Summary
Præsenteret her er en protokol til at studere farmakologiske reaktioner i prostata epiteliale organoider. Organoider ligner nøje in vivo biologi og rekapitulere patient genetik, hvilket gør dem attraktive modelsystemer. Prostata organoider kan etableres fra dværg prostater, genmanipulerede musemodeller, godartet humant væv, og avanceret prostatakræft.
Abstract
Præsenteret her er en protokol til at studere farmakodynamik, stamcelle potentiale, og kræft differentiering i prostata epiteliale organoider. Prostata organoider er androgen lydhør, tredimensionelle (3D) kulturer dyrket i et defineret medium, der ligner den prostataepitelet. Prostata organoider kan etableres fra vildtype og genmanipulerede musemodeller, godartet humant væv og avanceret prostatacancer. Vigtigere, patient afledte organoider ligner tumorer i genetik og in vivo tumor biologi. Desuden kan organoider genmanipuleres ved hjælp af CRISPR/Cas9 og shRNA systemer. Disse kontrollerede genetik gør den organoide kultur attraktiv som en platform for hurtigt at teste virkningerne af genotyper og Mutations profiler på farmakologiske reaktioner. Forsøgsprotokoller skal dog være specielt tilpasset til den 3D-natur af organoid kulturer for at opnå reproducerbare resultater. Beskrevet her er detaljerede protokoller for udførelse af såning assays at bestemme organoid dannelse kapacitet. Efterfølgende viser denne rapport, hvordan man udfører medicin behandlinger og analyserer farmakologisk respons via levedygtigheds målinger, protein isolering og RNA-isolation. Endelig beskriver protokollen, hvordan man forbereder organoider til xenografting og efterfølgende in vivo-vækstundersøgelser ved hjælp af subkutan podning. Disse protokoller giver meget reproducerbare data og gælder i vid udstrækning for 3D-kultur systemer.
Introduction
Resistens over for lægemidler er et af de største kliniske problemer i kræftbehandling. Metastatisk prostatacancer (PCa) behandling er primært rettet mod androgen-Signaling akse. Næste generations anti-androgen terapier (f. eks, enzalutamid og abiraterone) har vist stor klinisk succes, men næsten alle PCa i sidste ende udvikler sig mod en androgen-uafhængig tilstand, eller kastrationsresistent prostatacancer (CRPC).
Nylige genomiske og transkriptomic profilering af CRPC afslørede, at der er tre generelle mekanismer for resistens i prostatakræft: 1) aktivering af mutationer resulterer i restaurering af Androgen receptor (AR) signalering1; 2) aktivering af bypass signalering, som eksemplificeret i en præklinisk model for næste generations anti-androgen terapi resistens, hvor aktivering af glukokortikoid receptor (GR) kan kompensere for tab af AR signalering2; og 3) den nyligt identificerede proces af Lineage plasticitet, hvor tumorceller erhverve resistens ved at skifte nedstamningens fra en celletype afhængig af drug target til en anden celletype, der ikke er afhængig af dette (som i PCa, er repræsenteret som ar-negative og/eller neuroendokrine sygdomme [NEPC])3,4. Men de molekylære mekanismer, der forårsager resistens over for lægemidler, er ikke forstået. Desuden, erhvervet anti-androgen resistens kan føre til terapeutiske sårbarheder, der kan udnyttes. Derfor er det vigtigt at evaluere lægemiddel responser i modelsystemer, der efterligner patienters fænotyper og genotyper.
Prostata organoider er organotypiske kulturer dyrket i en 3D-protein matrix med et defineret medium. Vigtigere, prostata organoider kan etableres fra godartet og kræft væv af murine eller menneskelig oprindelse, og de bevarer fænotypiske og genotypiske funktioner findes i vivo5,6. Vigtigere, både anti-androgen følsomme PCa og CRPC celler er repræsenteret i den nuværende kompendium af organoider. Desuden, prostata organoider er let genetisk manipuleret ved hjælp af CRISPR/Cas9 og shRNA5. Således, prostata organoider er et egnet model system til testning af narkotika respons og belyse resistensmekanismer. Her beskrives en detaljeret protokol til at udføre Drug test og analysere farmakologiske reaktioner ved hjælp af prostata organoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbejde, der er beskrevet i denne protokol, er blevet udført med tidligere etablerede murine organoider og patient afledte organoider. Alt dyre arbejde blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for forskning Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Alle patient-afledte væv blev indsamlet i overensstemmelse med regler og bestemmelser i Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001).
1. medium og buffer forberedelse
- Tø kælder membran matrix (f. eks. Matrigel) ved 4 °C natten over, før du starter eksperimentet. Opbevar den på is under brug.
- Placer kultur pladerne ved 37 °C i 24 timer før forsøg. Dette vil hjælpe kælderen membran matrix Dome (i det følgende benævnt matrix Dome) at polymerisere. Plating organoider er beskrevet i trin 2.1.2.
- Forbered organoid mediet i henhold til den etablerede protokol5.
- Forberede organoid medium uden tilsætning af epidermal vækstfaktor (EGF; Se tabel over materialer til komponenter). EGF undertrykker AR transkriptional output og giver anti-androgen resistens5.
- Tilbered Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS).
Bemærk: dette medie bruges til at hæmme enzymatisk fordøjelse med trypsin-udskiftning i afsnit 2-4. - Forbered lægemiddel løsninger i henhold til producentens protokol. For enzalutamid/mdv3100 (i det følgende benævnt anden generations anti-androgen), Forbered en stamopløsning på 100 μM i dimethylsulfoxid (DMSO). Bestanden kan opbevares ved-20 °C i op til 6 måneder og behøver ikke at blive gjort frisk.
2. isolering, enzymatisk fordøjelse og etablering af organoider
- Isoler prostata organoider fra mus eller humant væv i henhold til de tidligere etablerede protokoller5,7. Nedenfor gives en kort beskrivelse.
- Mince og enzymatisk fordøje prostata væv til at producere en enkelt cellesuspension. I dette eksperiment blev 1 ml 5 mg/ml kollagenase type II i admem/F12 anvendt til fordøjelsen af 50 mg prostata væv.
- Indsaml cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min., Tæl cellerne, resuspension dem i kælderen membran matrix, og plade ved den passende tæthed7,5i matrix kupler på præ-varmet organoid kultur plader (plating metode er vist i figur 1A).
- Lad kupperne størkne og tilføje medier på toppen af kupperne, så de er helt dækket.
- Dyrk organoider til den ønskede mængde til downstream-applikationer. Celle nummer kan bestemmes ved standard optællingsmetoder. Se det programspecifikke afsnit i protokollen for yderligere oplysninger om tæthed.
- Brug en P1000-pipette til at tegne mediet og pipette op og ned for at afbryde. Når kælderen membran matrix er helt forstyrret, overføre suspensionen til en 15 mL konisk rør. Anbring ikke mere end 10 kupler pr. enkelt 15 mL konisk slange. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Træk supernatanten af og vask celle pellet med 5 mL PBS. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Træk supernatanten af, og resuspender pellet i 4 mL trypsin-udskiftning. Digest for 5-10 min med omrystning ved 37 °C. Tilsæt en tilsvarende mængde organoid medium + 10% FBS til at hæmme trypsin udskiftning. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten trækkes ud og resuspenderes i 1 mL PBS.
- Filtrer suspensionen med et 40 μm filter for at sikre en enkelt cellesuspension. Kvantificere celle nummeret ved hjælp af et hemocytometer eller en tilsvarende tælle anordning.
Bemærk: Hvis det er vanskeligt at opnå levedygtige enkeltceller, skal du bruge flow sortering til at opnå en enkelt celle opløsning.
3. vurdering af organoid dannelses kapacitet
Bemærk: for at bestemme procentdelen af celler, der kan generere en organoid, en såning assay kan udføres som en proxy for stammen/Progenitor potentiale. Den organoide dannelse kapacitet er også vigtigt for at definere et celle såning nummer for levedygtigheden assays.
- Den cellesuspension, der er opnået i trin 2,7 til 100 celler pr. 10 μL af suspensionen med organoid-medium indeholdende 10 μM Rho kinasehæmmer Y-27632, fortyndes.
- Overfør 1.100 celler (110 μL suspension) til et nyt konisk rør.
- Tilsæt 285 μL kælder membran matrix og resuspender cellerne. Dette vil resultere i en ~ 70% matrix koncentration.
