מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד תגובות תרופתי ב אפיתל הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים דומה מאוד בביולוגיה vivo וגנטיקה של החולה המטופל, מה שהופך אותם מערכות מודל אטרקטיבי. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מתוך prostates מודלים העכבר מהונדסים גנטית, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם.
מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור פרמקודינמיקה, תא גזע פוטנציאל, סרטן בידול הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים הערמונית הם אנדרוגן תגובה, תלת מימדי (3D) תרבויות גדל במדיום מוגדר הדומה אפיתל הערמונית. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מסוג פראי ומהונדסים גנטית מודלים העכבר, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם. חשוב מכך, המטופל נגזר אורגנואידים הדומה לגידולים בגנטיקה ובביולוגיה גידול vivo. יתר על כן, אורגנואידים יכול להיות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין מערכות. אלה גנטיקה מבוקרת להפוך את התרבות אורגאיד אטרקטיבי כפלטפורמה בדיקות במהירות את ההשפעות של גנוטיפים ופרופילי מוסיקה על תגובות תרופתי. עם זאת, פרוטוקולים ניסיוניים חייב להיות מותאם במיוחד לטבע תלת-ממדי של תרבויות אורגנואיד כדי להשיג תוצאות הניתנות לאחזור. המתואר כאן הם פרוטוקולים מפורטים לביצוע זריעת שאומר לקבוע קיבולת היווצרות אורגאיד. לאחר מכן, דו ח זה מראה כיצד לבצע טיפולי סמים ולנתח את התגובה הפרמקולוגית באמצעות מדידות כדאיות, בידוד חלבונים ובידוד RNA. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד להכין אורגנואידים עבור השתלה של שתלה לאחר מכן בעקבות צמיחה vivo באמצעות השתלה תת עורית. פרוטוקולים אלה מניבים נתונים מאוד מתוכחלים ומתאימים באופן נרחב למערכות התרבות התלת-ממדית.
התנגדות לסמים היא אחת הבעיות הקליניות הגדולות בטיפול בסרטן. סרטן הערמונית גרורתי (PCa) הטיפול מופנה בעיקר על ציר האנדרוגן-איתות. הדור הבא נגד אנדרוגן טיפולים (למשל, enzalutamide ו abiraterone) הראו הצלחה קלינית גדולה, אבל כמעט כל PCa בסופו של דבר מתקדם לקראת המדינה אנדרוגן עצמאי, או סרטן הערמונית עמידים בפני סירוס (CRPC).
לאחרונה גנומית ופרופיל transcript של CRPC חשף יש שלושה מנגנונים כלליים של התנגדות בסרטן הערמונית: 1) הפעלת מוטציות וכתוצאה מכך שחזור של קולטן האנדרוגן (AR) איתות1; 2) הפעלה של מעקף איתות, כפי שניתן לדוגמה במודל טרום קליני עבור הדור הבא אנטי אנדרוגן התנגדות טיפול שבו הפעלה של קולטן glucocorticoid (GR) יכול לפצות על אובדן AR איתות2; ו 3) את התהליך שזוהה לאחרונה של הפלסטיות היוחסין, שבו תאי הגידול לרכוש התנגדות על ידי מיתוג שלינים מסוג תא תלוי ביעד התרופה לסוג תא אחר שאינו תלוי בפעולה זו (אשר, ב-PCa, מיוצגת כ-AR-שלילי ו/או מחלה נוירואנדוקריניים [nepc])3,4. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הגורמים להתנגדות לסמים אינם מובנים. יתרה מזאת, ההתנגדות הנרכש נגד אנדרוגן עלולה להוביל לפגיעויות טיפוליות שניתן לנצל. לכן, זה חיוני כדי להעריך את התגובות הסמים במערכות מודל לחקות פנוטיפים המטופל, גנוטיפים.
אורגנואידים של הערמונית הם תרבויות אורגאוטימית שגדלו במטריצת חלבון תלת ממדית עם מדיום מוגדר. חשוב מכך, אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מרקמת שפירים סרטניים של מוריין או מוצא אנושי, והם שומרים על תכונות פנוטימית ו-גמישות פנוטיפית נמצאו ב vivo5,6. חשוב מכך, הן אנטי אנדרוגן רגיש PCa ו-CRPC תאים מיוצגים באוסף הנוכחי של אורגנואידים. יתר על כן, אורגנואידים הערמונית הם בקלות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין5. לפיכך, אורגנואידים של הערמונית הם מערכת המודל המתאים לבדיקת היענויות לסמים ולהבהיר מנגנוני התנגדות. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבצע בדיקות סמים ולנתח תגובות תרופתי באמצעות אורגנואידים הערמונית.
הבנת מנגנונים מולקולריים בבסיס אנטי אנדרוגן התנגדות וגילוי פגיעויות טיפוליות פוטנציאליות דורש בדיקה של תגובות תרופתי במערכות מודל מחקה סרטן הערמונית. המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ניתוח אמין של תגובות תרופתי בחולה נגזר ומהונדסים גנטית אורגנואידים הערמונית והכנת דגימות אלה אורגנו…
The authors have nothing to disclose.
K.P. נתמך על ידי NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. נתמך על ידי HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; וכוכב סרטן קונסורציום. W.R.K. נתמך על ידי הקרן לסרטן הולנדית/KWF Buit 2015-7545 ו סרטן הערמונית הקרן PCF 17YOUN10.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |