Summary
المقدمة هنا هو بروتوكول لدراسة الاستجابات الدوائية في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. العضوية تشبه بشكل وثيق في علم الاحياء الحيوي وتلخيص علم الوراثة المريض ، مما يجعلها نظم نموذج جذابة. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من البروستات البرية ، ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة.
Abstract
المعروض هنا هو بروتوكول لدراسة دوائي ، والخلايا الجذعية المحتملة ، والتمايز السرطان في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. البروستاتا العضوي هي الاندروجين استجابه ، ثلاثية الابعاد (3D) الثقافات المزروعة في المتوسطة المحددة التي تشبه ظهاره البروستاتا. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من النوع البري ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة. الأهم من ذلك ، المريض العضوي المشتقة يشبه بشكل وثيق الأورام في علم الوراثة والبيولوجيا الورم الجسم الحيوي. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون التلاعب العضوي وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 ونظم شرانا. هذه الوراثة الخاضعة للرقابة تجعل الثقافة العضوية جذابة كمنصة للاختبار السريع لأثار الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية علي الاستجابات الدوائية. ومع ذلك ، يجب ان تتكيف البروتوكولات التجريبية علي وجه التحديد مع الطبيعة ثلاثية الابعاد للثقافات العضوية للحصول علي نتائج قابله للتكرار. الموصوفة هنا هي بروتوكولات مفصله لأداء اختبارات البذر لتحديد قدره تشكيل العضوية. وفي وقت لاحق ، يظهر هذا التقرير كيفيه اجراء العلاجات الدوائية وتحليل الاستجابة الصيدلانية عن طريق قياسات القدرة علي البقاء ، وعزل البروتين ، وعزل الجيش النيبالي الريبي. وأخيرا ، يصف البروتوكول كيفيه تحضير العضو العضوي لتطعيم الجسم وبعد ذلك في اختبارات النمو المجرية باستخدام التطعيم تحت الجلد. وتسفر هذه البروتوكولات عن بيانات عاليه الاستنساخ وتنطبق علي نطاق واسع علي نظم الثقافة ثلاثية الابعاد.
Introduction
مقاومه المخدرات هي واحده من المشاكل السريرية الرئيسية في علاج السرطان. ويوجه العلاج سرطان البروستاتا المنتشر (PCa) في المقام الأول علي محور الإشارات الاندروجين. الجيل التالي من العلاجات المضادة للالاندروجين (علي سبيل المثال ، enzalutamide و abiraterone) وقد أظهرت نجاحا كبيرا السريرية ، ولكن تقريبا جميع الانيسول الخماسي الكلور في نهاية المطاف تتقدم نحو دوله مستقله الاندروجين ، أو التطهير البروستات المقاوم للسرطان (CRPC).
كشفت الجينوم الحديثة والتنميط الناسخ من CRPC هناك ثلاث أليات عامه للمقاومة في سرطان البروستاتا: 1) تنشيط الطفرات الناتجة عن استعاده مستقبلات الاندروجين (AR) يشير1; 2) تفعيل الإشارات التفافيه ، كما هو مثال في نموذج ما قبل السريرية للجيل القادم المضادة للمقاومة الاندروجين المقاومة التي تنشيط مستقبلات جلوكورتيكويد (GR) يمكن ان تعوض عن فقدان الإشارات AR2؛ و 3) العملية التي تم التعرف عليها مؤخرا من اللدونة السلالة ، التي الخلايا السرطانية الحصول علي المقاومة عن طريق تحويل السلالات من نوع الخلية تعتمد علي الهدف المخدرات إلى نوع آخر من الخلايا التي لا تعتمد علي هذا (والتي ، في الانيسول الخماسي الكلور ، ويتم تمثيل السلبية و/أو مرض الغدد الصماء العصبية [nepc])3،4. ومع ذلك ، فان أليات الجزيئية التي تسبب مقاومه المخدرات ليست مفهومه. وعلاوة علي ذلك, المقاومة المكتسبة الاندروجين المضادة قد يؤدي إلى نقاط الضعف العلاجية التي يمكن استغلالها. ولذلك ، من الضروري تقييم الاستجابات الدوائية في النظم النموذجية التي تحاكي الأنماط الظاهرية للمرضي والأنماط الجينية.
البروستاتا العضوي هي ثقافات التنميط العضوي المزروعة في مصفوفة بروتين ثلاثي الابعاد مع متوسط محدد. الأهم من ذلك ، يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من الانسجه الحميدة والسرطانية من murine أو الأصل البشري ، وانها تحتفظ السمات الظاهرية والجينية الميزات الموجودة في فيفو5،6. الأهم من ذلك ، يتم تمثيل كل من الخلايا الحساسة المضادة للالاندروجين و CRPC في الخلاصة الحالية للارغيدات. وعلاوة علي ذلك ، يتم التلاعب العضوي البروستاتا بسهوله وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 و شرينا5. وهكذا ، organoids البروستاتا هي نظام نموذجي مناسب لاختبار الاستجابات المخدرات وتوضيح أليات المقاومة. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لاجراء اختبار المخدرات وتحليل الاستجابات الدوائية باستخدام organoids البروستاتا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم القيام بجميع الاعمال الموصوفة في هذا البروتوكول مع الهيكل العضوي المنشا سابقا والعضوية المشتقة من المريض. تم تنفيذ جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث مركز الموارد الحيوانية من النصب التذكاري سلون كيتيرنج مركز السرطان (IACUC: 06-07-012). تم جمع جميع الانسجه المستمدة من المرضي وفقا للقواعد والانظمه الخاصة بمركز السرطان التذكاري سلون كيتيرنج (الهجرة: 12001).
1. الاعداد المتوسطة والعازلة
- ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي (علي سبيل المثال ، الحاكم) في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها قبل بدء التجربة. يبقيه علي الجليد اثناء الاستخدام.
- وضع لوحات الثقافة في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة قبل التجارب. وهذا سوف يساعد علي قبة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (يشار اليها فيما بعد بالقبة المصفوفة) لتتبلمر. ويوصف الطلاء العضوي في الخطوة 2-1-2.
- اعداد المتوسطة organoid وفقا للبروتوكول المعمول به5.
- اعداد المتوسطة organoid دون أضافه عامل نمو البشرة (EGF ؛ انظر جدول المواد للمكونات). EGF يقمع الإنتاج العابر لل AR ويضفي مقاومه ضد الاندروجين5.
- جهزوا النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بمصل بقري جنيني بنسبه 10%.
ملاحظه: يتم استخدام هذه الوسائط لمنع الهضم الانزيمي مع استبدال التريبسين في الأقسام 2-4. - اعداد حلول المخدرات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ل enzalutamide/mdv3100 (يشار اليها فيما بعد باسم الجيل الثاني المضادة للالاندروجين) ، واعداد حل الأسهم من 100 μM في ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO). يمكن تخزين المخزون في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أشهر وليس من الضرورة ان تكون طازجه.
2. العزلة ، والهضم الانزيمي ، وإنشاء الهيكل العضوي
- عزل البروستاتا العضوي من الماوس أو الانسجه البشرية وفقا للبروتوكولات التي سبق إنشاؤها5،7. ويرد أدناه وصف موجز لذلك.
- المفروم والانزيمي هضم انسجه البروستاتا لإنتاج تعليق خليه واحده. في هذه التجربة ، تم استخدام 1 مل من 5 ملغ/مل كولاجيناز النوع الثاني في ADMEM/F12 لهضم 50 ملغ من انسجه البروستاتا.
- جمع الخلايا عن طريق طرد في 300 x ز ل 5 دقيقه ، عد الخلايا ، وأعاده التعليق عليها في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، ولوحه في كثافة المناسبة5،7 في القباب مصفوفة علي لوحات الثقافة العضوية قبل حرارة (الطلاء يتم عرض الأسلوب في الشكل 1ا).
- السماح لقباب لترسيخ وأضافه وسائل الاعلام علي قمم القباب بحيث يتم تغطيتها بالبالكامل.
- تنمو organoids إلى الكمية المطلوبة للتطبيقات المصب. يمكن تحديد رقم الخلية بواسطة أساليب العد القياسية. راجع المقطع الخاص بالتطبيق الخاص بالبروتوكول للحصول علي تفاصيل اضافيه حول الكثافة.
- باستخدام ماصه P1000 ، ارسم المتوسطة والماصة للأعلى وللاسفل لتعطيلها. عندما يتم تعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي تماما ، نقل تعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لا تضع أكثر من 10 القباب لكل واحد 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وغسل بيليه الخلية مع 5 مل من تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه مع اهتزاز في 37 درجه مئوية. أضف كميه متساوية من المتوسط العضوي + 10% لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وأعاده التعليق في 1 مل من تلفزيوني.
- تصفيه التعليق مع فلتر 40 μm لضمان تعليق خليه واحده. تحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الكريات الدموية أو جهاز العد المكافئ.
ملاحظه: إذا كان الحصول علي خلايا واحده قابله للحياة من الصعب استخدام الفرز تدفق للحصول علي حل خليه واحده.
3. تقييم قدره التشكيل العضوي
ملاحظه: لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي يمكن ان تولد organoid ، يمكن اجراء فحص بذر كوكيل لإمكانات الجذعية/السلف. وتعتبر قدره التشكيل العضوي مهمة أيضا لتحديد رقم الخلية البذر لاختبارات الجدوى.
- تمييع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.7 إلى 100 خلايا لكل 10 μL من التعليق باستخدام المتوسطة organoid التي تحتوي علي 10 μM رو كيناز المثبط Y-27632.
- نقل 1,100 الخلايا (110 μL من تعليق) إلى أنبوب مخروطي جديد.
- أضافه 285 μL من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وأعاده تعليق الخلايا. وهذا سوف يؤدي إلى ~ 70 ٪ تركيز مصفوفة.
ملاحظه: التخفيف من مصفوفة غشاء الطابق السفلي اثناء البذر يقلل إلى حد كبير من الاختلاف في حجم القبه ، الناجمة عن اللزوجة من مصفوفة البروتين. - خلايا البذور في 35 μL من القباب مصفوفة في درجه حرارة 24 جيدا لوحه ، مما ادي إلى 200 الخلايا/جيدا. لوحه 3-5 نسخ متماثلة لكل عينه (انظر أيضا طريقه الطلاء في الشكل 1ا والخطوة 2-1-2).
- لضمان بقاء الخلايا داخل قبة المصفوفة ، اقلب الصفيحة ووضعها في حاضنه الخلايا لترسيخ مصفوفة غشاء القبو.
- بعد 10 دقيقه ، وأزاله لوحه من الحاضنة وأضافه المتوسطة التي تحتوي علي المثبط رو كيناز.
- تحديث المتوسطة كل يومين. بعد 7 أيام ، وقياس عدد من العضوية. الحفاظ علي مثبطات رو كيناز في وسائل الاعلام في جميع انحاء التجربة.
- عد عدد من العضوية التي أنشئت في القبه وحساب النسبة المئوية من العضوية التي تشكلت من العدد الإجمالي للخلايا مطلي (200 خلايا).
ملاحظه: تختلف نسب التاسيس العضوي من 3%-60% اعتمادا علي نوع الخلية والنمط الجيني.
4. تحديد الاستجابات الدوائية من organoids
- الاستمرار من الخطوة 2.7 ، البذور 1000-10000 الخلايا في قبة مصفوفة. استخدام كفاءه تشكيل organoid وسرعه النمو كوكيل لتحديد رقم الخلية النهائية.
ملاحظه: يتم توفير أرقام الخلايا الموصي بها في الجدول 1. استخدم ثلاثه إلى خمس نسخ متماثلة لكل حاله لكل تحليل. استخدام التركيز النهائي من 70 ٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي للحد من الأخطاء التي تسببها اللزوجة. - البذور 35 μL من القباب مصفوفة في لوحه 24 جيدا والسماح لقباب يصلب كمافعلت في القسم 3 (انظر أيضا طريقه الطلاء في الشكل 1ا والخطوة 2-1-2). أضافه المتوسطة التي تحتوي علي المثبط رو كيناز والمخدرات المفضلة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة علي جميع الادويه ، ولكن في هذا البروتوكول ، ويستخدم الجيل الثاني لمكافحه الاندروجين في 10 μM علي سبيل المثال. لتحديد نصف تركيز المثبطة القصوى (IC50), تنفيذ log10 تزايدي, وكعنصر تحكم, استخدام السيارة التي تم حل المخدرات.
- تحديث المتوسطة كل يومين أو ثلاثه أيام وتحليل organoids في اليوم 7 لتحديد الاستجابة الدوائية للدواء. قد تختلف النقاط الزمنيه بين اختيار التجربة والمخدرات.
ملاحظه: لا يجب ان تكون الorganoids لاجراء هذه الاختبارات. - للحفاظ علي الهيكل العضوي سليما ، وذلك باستخدام ماصه P1000 ، ورسم المتوسطة وماصه صعودا وهبوطا لتعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
- عندما يتم تعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لا نقل أكثر من 10 القباب مصفوفة لكل 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- الطرد المركزي في 300 x ز لمده 5 دقائق. رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من تلفزيوني.
- أعاده التعليق العضوي في 1 مل من تلفزيوني وتعطيل العضوية باستخدام تريلوريشن وماصه الزجاج باستور.
- قياس عدد الأجزاء العضوية. البذور 5 ونسخ متماثلة تحتوي علي 100 أجزاء organoid كما هو موضح في الخطوة 2-1-2.
- اجراء فحص جدوى الخلية علي النحو المبين أدناه في القسم 7.
5. الحمض الريبي النيبالي العزلة من organoids
ملاحظه: الأساليب المتاحة تجاريا المستندة إلى العمود الغلة كميه جيده ونوعيه الحمض الريبي النيبالي. لضمان كميه جيده RNA ، استخدم الحد الأدنى من قبة واحده لكل عينه ؛ ومع ذلك ، ينصح باستخدام ثلاث قباب ، والتي يمكن المصنفة في بئر واحده من 12 لوحه جيدا.
- أضافه [يس-مركبتوايثانول] (1%) إلى الجلوتاثيون تحلل العازلة في مجموعه العزل RNA.
- رسم قباله المتوسطة من القباب غشاء الطابق السفلي التي تحتوي علي organoids وأضافه 750 μL من هذا المخزن المؤقت. ماصه للأعلى وللاسفل باستخدام ماصه P1000. تاكد من ان كل مصفوفة غشاء القبو قد تم حلها
- أضافه 750 μL من 70 ٪ الايثانول وتخلط عن طريق التنضيد. نقل في وقت لاحق 700 μL من الخليط إلى العمود ، الطرد المركزي في 12,000 x ز لمده دقيقه واحده ، وتكرار مع ما تبقي من lysate.
- اجراء يغسل وعلي العمود العلاج DNase وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute RNA في 30-50 μL من المياه RNAse خاليه.
- قياس التركيزات باستخدام فلوميتر في OD = 260 نانومتر و 280 نانومتر وتخزين في-80 درجه مئوية أو الاستمرار في التطبيقات المصب.
6. عزل البروتين من organoids
ملاحظه: لعزل البروتين ، واعداد العازلة ريبا القياسية التي تحتوي علي مثبطات الفوسفاتيز والانزيم البروتيني (جدول المواد). ويوصي باستخدام ما لا يقل عن ثلاث قباب ، والتي يمكن المصنفة في واحده 12 جيدا.
- باستخدام ماصه P1000 ، ارسم الوسط من الخلية مع قباب الغشاء السفلي التي تحتوي علي الهيكل العضوي والماصة للأعلى والأسفل لتعطيل مصفوفة غشاء القبو.
- عندما تتعطل تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه في حين تهتز في 37 درجه مئوية.
- أضافه حجم متساو من المتوسطة organoid + 10 ٪ FCS لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
ملاحظه: ما بعد طرد ، لا يجب ان تكون مصفوفة غشاء القبو مرئية في بيليه. - رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة. رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 300 μl من المخزن المؤقت تحلل باستخدام pipet P1000 ، ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
- احتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه وبعد ذلك سوكاتي 2x ل 30 ثانيه كل في المياه المبردة مع درجه حرارة 4 درجه مئوية. وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد واجراء كميات البروتين باستخدام الأساليب القياسية.
- البروتين عن طريق أضافه كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) التي تحتوي علي صبغ التحميل ويغلي لمده 5 دقائق في 95 درجه مئوية. تخزين لست] في-80 درجه مئوية أو متابعه التطبيقات المتلقية للمعلومات.
7. فحص سلامه الخلايا مع العضوية
ملاحظه: يمكن تقييم قابليه الخلية للبقاء باستخدام مجموعه الفحص المتاحة تجاريا ومقياس الاناره. اعداد المخازن المؤقتة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ويوصي بخمس نسخ متماثلة لكل حاله: واحد النسخ المتماثل يتكون من 1 35 μL الطابق السفلي غشاء قبة مصفوفة في بئر واحده من لوحه 24 جيدا.
- رسم قباله الوسط من الثقافة العضوية ، وتوخي الحذر لترك القباب مصفوفة سليمه.
- أضافه 65 μL من الاذاعه التلفزيونية وماصه صعودا وهبوطا لتعطيل قبة المصفوفة.
- أضافه 100 μL من الخلية المخزن المؤقت مجموعه الفحص السلامة وأعاده التعليق عن طريق التنضيد.
- احتضان في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 10 دقيقه مع الاهتزاز.
- نقل 100 μL من الخليط إلى لوحه غير شفافة مناسبه لمقياس الاناره وأداء القراءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لفحص سلامه الخلية عده.
8. تحضير العضو العضوي لتطعيم الدهون
ملاحظه: Organoids هي أيضا قابله لتطعيم تحت الجلد في كل من الكائنات المناعية المعرضة للخطر ، وكذلك ، الفئران ايروني. لضمان ان تكون العضوية المحقونة مميزه في الجسم العضوي ، والتسمية العضوية مع التعبير الدستوري عن فلوكوفيري5. فمن المستحسن اجراء تجربه تجريبية لتطعيم باستخدام 5 × 105 خلايا إلى 2 × 106 خلايا لكل حقنه ، مع زيادات من 5 x 106 خلايا ، وكفاءه التطعيم يختلف بين خطوط organoid.
- باستخدام ماصه P1000 ، ارسم المتوسط والماصة للأعلى وللاسفل لتعطيل مصفوفة غشاء القبو. عندما تتعطل تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
ملاحظه: لا تقم بنقل أكثر من 10 قباب مصفوفة لكل أنبوب مخروطي 15 مل. - رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه في حين تهتز في 37 درجه مئوية.
- أضف حجما متساويا من المتوسط العضوي + 10% لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
- رسم قباله ماده طافي وأعاده التعليق في 1 مل من تلفزيوني. تصفيه التعليق مع فلتر 40 μm لضمان تعليق خليه واحده. قياس الخلايا باستخدام الأساليب القياسية.
- تدور وأعاده تعليق الخلايا في المثبطات التلفزيونية + رو إلى تركيز 2 × 106 خلايا لكل 100 μl (انظر الجدول 2 للخلايا تركيزات ورقم الخلية المطلقة اللازمة لتركيزات متفاوتة). استخدام كميه متساوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتوليد تعليق 1:1. ضع التعليق علي الثلج.
- حقن الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية ورصد نمو الطعم باستخدام الأساليب القياسية8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كفاءه البذر
يتم تحديد القدرة علي تشكيل organoid من النمط الظاهري والنمط الجيني. البرية من نوع (WT) وأظهرت الخلايا القاعدية البروستاتا متفوقة تكوين العضوية القدرة (30 ٪-40 ٪) مقارنه بخلايا الاناره (3%) (الشكل 1ا). بعد التاسيس العضوي ، زادت قدره التشكيل بشكل جذري. عاده ، 25 ٪-30 ٪ من الخلايا المستمدة من organoid WT يمكن ان تشكل organoid جديده (الشكل 1ب). وأديت الخسارة الناجمة عن الكاس 9 بالوساطة (PtenΔ/Δ) أو الp53 (p53Δ/Δ) إلى زيادة طفيفه في قدره التشكيل العضوي. وقد زاد فقدان كل من p53 و Pten من قدره التشكيل (الشكل 1ب).
الاستجابة الدوائية
استنادا إلى كفاءه البذر ، والبذر من 1000-10000 الخلايا في 35 μL من قبة مصفوفة غشاء الطابق السفلي في لوحه 24 جيدا تم تنفيذها. وترد في الجدول 1أرقام الخلايا الموصي بها استنادا إلى كفاءه التشكيل العضوي. ومع ذلك ، يمكن ان تختلف سرعات الانتشار organoid إلى حد كبير اعتمادا علي النمط الجيني. ويمكن اجراء تغييرات اضافيه علي رقم بذر الخلايا استنادا إلى الانتشار.
في الشكل 2، تم اختبار اثار الجزيئات المضادة لاندروجيني علي النمو في الأرغن العضوي مع الأنماط الجينية المختلفة. وقد تم بذر ما مجموعه 2,500 خليه من الخلايا العضوية التي تحتوي علي النمط الجيني لل WT ، أو فقدان p53 ، أو فقدان Pten ، أو p53 مزدوجة وفقدان Pten. p53 و Pten الخسارة كانت قد بدات من قبل لينتيفيرال إدخال gRNA استهداف p53 و/أو pten الموضع في organoids التعبير دستوريا كاس 9 تحت سيطرة المروج Rosa26 مع C57/Bl6 الخلفية الوراثية9.
فقدان p53 لم يسبب مقاومه لجزيئات المضادة لاندروجيني. فقدان Pten زيادة المقاومة لمركب المضادة اندروجيني ، كما هو مبين سابقا10. الخسارة المزدوجة من p53 و Pten ، ومع ذلك ، أسفرت عن مقاومه كامله للجيل الثاني مكافحه الاندروجين (الشكل 2ا). كما غير تثبيط الظواهر الظاهرية العضوية. في السيطرةكاس 9 +/+ organoids ، فضلا عن P53Δ/Δ-حذف و ptenΔ/Δ organoids ، لوحظ انخفاض في حجم التجويف العضوي (الشكل 2ب). وكانت p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids غير متاثره ظاهريا (الشكل 2ب). وتماشيا مع هذه النتائج ، عندما تم الجلد 1 × 106 خلايا في الجناح ، فقط p53Δ/Δ ptenΔ/Δ Organoids نمت (الشكل 2ج). عموما, هذه النتائج تثبت ان p53Δ/Δ PtenΔ/Δ المشاركة في الحذف النتائج في مقاومه للجيل الثاني المضادة للالاندروجين في الأرغن العضوي murine.