Bemærk: fortynding af kælderen membran matrix undersåning reducerer i høj grad variationen i kuppel størrelse, forårsaget af viskositeten af protein matrixen. - Frøceller i 35 μL matrix kupler i en præ-varmet 24 brønd plade, hvilket resulterer i 200 celler/godt. Plade 3-5 replikater pr. prøve (også se plating metode i figur 1A og trin 2.1.2).
- For at sikre, at cellerne forbliver inden for matrix kuplen, vendes pladen og placeres i en celle inkubator for at størkne kælderen membran matrix.
- Efter 10 min. fjernes pladen fra inkubator og tilsættes medium indeholdende Rho kinasehæmmer.
- Opdater mediet hver 2. Efter 7 dage, kvantificere antallet af organoider. Opbevar Rho kinasehæmmer i medierne gennem hele eksperimentet.
- Tæl antallet af organoider etableret pr Dome og beregne procent af organoider dannet ud af det samlede antal celler belagt (200 celler).
Bemærk: Organoid etablering nøgletal varierer fra 3%-60% afhængigt af celletype og genotype.
4. bestemmelse af farmakologiske reaktioner af organoider
- Fortsætter fra trin 2,7, Seed 1000-10000 celler i en matrix kuppel. Brug organoid dannelse effektivitet og væksthastighed som en proxy for fastsættelsen af det endelige celle nummer.
Bemærk: de anbefalede cellenumre er angivet i tabel 1. Brug tre til fem replikater pr. betingelse pr. analyse. Brug en slutkoncentration på 70% kælder membran matrix for at reducere pipetteringsfejl induceret af viskositeten. - Frø 35 μL matrix kupler i en 24 brønd plade og lad kupler størkne som gjort i punkt 3 (også se plating metode i figur 1a og trin 2.1.2). Tilsæt medium indeholdende Rho kinase inhibitor og stof valg. Denne metode kan anvendes på alle lægemidler, men i denne protokol, en anden generation anti-androgen bruges på 10 μM for et eksempel. For at bestemme halv maksimal inhiberende koncentration (IC50), udføre en log10 trinvis, og som en kontrol, bruge det køretøj, hvor stoffet blev opløst.
- Opdater mediet hver to eller tre dage og analysere organoider på dag 7 for at bestemme den farmakologiske reaktion af lægemidlet. Tidspunkterne kan variere blandt valget af eksperiment og stof.
Bemærk: Organoider behøver ikke at være trypsinized for at udføre disse assays. - At holde organoider intakt, ved hjælp af en P1000 pipette, tegne mediet og pipetten op og ned for at forstyrre kælderen membran matrix.
- Når kælderen membran matrix er helt forstyrret, overføre suspensionen til en 15 mL konisk rør. Overfør ikke mere end 10 matrix kupler pr. 15 mL konisk slange.
- Centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Træk supernatanten af og vask med 5 ml PBS.
- Resuspension af organoider i 1 ml PBS og forstyrrer organoiderne ved hjælp af formalings og en glas Pasteur-pipette.
- Kvantificere antallet af organoide fragmenter. Seed 5 replikater indeholdende 100 organoide fragmenter som beskrevet i trin 2.1.2.
- Udfør celle levedygtigheds analysen som beskrevet nedenfor i afsnit 7.
5. RNA-isolation fra organoider
Bemærk: kommercielt tilgængelige kolonne-baserede metoder give god mængde og kvalitet af RNA. For at sikre god mængde RNA skal du bruge mindst én kuppel pr. prøve; men ved hjælp af tre kupler anbefales, som kan seedede i en enkelt brønd af en 12 brønd plade.
- Tilsæt ß-mercaptoethanol (1%) til glutathion lysis-bufferen i RNA-isolations sættet.
- Træk mediet ud af kælderen membran kupler indeholdende organoider og tilsæt 750 μL af denne buffer. Pipetten op og ned med en P1000-pipette. Kontroller, at hele kælderen membran matrix er blevet opløst.
- Tilsæt 750 μL 70% ethanol og bland ved pipettering. Derefter overføres 700 μL af blandingen til kolonnen, centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min, og gentages med resten af lysatet.
- Udfør skyller og on-Column DNase behandling i henhold til producentens anvisninger. Elute RNA i 30-50 μL RNAse-frit vand.
