Summary

Prostata Organoid kulturer som verktøy for å oversette genotyper og mutational profiler til farmakologiske reaksjoner

Published: October 24, 2019
doi:

Summary

Presentert her er en protokoll for å studere farmakologiske responser i prostata epitel organoids. Organoids ligner i vivo biologi og recapitulate pasienten genetikk, noe som gjør dem attraktive modellsystemer. Prostata organoids kan etableres fra wildtype prostates, genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft.

Abstract

Presentert her er en protokoll for å studere farmakodynamikk, stilk cellen potensial, og kreft differensiering i prostata epitel organoids. Prostata organoids er androgen responsive, tredimensjonale (3D) kulturer dyrket i et definert medium som ligner på prostata epitel. Prostata organoids kan etableres fra vill-type og genetisk konstruert mus modeller, godartet menneskelig vev, og avansert prostatakreft. Viktigere, pasient avledet organoids ligner svulster i genetikk og in vivo tumor biologi. Videre kan organoids bli genetisk manipulert ved hjelp av CRISPR/Cas9 og shRNA systemer. Disse kontrollerte genetikk gjør organoid kulturen attraktiv som en plattform for raskt å teste effekten av genotyper og mutational profiler på farmakologiske responser. Imidlertid må eksperimentelle protokoller være spesielt tilpasset 3D natur organoid kulturer å få reproduserbar resultater. Beskrevet her er detaljerte protokoller for å utføre seeding analyser for å bestemme organoid formasjon kapasitet. Deretter viser denne rapporten hvordan du utfører medikament behandling og analyserer farmakologisk respons via levedyktighet målinger, protein isolasjon, og RNA isolasjon. Til slutt beskriver protokollen hvordan man skal forberede organoids for xenografting og påfølgende in vivo vekst analyser ved hjelp av subkutan pode. Disse protokollene gir svært reproduserbar data og er allment anvendelig for 3D-kultur systemer.

Introduction

Drug motstand er en av de store kliniske problemer i kreft behandling. Metastatisk prostata kreft (PCa) behandling er primært rettet mot androgen-signalering aksen. Neste generasjons anti-androgen behandling (f. eks, enzalutamid og abirateron) har vist stor klinisk suksess, men nesten alle PCa etter hvert utvikler seg mot en androgen-uavhengig stat, eller kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC).

Aktuelle genomisk og transcriptomic profilering av CRPC avslørt er det tre generelle mekanismer for resistens i prostata kreft: 1) aktivering mutasjoner resulterer i restaurering av androgen reseptor (AR) signalering1; 2) aktivering av bypass signalering, som illustrert i en pre-klinisk modell for neste generasjons anti-androgen terapi motstand der aktivering av glukokortikoid reseptor (GR) kan kompensere for tap av AR signalering2; og 3) den nylig identifiserte prosessen med avstamning plastisitet, der tumorceller erverve motstand ved å bytte linjene fra en celle type avhengig av stoffet målet til en annen celle type som ikke er avhengig av dette (som i PCa, er representert som AR-negative og/eller Nevroendokrine sykdom [NEPC])3,4. Men den molekylære mekanismer som forårsaker resistens er ikke forstått. Videre ervervet anti-androgen motstand kan føre til terapeutiske sårbarheter som kan utnyttes. Derfor er det viktig å evaluere narkotika responser i modellsystemer som etterligner pasientens fenotyper og genotyper.

Prostata organoids er organotypic kulturer dyrket i en 3D protein matrise med et definert medium. Viktigere, prostata organoids kan etableres fra godartet og kreft vev av murine eller menneskelig opprinnelse, og de beholder fenotypiske og genotypisk funksjoner funnet i vivo5,6. Viktigere, både anti-androgen sensitive PCa og CRPC celler er representert i dagens samling av organoids. Videre prostata organoids er lett genetisk manipulert bruker CRISPR/Cas9 og shRNA5. Dermed prostata organoids er et passende modell system for testing narkotika responser og Elucidating motstand mekanismer. Her er en detaljert protokoll beskrevet for å utføre narkotika testing og analysere farmakologiske reaksjoner ved hjelp av prostata organoids.

Protocol

Alt arbeid som er beskrevet i denne protokollen er utført med tidligere etablerte murine organoids og pasient-avledet organoids. Alle dyr arbeidet ble utført i samsvar med retningslinjene for Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Alle pasient-avledet vev ble samlet i samsvar med regler og forskrifter av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001). 1. middels og buffer forberedelse Tine matrise for kjeller membran (f.ek…

Representative Results

Seeding effektivitetOrganoid formasjon kapasitet bestemmes av fenotype og genotype. Wild-type (WT) prostata basal celler viste overlegen organoid formasjon kapasitet (30%-40%) sammenlignet med luminal celler (3%) (Figur 1A). Etter organoid etablering, økte dannelsen kapasiteten drastisk. Vanligvis kan 25%-30% av celler avledet fra en WT organoid danne en ny organoid (figur 1B</strong…

Discussion

Forstå molekylære mekanismer underliggende anti-androgen motstand og oppdage potensielle terapeutiske sårbarheter krever testing av farmakologiske reaksjoner i modellsystemer etterligne prostatakreft. Beskrevet her er en detaljert protokoll for pålitelig analyse av farmakologiske reaksjoner i pasient-avledet og genetisk konstruert prostata organoids og utarbeidelse av disse organoid prøvene for nedstrøms applikasjoner.

Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å beste…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

K.P. er støttet av NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. støttes av HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; og Starr Cancer Consortium. W.R.K. støttes av nederlandske Cancer Foundation/KWF BUIT 2015-7545 og prostata Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

Materials

A83-01 Tocris 2939 Organoid medium component: Final concentration 200 nM
ADMEM/F12 Gibco/Life technologies 12634028 Organoid medium component
B27 Gibco/Life technologies 17504-044 Organoid medium component
Cell culture plates Fisher 657185
Cell Titer Glo Promega G7571
DHT Sigma-Aldrich D-073 Organoid medium component: Final Concentration 1 nM
DMSO Fisher BP231-100
EGF Peprotech 315-09 Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human
FGF10 Peprotech 100-26 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml
FGF2 Peprotech 100-18B Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml
Glutamax Gibco/Life technologies 35050079 Organoid medium component
HEPES MADE IN-HOUSE N/A Organoid medium component: Final concentration 10 mM
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) Corning CB-40230C Organoid medium component
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165 Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM
NOGGIN Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) 120-10C Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml
Penicillin/Streptavidin Gemini Bio-Products 400-109 Organoid medium component
Phospatase inhibitors Merck Millipore 524629
Prostaglandin E2 Tocris 3632464
Protease Inhibitors Merck Millipore 539131
R-SPONDIN Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) 120-38 Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml
RIPA buffer Merck 20-188
RNA-easy minikit Qiagen 74104
SB202190 Sigma-Aldrich 152121-30-7 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM
TryplE ThermoFisher 12605036
Y-27632 Selleckchem S1049 Organoid medium component: Final Concentration 10 μM

References

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Play Video

Cite This Article
Pappas, K. J., Choi, D., Sawyers, C. L., Karthaus, W. R. Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses. J. Vis. Exp. (152), e60346, doi:10.3791/60346 (2019).

View Video