المشتقات العضوية PCa المستمدة من المريض غير متجانسة في النمط الظاهري والنمط الجيني11,12; التالي ، يمكن ان تختلف الاستجابات للادويه اختلافا كبيرا بين الخطوط العضوية للانيسول الخماسي الكلور. في الشكل 3، يتم عرض استجابه جزيئات المضادة لاندروجيني من اثنين من الأحماض العضوية البشرية المميزة PCA ، MSKPCA2 و MSKPCA3. وقد منعت بشده انتشار MSKPCA2 العضوية من قبل جزيئات المضادة لاندروجيني ، في حين بقيت MSKPCA3 العضوي غير متاثر (الشكل 3ا ، ب). وقد عبرت MSKCPCA2 organoids عن مستويات عاليه من AR والFKBP5 المستهدفة ، وأعربوا عن السمات المميزة للبروتينات المضيءه مثل CK8 و CK18. وعلي النقيض من ذلك ، أعربت MSKPCA3 organoids أيضا القاعدية (CK5) وعلامات (فيمننتين) وأظهرت اي تعبير عن FKBP5. وتشير هذه النتائج إلى ان هذه النماذج العضوية نموذج الظاهري غير التلالؤ الاندروجين مستقله.
الشكل 1: قياس معدلات التشكيل العضوي لخلايا البروستاتا البشرية والفاره. (ا) نظره عامه تخطيطيه لأعاده تعليق الخلية في مصفوفة غشاء القبو (يسار) والبذر العضوي في قباب مصفوفة (يمين). (ب) التكوين العضوي النسبي للخلايا القاعدية المشتقة من الإنسان (CD49f +) والمشتقة (CD26 +) المستمدة (% ، محور y ؛ متوسط ± SD) في وجود 1 نانومتر DHT. وقد تم بذر ما مجموعه 200 خليه وتم تحديد عدد الخلايا العضوية بمقدار 7 أيام بعد البذر (ن = 3 ، * * * p < 0.01 ، t-اختبار). (ج) التشكيل العضوي النسبي لل murine WT, ptenΔ/Δ, P53Δ/Δ, و P53 Δ/Δ ptenΔ/Δ organoid (%, محور y; متوسط ± SD) في وجود 1 نانومتر DHT. وقد تم بذر ما مجموعه 200 خليه وتم تحديد عدد الخلايا العضوية بمقدار 7 أيام بعد البذر (ن = 3). p53 و pten خسارة كان توسطت ب ال [غرنا] استهداف من ال [p53] [و/ور] [تين] موضع في [ارغنويدس] يبدي كاس 9 دستوريا تحت Rosa26 مروج. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم الاستجابة الدوائية للعضيات المشتقة من الفئران المهندسة وراثيا. (ا) تكاثر الخلايا النسبية لل MURINE WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, و P53 Δ/Δ ptenΔ/Δ ORGANOIDS (y-المحور, يعني ± SD, يقاس بواسطة الخلية فحص الجدوى عده) من خلايا 2,500 7 أيام بعد إنشاء الهيكل العضوي. (ن = 3, * p < 0.05, t-اختبار) مع 1 نانومتر DHT أو 10 μM من الجيل الثاني انتيالاندروجين كما هو مبين. (ب) الصور التمثيلية لل WT ، PtenΔ/Δ، P53Δ/Δ، و P53 Δ/Δ ptenΔ/Δ الثقافات organoid تعامل مع 1 نانومتر DHT أو 10 μM الجيل الثاني المضادة للاندروجين كما هو مبين. (ج) منحني النمو التمثيلي لل WT ، PtenΔ/Δ، P53Δ/Δ، و P53 Δ/Δ ptenΔ/Δ organoids التي تحقن جلد في الجناح من الفئران الC57ه/الBl6ه القيحية. فقط P53Δ/Δ PtenΔ/Δ وأظهرت النمو العضوي. وتم حقن ما مجموعه 1 x 106 خلايا. تظهر ثلاثه منحنيات مستقله من P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoids لإظهار التباين في سرعه النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم الاستجابة الدوائية لخزعات سرطان البروستاتا البشرية المشتقة من الغدد اللحمية. (ا) تكاثر الخلايا النسبية لMSKPCA2 المستمدة من المرضي و MSKPCA2 العضوي (y-المحور ، يعني ± SD ، تقاس بواسطة الخلية اختبار القدرة علي البقاء) من الخلايا 5,000 7 أيام بعد إنشاء العضوية (ن = 4 ، * p < 0.05 ، t-اختبار) مع 1 نانومتر DHT أو 10 μM الجيل الثاني مكافحه الاندروجين كما هو مبين. (ب) الصور التمثيلية