- Koncentrationerne måles ved hjælp af et fluorometer ved OD = 260 nm og 280 Nm og opbevares ved-80 °C eller fortsættes med downstream-applikationer.
6. protein isolering fra organoider
Bemærk: for protein isolering, Forbered standard RIPA buffer indeholdende fosfatase og proteasehæmmere (tabel over materialer). Brug af mindst tre kupler anbefales, som kan seedede i en enkelt 12 brønd.
- Brug en P1000-pipette til at tegne mediet fra cellen med kælderen membran kupler indeholdende organoider og pipette op og ned for at forstyrre kælderen membran matrix.
- Når den er helt afbrudt, skal suspensionen overføres til et 15 mL konisk rør. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Træk supernatanten af og vask med 5 mL iskold PBS. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Træk supernatanten af, og resuspender pellet i 4 mL trypsin-udskiftning. Digest for 5-10 min under omrystning ved 37 °C.
- Tilsæt en tilsvarende mængde organoid medium + 10% FCS til at hæmme trypsin udskiftning. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
Bemærk: efter centrifugering, ingen kælder membran matrix bør være synlig i pellet. - Træk supernatanten af og vask med 5 mL iskold PBS. Træk supernatanten ud, og resuspender celle pellet i 300 μL lysis-buffer ved hjælp af et P1000-pipet, og overfør derefter til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Inkuber på is i 10 minutter og efterfølgende sonikér 2x for 30 s hver på afkølet vand med en temperatur på 4 °C. Placer røret tilbage på isen og Udfør protein kvantificering ved hjælp af standardmetoder.
- Denatur proteinet ved tilsætning af natriumdodecylsulfat (SDS) indeholdende belastnings farve og kogning i 5 min ved 95 °C. Opbevar lysater ved-80 °c eller Fortsæt med downstream-applikationer.
7. cellelevedygtighed analyse med organoider
Bemærk: cellernes levedygtighed kan vurderes ved hjælp af det kommercielt tilgængelige Analysesæt til cellelevedygtighed og et luminometer. Forbered buffere i henhold til producentens anvisninger. Fem replikater pr. betingelse anbefales: en replikat bestående af 1 35 μL kælder membran matrix kuppel i en brønd af en 24 brønd plade.
- Trække fra mediet af organoid kultur, at være omhyggelig med at forlade matrix kupler intakt.
- Tilsæt 65 μL PBS og pipetten op og ned for at afbryde matrix kuplen.
- Tilsæt 100 μL af cellen levedygtighed assay kit buffer og resuspension ved pipettering.
- Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter ved omrystning.
- Overfør 100 μL af blandingen til en ikke-gennemskinnelige plade, der egner sig til luminometeret, og Udfør aflæsning i henhold til producentens anvisninger for celle levedygtigheden assay kit.
8. fremstilling af organoider til xenografting
Bemærk: Organoider er også modtagelig for subkutan podning i både immunkompromitterede dyr, samt, isogene mus. For at sikre injicerede organoider skelnes in vivo, etiketten organoider med en konstitutivt udtrykker fluoroforet5. Det anbefales at udføre en piloteksperiment for podning ved hjælp af 5 x 105 celler til 2 x 106 celler per injektion, med intervaller på 5 x 106 celler, som podning effektivitet varierer mellem organoid linjer.
- Brug en P1000-pipette til at tegne mediet og pipetten op og ned for at forstyrre kælderen membran matrix. Når den er helt afbrudt, skal suspensionen overføres til et 15 mL konisk rør. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
Bemærk: Overfør ikke mere end 10 matrix kupler pr. 15 mL konisk slange. - Træk supernatanten af og vask med 5 mL PBS. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Træk supernatanten af, og resuspender pellet i 4 mL trypsin-udskiftning. Digest for 5-10 min under omrystning ved 37 °C.
- Tilsæt lige volumen af organoid medium + 10% FBS at hæmme trypsin udskiftning. Centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten trækkes ud og resuspenderes i 1 mL PBS. Filtrer suspensionen med et 40 μm filter for at sikre en enkelt cellesuspension. Kvantificere celler ved hjælp af standardmetoder.
- Drej og resuspender cellerne i PBS + Rho-hæmmer til en koncentration på 2 x 106 celler pr. 100 μl (Se tabel 2 for celle koncentrationer og absolut celle nummer, der er nødvendigt for varierende koncentrationer). Brug en tilsvarende mængde kælder membran matrix til at generere en 1:1 suspension. Placer suspensionen på is.
- Injicer celler i henhold til standardprotokoller og Overvåg xenograft vækst ved hjælp af standardmetoder8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seeding effektivitet
Organoid dannelses kapacitet bestemmes af fænotype og genotype. Wild-type (WT) prostata basal celler viste overlegne organoid dannelse kapacitet (30%-40%) sammenlignet med luminale celler (3%) (Figur 1A). Efter organoid etablering, øget dannelse kapacitet drastisk. Typisk kan 25%-30% af cellerne afledt af et WT organoid danne et nyt organoid (figur 1B). CRISPR/Cas9-medieret tab af Pten (PtenΔ/δ) eller P53 (P53Δ/δ) resulterede i en mindre stigning i organoid dannelses kapacitet. Tab af både P53 og PTI yderligere øget dannelse kapacitet (figur 1B).
Farmakologisk respons
Baseret på såning effektivitet, såning af 1000-10000 celler i 35 μL kælder membran matrix kuppel i en 24 brønd plade blev udført. Anbefalede celle såning tal baseret på organoid dannelse effektivitet er angivet i tabel 1. Men, organoid spredning hastigheder kan variere meget afhængigt af genotype. Yderligere ændringer i celle såning nummer kan gøres baseret på spredning.
I figur 2blev virkningerne af anti-androgene molekyler på vækst testet i murine organoider med forskellige genotyper. I alt 2.500 celler blev seedet fra murine organoider med en WT genotype, P53 tab, Pten tab, eller Dual P53 og Pten tab. P53 og Pten tab blev initieret af lentiviral introduktion af en gRNA rettet mod P53 og/eller pten locus i organoider konstitutivt udtrykker Cas9 under kontrol af Rosa26 promotor med en C57/Bl6 genetisk baggrund9.
Tab af P53 ikke forårsage resistens over for anti-androgene molekyler. Tab af Pten øget resistens over for anti-androgene sammensatte, som vist tidligere10. Dobbelt tab af P53 og Pten, dog, resulterede i fuldstændig modstand mod anden generation anti-androgen (figur 2A). AR-hæmning ændrede også organoide fænotyper. I kontrol Cas9+/+ organoider, samt P53δ/δ-slettede og PtenΔ/Δ organoider, et fald i organoid lumen størrelse blev observeret (figur 2B). P53δ/δ PtenΔ/δ organoider var fænotypisk upåvirket (figur 2B). I overensstemmelse med disse resultater, hvor 1 x 106 celler blev podet subkutant i flanken, voksede kun P53δ/δ ptenδ/δ organoider (figur 2C). Samlet set viser disse resultater, at P53δ/δ Ptenδ/δ Co-deletion resulterer i resistens over for anden generations anti-androgen i murine organoider.
De patient afledte PCa-organoider er heterogene i fænotype og genotype11,12; Derfor kan reaktioner på stoffer variere meget mellem menneskelige PCa organoid linjer. I figur 3vises de anti-androgene molekyler respons af to forskellige humane PCa organoider, MSKPCA2 og MSKPCA3. Spredningen af MSKPCA2 organoider var stærkt hæmmet af anti-androgene molekyler, mens MSKPCA3 organoider forblev upåvirket (figur 3A, B). MSKCPCA2 organoider udtrykte høje niveauer af AR og AR-Target FKBP5, og de udtrykte kendetegnende luminale proteiner såsom CK8 og CK18. I modsætning hertil udtrykte MSKPCA3 organoider også basal (CK5) og mesenchymal (Vimentin) markører og viste ingen udtryk for FKBP5. Disse resultater tyder på, at disse organoider model en ikke-luminal androgen-uafhængig fænotype.
