Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques
Summary
Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.
Abstract
Présenté ici est un protocole pour étudier la pharmacodynamique, le potentiel de cellules souches, et la différenciation de cancer dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes de prostate sont des cultures réactives d’androgène, tridimensionnelles (3D) cultivées dans un milieu défini qui ressemble à l’épithélium prostatique. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des modèles sauvages-type et génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé. Fait important, les organoïdes dérivés du patient ressemblent étroitement aux tumeurs en génétique et en biologie tumorale in vivo. En outre, les organoïdes peuvent être manipulés génétiquement à l’aide de systèmes CRISPR/Cas9 et shRNA. Ces génétiques contrôlées rendent la culture organoïde attrayante en tant que plate-forme pour tester rapidement les effets des génotypes et des profils mutationnels sur les réponses pharmacologiques. Cependant, les protocoles expérimentaux doivent être spécifiquement adaptés à la nature 3D des cultures organoïdes pour obtenir des résultats reproductibles. Décrits ici sont des protocoles détaillés pour effectuer des essais d’ensemencement pour déterminer la capacité de formation d’organoïdes. Par la suite, ce rapport montre comment effectuer des traitements médicamenteux et analyser la réponse pharmacologique par des mesures de viabilité, l’isolement des protéines et l’isolement de l’ARN. Enfin, le protocole décrit comment préparer des organoïdes pour le xénogreffe et les essais de croissance in vivo subséquents utilisant la greffe sous-cutanée. Ces protocoles produisent des données hautement reproductibles et sont largement applicables aux systèmes de culture 3D.
Introduction
La résistance aux médicaments est l’un des principaux problèmes cliniques dans le traitement du cancer. Le traitement du cancer de la prostate métastatique (PCa) est principalement dirigé vers l’axe de signalisation des androgènes. Les thérapies antiandrogènes de prochaine génération (par exemple, enzalutamide et abiraterone) ont montré le grand succès clinique, mais pratiquement tous les PCa progressent par-même vers un état androgène-indépendant, ou cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC).
Le profilage génomique et transcriptomique récent du CRPC a indiqué qu’il y a trois mécanismes généraux de résistance dans le cancer de la prostate : 1) activant des mutations ayant pour résultat la restauration du récepteur d’androgène (AR) signalant1; 2) activation de la signalisation de pontage, comme illustré dans un modèle préclinique pour la résistance de thérapie anti-androgène de prochaine génération dans laquelle l’activation du récepteur de glucocorticoid (GR) peut compenser la perte de signalisation d’AR2; et 3) le processus récemment identifié de plasticité de lignée, dans lequel les cellules de tumeur acquièrent la résistance en changeant des lignées d’un type de cellule dépendant de la cible de drogue à un autre type de cellule qui n’est pas dépendant de ceci (qui, dans PCa, est représenté en tant que AR-négatif et/ou maladie neuroendocrine [NEPC])3,4. Cependant, les mécanismes moléculaires qui causent la résistance aux médicaments ne sont pas compris. En outre, la résistance anti-androgène acquise peut mener aux vulnérabilités thérapeutiques qui peuvent être exploitées. Par conséquent, il est essentiel d’évaluer les réponses des médicaments dans les systèmes modèles qui imitent les phénotypes et les génotypes des patients.
Les organoïdes de la prostate sont des cultures organotypiques cultivées dans une matrice de protéines 3D avec un milieu défini. Fait important, les organoïdes de la prostate peuvent être établis à partir de tissus bénins et cancéreux d’origine murine ou humaine, et ils conservent des caractéristiques phénotypiques et génotypiques trouvées in vivo5,6. Fait important, les cellules sensibles aux anti-androgènes PCa et CRPC sont représentées dans le recueil actuel des organoïdes. En outre, les organoïdes de prostate sont facilement génétiquement manipulés utilisant CRISPR/Cas9 et shRNA5. Ainsi, les organoïdes de prostate sont un système modèle approprié pour tester des réponses de drogue et élucider des mécanismes de résistance. Ici, un protocole détaillé est décrit pour effectuer des essais de drogue et analyser des réponses pharmacologiques utilisant des organoïdes de prostate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance aux antiandrogènes et découvrir les vulnérabilités thérapeutiques potentielles nécessite de tester des réponses pharmacologiques dans des systèmes modèles imitant le cancer de la prostate. Décrit ici est un protocole détaillé pour l’analyse fiable des réponses pharmacologiques dans les organoïdes de prostate patients-dérivés et génétiquement modifiés et la préparation de ces échantillons d’organoïdes pour des applications en ava…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.P. est soutenu par NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. est soutenu par HHMI; CA193837; Ca092629; CA224079; CA155169; CA008748; et Starr Cancer Consortium. W.R.K. est soutenu par La Fondation néerlandaise contre le cancer/KWF Buit 2015-7545 et la Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
Materials
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
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