الساطعة لMSKPCA2 و MSKPCA3 الثقافات العضوية المعالجة مع 1 نانومتر DHT أو 10 μM الجيل الثاني المضادة للاندروجين كما هو مبين. (ج) تحليل لطخه الغربية من AR ، FKBP5 (ar-الهدف الجينات) ، CK8 و CK18 (علامات الاناره) ، CK5 (علامة القاعدية) ، وفيمننتين (العلامة المسمارية) في MSKPCA2 و MSKPCA3 organoids. وقد استخدمت المجموعة كعنصر تحكم في التحميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| كفاءه البذر العضوي (٪) | رقم الخلية البذر (لكل قبة) |
| 1-10 في المائة | 100000 |
| 10-20 في المائة | 5000 |
| 20-60 في المائة | 2500 |
| 60-100 في المائة | 1000 |
الجدول 1: أرقام بذر الخلايا المستخدمة لتقييم الاستجابة الدوائية استنادا إلى قدره التشكيل العضوي. يتضمن الجدول حسب العمود (من اليسار إلى اليمين) نطاقات القدرة علي تكوين التشكيل العضوي وعدد الخلايا المطابق للبذور لكل قبة مصفوفة.
| إجمالي عدد الخلايا | PBS0 + Y-27632 | حجم الحاكم | تركيز الخلية/حقن |
| 5 x 106 | 500 ميكرولتر | 500 ميكرولتر | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 ميكرولتر | 500 ميكرولتر | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 ميكرولتر | 500 ميكرولتر | 1.5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 ميكرولتر | 500 ميكرولتر | 2 x 106 |
الجدول 2: أرقام الخلايا الموصي بها لتجارب التطعيم العضوي. وتشمل الاعمده من اليسار إلى اليمين رقم الخلية الكلي المطلق لمده 10 حقن ، والحجم الإجمالي لل تلفزيوني + 27632 ل 10 الحقن ، وحجم مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، ورقم الخلية لكل حقنه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم أليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومه الاندروجين المضادة واكتشاف الثغرات العلاجية المحتملة يتطلب اختبار الاستجابات الدوائية في أنظمه نموذجيه محاكاة سرطان البروستاتا. وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتحليل موثوق بها من الاستجابات الدوائية في البروستاتا المستمدة من المريض والمهندسة وراثيا واعداد هذه العينات organoids للتطبيقات المصب.
وهناك خطوتان حاسما الاهميه في هذا البروتوكول. الأول هو تحديد كفاءه البذر ومعدل النمو من العضوي. تختلف سرعه النمو organoid بشكل كبير. وهذا يعتمد علي الأنواع ، كما ينمو الهيكل العضوي المشتق من المريدين بشكل أسرع من الهيكل العضوي المشتق من الإنسان. والي جانب الأنواع ، تعتمد سرعه النمو علي النمط الجيني والنمط الظاهري. ومع ذلك ، عندما يتم تحديد البذر الكفاءة وسرعه النمو ، ويمكن تكييف هذا البروتوكول لجميع أنواع organoid البروستاتا.
الخطوة الحاسمة الثانية هي العمل مع الثقافة القائمة علي مصفوفة البروتين 3D للتحضير للتطبيقات اللاحقة المصب. ويمكن تجنب إدخال الاختلاف البذر بواسطة اللزوجة من مصفوفة غشاء الطابق السفلي اثناء الطلاء باستخدام المخفف (70 ٪) مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، كما هو موصوف. بشكل صحيح كسر بلمره مصفوفة دون إزعاج مفرط ويوصف أيضا بالتفصيل. ويمكن هذا البروتوكول من تعطيل المصفوفة دون إدخال تباين في القراءات العضوية التي يمكن تكييفها لفحص مكتبات المخدرات لخلفيات جينيه مختلفه في الانيسول الخماسي الكلور. وعلاوة علي ذلك ، من خلال أداء CRISPR/كاس 9-أو التدخل التعبير القائم علي شرينا ، يمكن الاستفسار عن الجينات التي تمنح مقاومه المخدرات.