Figur 1: måling af organoid dannelse rater af humane og mus prostata celler. (A) skematisk oversigt over celle opslæmning i kælderen membran matrix (venstre) og organoid såning i matrix kupler (højre). (B) relativ organoid dannelse af humane (CD49f +)-afledte basal-og (CD26 +)-afledte luminale celler (%, y-akse; gennemsnit ± SD) i nærværelse af 1 nm DHT. I alt 200 celler blev seedet, og antallet af organoider blev kvantificeret 7 dage efter såning (n = 3, * * * p < 0,01, t-test). C) relativ organoid dannelse af murine WT, ptenΔ/δ, P53δ/δog P53δ/δ ptenΔ/δ organoider (%, y-akse, gennemsnit ± SD) i nærværelse af 1 nm DHT. I alt 200 celler blev seedet, og antallet af organoider blev kvantificeret 7 dage efter såning (n = 3). P53 og pten tab blev medieret af grna's målretning af P53 og/eller pten locus i organoider, der udtrykker Cas9 konstitutivt under en Rosa26 promotor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af den farmakologiske respons af organoider afledt af genetisk manipulerede mus. A) relativ celleproliferation af MURINE WT, PtenΔ/δ, P53δ/Δog P53Δ/δ ptenδ/δ ORGANOIDER (y-aksen, gennemsnit ± SD, målt ved celle levedygtig assay Kit) af 2.500 celler 7 dage efter etableringen af organoider; (n = 3, * p < 0,05, t-test) med 1 nM DHT eller 10 μM af andengenerations antiandrogen som indikeret. (B) repræsentative lysfelt billeder af WT, ptenΔ/δ, P53δ/δ, og P53Δ/Δ ptenδ/Δ organoid kulturer behandlet med 1 nm DHT eller 10 μM anden generation anti-androgen som angivet. C) repræsentativ vækstkurve for WT, PtenΔ/δ, P53δ/Δog P53Δ/δ ptenΔ/Δ organoider injiceret subkutant i flanken af isogene C57/Bl6 mus. Kun P53δ/δ Ptenδ/δ organoider viste vækst. I alt 1 x 106 celler blev injiceret. Tre uafhængige kurver af P53δ/δ PtenΔ/δ organoids viser heterogenitet i væksthastigheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: vurdering af den farmakologiske respons af organoider afledte humane prostatacancer biopsier. A) relativ celle spredning af patient afledte MSKPCA2 og MSKPCA2 organoider (y-aksen, gennemsnit ± SD, målt ved celle levedygtigheds analyse Kit) af 5.000 celler 7 dage efter etableringen af organoider (n = 4, * p < 0,05, t-test) med 1 nm DHT eller 10 μM anden generations anti-androgen som angivet. (B) repræsentative lysfelt billeder af MSKPCA2 og MSKPCA3 organoider kulturer behandlet med 1 nm DHT eller 10 μM anden generation anti-androgen som angivet. C) Western blot analyse af ar, FKBP5 (AR-Target-genet), CK8 og CK18 (luminale markører), CK5 (basal markør) og Vimentin (mesenchymal markør) i MSKPCA2 og MSKPCA3 organoider. GAPDH blev brugt som læsse kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Effektivitet i organoid-såning (%) | Celle-såning nummer (pr Dome) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
Tabel 1: celle såning tal bruges til at vurdere farmakologiske respons baseret på organoid dannelse kapacitet. Tabel efter kolonne (fra venstre til højre) omfatter kapacitets intervaller for organoid dannelse og det tilsvarende antal celler til frø pr. matrix kuppel.
| Samlet celle nummer | PBS0 + Y-27632 | Matrigel Volume | celle koncentration/injektion |
| 5 x 106 | 500 μl | 500 μl | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 μl | 500 μl | 1,5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 μl | 500 μl | 2 x 106 |
Tabel 2: anbefalede cellenumre til forsøg med organoid xenografting. Kolonner fra venstre til højre omfatter absolut total celle nummer for 10 injektioner, samlet volumen af PBS + Y-27632 for 10 injektioner, kælder membran matrix volumen og celle nummer pr. injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forståelse af de molekylære mekanismer underliggende anti-androgen resistens og opdage potentielle terapeutiske sårbarheder kræver afprøvning af farmakologiske reaktioner i modelsystemer efterligner prostatacancer. Beskrevet her er en detaljeret protokol til pålidelig analyse af farmakologiske reaktioner i patient-afledte og genetisk manipulerede prostata organoider og fremstilling af disse organoid prøver til downstream-applikationer.
