Presentert her er en protokoll for å studere farmakologiske responser i prostata epitel organoids. Organoids ligner i vivo biologi og recapitulate pasienten genetikk, noe som gjør dem attraktive modellsystemer. Prostata organoids kan etableres fra wildtype prostates, genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft.
Presentert her er en protokoll for å studere farmakodynamikk, stilk cellen potensial, og kreft differensiering i prostata epitel organoids. Prostata organoids er androgen responsive, tredimensjonale (3D) kulturer dyrket i et definert medium som ligner på prostata epitel. Prostata organoids kan etableres fra vill-type og genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft. Viktigere, pasient avledet organoids ligner svulster i genetikk og in vivo tumor biologi. Videre kan organoids bli genetisk manipulert ved hjelp av CRISPR/Cas9 og shRNA systemer. Disse kontrollerte genetikk gjør organoid kulturen attraktiv som en plattform for raskt å teste effekten av genotyper og mutational profiler på farmakologiske responser. Imidlertid må eksperimentelle protokoller være spesielt tilpasset 3D natur organoid kulturer å få reproduserbar resultater. Beskrevet her er detaljerte protokoller for å utføre seeding analyser for å bestemme organoid formasjon kapasitet. Deretter viser denne rapporten hvordan du utfører medikament behandling og analyserer farmakologisk respons via levedyktighet målinger, protein isolasjon, og RNA isolasjon. Til slutt beskriver protokollen hvordan man skal forberede organoids for xenografting og påfølgende in vivo vekst analyser ved hjelp av subkutan pode. Disse protokollene gir svært reproduserbar data og er allment anvendelig for 3D-kultur systemer.
Drug motstand er en av de store kliniske problemer i kreft behandling. Metastatisk prostata kreft (PCa) behandling er primært rettet mot androgen-signalering aksen. Neste generasjons anti-androgen behandling (f. eks, enzalutamid og abirateron) har vist stor klinisk suksess, men nesten alle PCa etter hvert utvikler seg mot en androgen-uavhengig stat, eller kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC).
Aktuelle genomisk og transcriptomic profilering av CRPC avslørt er det tre generelle mekanismer for resistens i prostata kreft: 1) aktivering mutasjoner resulterer i restaurering av androgen reseptor (AR) signalering1; 2) aktivering av bypass signalering, som illustrert i en pre-klinisk modell for neste generasjons anti-androgen terapi motstand der aktivering av glukokortikoid reseptor (GR) kan kompensere for tap av AR signalering2; og 3) den nylig identifiserte prosessen med avstamning plastisitet, der tumorceller erverve motstand ved å bytte linjene fra en celle type avhengig av stoffet målet til en annen celle type som ikke er avhengig av dette (som i PCa, er representert som AR-negative og/eller Nevroendokrine sykdom [NEPC])3,4. Men den molekylære mekanismer som forårsaker resistens er ikke forstått. Videre ervervet anti-androgen motstand kan føre til terapeutiske sårbarheter som kan utnyttes. Derfor er det viktig å evaluere narkotika responser i modellsystemer som etterligner pasientens fenotyper og genotyper.
Prostata organoids er organotypic kulturer dyrket i en 3D protein matrise med et definert medium. Viktigere, prostata organoids kan etableres fra godartet og kreft vev av murine eller menneskelig opprinnelse, og de beholder fenotypiske og genotypisk funksjoner funnet i vivo5,6. Viktigere, både anti-androgen sensitive PCa og CRPC celler er representert i dagens samling av organoids. Videre prostata organoids er lett genetisk manipulert bruker CRISPR/Cas9 og shRNA5. Dermed prostata organoids er et passende modell system for testing narkotika responser og Elucidating motstand mekanismer. Her er en detaljert protokoll beskrevet for å utføre narkotika testing og analysere farmakologiske reaksjoner ved hjelp av prostata organoids.
Forstå molekylære mekanismer underliggende anti-androgen motstand og oppdage potensielle terapeutiske sårbarheter krever testing av farmakologiske reaksjoner i modellsystemer etterligne prostatakreft. Beskrevet her er en detaljert protokoll for pålitelig analyse av farmakologiske reaksjoner i pasient-avledet og genetisk konstruert prostata organoids og utarbeidelse av disse organoid prøvene for nedstrøms applikasjoner.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å beste…
The authors have nothing to disclose.
K.P. er støttet av NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. støttes av HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; og Starr Cancer Consortium. W.R.K. støttes av nederlandske Cancer Foundation/KWF BUIT 2015-7545 og prostata Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |