. В качестве доказательства концепции, дельта-как 3 (DLL3) была определена в качестве терапевтической цели с использованием пациента полученных органов NEPC, которые являются целевыми с rovalpituzumab тезирин13. Этот метод подходит для этих типов экспериментов, а также подходит для органов простаты из нормальной доброкачественной ткани, первичного рака простаты, и CTCs.
Одним из недостатков органоидной культуры простаты является отсутствие клеточной ниши. Таким образом, вклад в лекарственную устойчивость неопухолевых клеток не может быть изучен с помощью текущей платформы. Тем не менее, сокультуры колоректального рака и органов рака легких с аутологичной Т-клеток недавно были созданы, что позволяет исследования взаимодействий между опухолью и иммунной системой14. Для дальнейшего изучения неклеточных автономных взаимодействий могут быть созданы другие системы совместной культуры.
В заключение, этот доклад содержит подробный протокол для воспроизводимой оценки фармакологических реакций в органоидах простаты и последующих применениях вниз по течению. Важно отметить, что этот протокол широко применим и может быть использован для органоидных культур других органов, в том числе толстой кишки15,тонкой кишки16, желудка17,18, печени19, поджелудочной железы20, почки21, и молочной железы22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.L.S входит в совет директоров Novartis; является соучредителем компании ORIC Pharmaceuticals и соучредителем энзалутамид и апалутамида; является научным консультантом Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, КСЗ, Петра и PMV; и является соучредителем компании Seragon, приобретенной Genentech/Roche в 2014 году. W.R.K. является коизобретателем и патентообладателем органоидной технологии.
Acknowledgments
K.P. поддерживается NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. поддерживается HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; и Консорциум рака Старра. W.R.K. поддерживается Голландским онкологическим фондом/KWF Buit 2015-7545 и Фондом рака предстательной железы PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