وهناك نقطه الاعتبار ان التكوين المتوسط للثقافة organoid البروستاتا يمكن ان تؤثر علي الاستجابة الدوائية. علي سبيل المثال ، EGF ، وهو مكون من كل من الثقافة العضوية البروستاتا والبروستات الإنسان ، يقلل كثيرا من الحساسية لمكافحه الاندروجين. التالي ، يتم حذف EGF في هذا البروتوكول من الوسط ، واستعاده الحساسية لمكافحه الاندروجين. ينصح بتحديد ما إذا كان اي من المكونات العضوية تؤثر علي حساسية الدواء الذي يتم اختباره. هذا ينطبق بشكل خاص علي الإنسان المعقدة البروستاتا الثقافة الوسيطة المتوسطة ، والتي (وبصرف الفضل عن EGF ، نوجين ، spondin1 ، DHT ، و A83 [تكوين murine المتوسطة organoid]) يحتوي علي عامل نمو الخلايا الليفية 10 (FGF10) ، FGF2 ، بروستاغلارين E2 ، نيكوتيناميد ، ومثبط p38i SB202190.
التركيبة المتوسطة العضوية تفضل نمو ظهاره البروستاتا حميده علي الانسجه السرطانية ، التالي لم يتم تاسيس الهرمونات الاوليه الحساسة الانيسول الخماسي الكلور خطوط العضوي. وفي الوقت الحالي ، تستمد جميع العضويات العضوية من الانيسول الخماسي الكلور من المرضي الذين يعانون من الانيسول الخماسي الكلور المقاوم لمقاومه الاندروجين المتقدمة ؛ التالي ، فان معظم هذه الخطوط هي مكافحه الاندروجين مقاومه ومناسبه لتحديد العلاجات الجديدة. كدليل علي المفهوم ، وقد تم تحديد دلتا مثل 3 (DLL3) كهدف علاجي باستخدام المرضي المشتقة NEPC organoids التي يتم استهدافها مع rovalpituzumab tesirine13. هذا الأسلوب هو مناسبه لهذه الأنواع من التجارب وهو أيضا مناسبه لالارغيدات البروستاتا من الانسجه الحميدة العادية ، وسرطان البروستاتا الاوليه ، و CTCs.
أحد أوجه القصور في الثقافة العضوية البروستاتا هو عدم وجود مكانه الخلوية. التالي ، لا يمكن دراسة المساهمات في مقاومه الادويه من قبل الخلايا غير السرطانية باستخدام المنصة الحالية. ومع ذلك ، تم مؤخرا إنشاء الثقافات المشتركة لسرطان القولون والمستقيم وسرطان الرئة العضوي مع خلايا T الذاتية ، وتمكين الدراسات من التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي14. ويمكن إنشاء نظم أخرى للثقافة المشتركة لمواصله دراسة التفاعلات غير المستقلة بالخلايا.
وفي الختام ، يقدم هذا التقرير بروتوكولا مفصلا للتقييم القابل للتكرار للاستجابات الدوائية في البروستاتا العضوي والتطبيقات اللاحقة للمصب. الأهم من ذلك ، هذا البروتوكول ينطبق علي نطاق واسع ويمكن استخدامها للثقافات organoid من الاجهزه الأخرى ، بما في ذلك القولون15، الأمعاء الصغيرة16 ، المعدة17،18، الكبد19، البنكرياس20، الكلي21، والغدة الثديية22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعمل في مجلس أداره شركه نوفارتس. هو المؤسس المشارك للمستحضرات الصيدلانية والمخترع المساعد ل enzalutamide و apalutamide. هو مستشار العلوم إلى اجيوس ، Beigene ، مخطط ، مجموعه العمود ، Foghorn ، منزل فارما ، Nextech ، KSQ ، البتراء ، و PMV ؛ وهو مؤسس المشارك Seragon ، التي تم شراؤها من قبل Genentech/Roche في 2014. W.R.K. هو المخترع المشارك وصاحب براءات الاختراع من التكنولوجيا organoid.
Acknowledgments
ويدعم ك من قبل المعاهد القومية للصحة 1F32CA236126-01. C.L.S. التي تدعمها المذكرة ؛ CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; وستار السرطان كونسورتيوم. W.R.K. معتمد من قبل مؤسسه السرطان الهولندية/KWF Buit 2015-7545 ومؤسسه سرطان البروستاتا PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
