Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Résumé

Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.

Résumé

Présenté ici est un protocole pour étudier la pharmacodynamique, le potentiel de cellules souches, et la différenciation de cancer dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes de prostate sont des cultures réactives d'androgène, tridimensionnelles (3D) cultivées dans un milieu défini qui ressemble à l'épithélium prostatique. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des modèles sauvages-type et génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé. Fait important, les organoïdes dérivés du patient ressemblent étroitement aux tumeurs en génétique et en biologie tumorale in vivo. En outre, les organoïdes peuvent être manipulés génétiquement à l'aide de systèmes CRISPR/Cas9 et shRNA. Ces génétiques contrôlées rendent la culture organoïde attrayante en tant que plate-forme pour tester rapidement les effets des génotypes et des profils mutationnels sur les réponses pharmacologiques. Cependant, les protocoles expérimentaux doivent être spécifiquement adaptés à la nature 3D des cultures organoïdes pour obtenir des résultats reproductibles. Décrits ici sont des protocoles détaillés pour effectuer des essais d'ensemencement pour déterminer la capacité de formation d'organoïdes. Par la suite, ce rapport montre comment effectuer des traitements médicamenteux et analyser la réponse pharmacologique par des mesures de viabilité, l'isolement des protéines et l'isolement de l'ARN. Enfin, le protocole décrit comment préparer des organoïdes pour le xénogreffe et les essais de croissance in vivo subséquents utilisant la greffe sous-cutanée. Ces protocoles produisent des données hautement reproductibles et sont largement applicables aux systèmes de culture 3D.

Introduction

La résistance aux médicaments est l'un des principaux problèmes cliniques dans le traitement du cancer. Le traitement du cancer de la prostate métastatique (PCa) est principalement dirigé vers l'axe de signalisation des androgènes. Les thérapies antiandrogènes de prochaine génération (par exemple, enzalutamide et abiraterone) ont montré le grand succès clinique, mais pratiquement tous les PCa progressent par-même vers un état androgène-indépendant, ou cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC).

Le profilage génomique et transcriptomique récent du CRPC a indiqué qu'il y a trois mécanismes généraux de résistance dans le cancer de ....

Protocole

Tous les travaux décrits dans ce protocole ont été exécutés avec des organoïdes murines précédemment établis et des organoïdes patient-dérivés. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux lignes directrices du Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Tous les tissus dérivés du patient ont été recueillis conformément aux règles et règlements du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB : 12001).

1. Préparation moyenne et tampon

1. Décongeler la matrice de membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel) à 4 oC pendant la nuit avant de commencer l'expérience. Gardez-l....

Résultats

Efficacité de l'ensemencement
La capacité de formation d'organoïdes est déterminée par phénotype et génotype. Les cellules basales de la prostate de type sauvage (WT) ont montré une capacité de formation organoïde supérieure (30 %-40 %) par rapport aux cellules lumineuses (3%) (Figure 1A). Après l'établissement d'organoïdes, la capacité de formation a augmenté radicalement. En règle générale, 25 % à 30 % des cellules dériv.......

Discussion

Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance aux antiandrogènes et découvrir les vulnérabilités thérapeutiques potentielles nécessite de tester des réponses pharmacologiques dans des systèmes modèles imitant le cancer de la prostate. Décrit ici est un protocole détaillé pour l'analyse fiable des réponses pharmacologiques dans les organoïdes de prostate patients-dérivés et génétiquement modifiés et la préparation de ces échantillons d'organoïdes pour des applications en aval.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A83-01	Tocris	2939	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 200 nM
ADMEM/F12	Gibco/Life technologies	12634028	Composant du milieu organoïde
B27	Gibco/Life technologies	17504-044	Composant du milieu organoïde
Plaques de culture cellulaire	Fisher	657185
Titre cellulaire Glo	Promega	G7571
DHT	Sigma-Aldrich	D-073	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1 nM
DMSO	Fisher	BP231-100
EGF	Peprotech	315-09	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 50 ng/ml pour la souris, 5 ng/nl pour l’homme
FGF10	Peprotech	100-26	Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 ng/ ml
FGF2	Peprotech	100-18B	Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 5 ng/ml
Glutamax	Gibco/Life technologies	35050079	Composant du milieu organoïde
HEPES	FABRIQUÉ EN INTERNE	N/A	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 10 mM
Matrigel (facteur de croissance réduit & Sans rouge de phénol)	Corning	CB-40230C	Composant du milieu organoïde
N-Acétylcystéine	Sigma-Aldrich	A9165	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1,25 mM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 mM
NOGGIN	Peprotech ou cellules 293t transfectées stables avec construction Noggin (Karthaus et al. 2014)	120-10C	Composant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 100 ng/ml
Pénicilline/Streptavidine	Gemini Bio-Products	400-109	Composant du milieu organoïde
Inhibiteurs de la phospatase	Merck Millipore	524629
Prostaglandine E2	Tocris	3632464
Inhibiteurs de protéase	Merck Millipore	539131
R-SPONDIN	Cellules 293t transfectées par Peprotech ou stables avec construction R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)	120-38	Composant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 500 ng/ml
Tampon RIPA	Merck	20-188
Minikit RNA-easy	Qiagen	74104
SB202190	Sigma-Aldrich	152121-30-7	Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 &mu ; M
TryplE	ThermoFisher	12605036
Y-27632	Selleckchem	S1049	Composant du milieu organoïde : Concentration finale 10 &mu ; L