Der er to kritiske trin i denne protokol. Den første er at bestemme såning effektivitet og vækstrate af organoider. Organoid væksthastighed varierer meget. Dette er afhængig af arter, som murine afledte organoider vokse omkring to gange hurtigere end menneskelige-afledte organoider. Ud over arterne er væksthastigheden afhængig af genotype og fænotype. Men når såning effektivitet og væksthastighed bestemmes, denne protokol kan tilpasses til alle prostata organoid typer.
Det andet kritiske skridt er at arbejde med den protein-matrix-baserede 3D-kultur til at forberede efterfølgende downstream-applikationer. Indførelsen af såning variation af viskositet i kælderen membran matrix under plating kan undgås ved hjælp af fortyndet (70%) kælder membran matrix, som beskrevet. Korrekt nedbrydning af den polymeriserede matrix uden overdreven forstyrrende organoider er også beskrevet i detaljer. Denne protokol muliggør afbrydelse af matrixen uden at indføre variation i organoid-udlæningen, som kan tilpasses til screening af lægemiddelbiblioteker med forskellige genetiske baggrunde i PCa. Ved at udføre CRISPR/Cas9-eller shRNA-baseret udtryks forstyrrelse kan gener, der giver resistens over for stoffer, desuden forespørges.
Et punkt til overvejelse er, at den medium sammensætning af prostata organoid kultur kan påvirke den farmakologiske respons. For eksempel, EGF, en komponent af både murine og menneskelig prostata organoid kultur, reducerer i høj grad følsomhed over for anti-androgen. Derfor er EGF udeladt i denne protokol fra mediet, og følsomhed over for anti-androgen er genoprettet. Det tilrådes at afgøre, om nogen organoid ingredienser påvirke følsomheden for det stof, der testes. Dette gælder især for den komplekse menneskelige prostata organoid kulturmedium, som (bortset fra EGF, Noggin, R-spondin1, DHT, og A83-001 [sammensætningen af murine organoid medium]) indeholder fibroblast vækstfaktor 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, nicotinamid og p38i-hæmmer SB202190.
Organoid medium sammensætning favoriserer væksten af benign prostata epitel over Cancer væv, således ingen primære hormon følsomme PCa organoid linjer er blevet etableret. I øjeblikket er alle humane PCa-organoider afledt af patienter med fremskreden metastatisk anti-androgen-resistent PCa; Derfor, de fleste af disse linjer er anti-androgen resistente og egnet til at identificere nye behandlinger. Som proof-of-concept, Delta-lignende 3 (DLL3) er blevet identificeret som et terapeutisk mål ved hjælp af patient-afledte NEPC organoider, der er annonce med rovalpituzumab tesirine13. Denne metode er velegnet til disse typer af eksperimenter og er også egnet til prostata organoider fra normal godartet væv, primær prostatakræft, og CTCs.
En mangel af prostata organoid kultur er fraværet af en cellulær niche. Således kan bidrag til resistens ved ikke-tumorceller ikke undersøgt ved hjælp af den nuværende platform. Men, co-kulturer af kolorektal cancer og lungekræft organoider med autologt T-celler er for nylig blevet etableret, muliggør undersøgelser af interaktioner mellem tumoren og immunsystemet14. Der kan etableres andre Co-kultur systemer til yderligere undersøgelse af ikke-celle autonome interaktioner.
Konklusionen er, at denne rapport indeholder en detaljeret protokol for den reproducerbare vurdering af farmakologiske reaktioner i prostata organoider og efterfølgende downstream-anvendelser. Vigtigere, denne protokol er stort set anvendelig og kan bruges til organoid kulturer af andre organer, herunder Colon15, tyndtarmen16 , mave17,18, leveren19, bugspytkirtlen20, nyre21og mælke kirtel22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C. L. S er bestyrelsesmedlemmer i Novartis. er en medstifter af ORISKE lægemidler og coinventor af enzalutamid og apalutamid; er videnskabs rådgiver for Agios, Beigene, Blueprint, kolonnegruppe, foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra og PMV; og er en medstifter af Seragon, købt af Genentech/Roche i 2014. W.R.K. er en coinventor og patentindehaver af organoid teknologi.
Acknowledgments
K.P. understøttes af NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. understøttes af HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; og Starr Cancer Consortium. W.R.K. er understøttet af hollandske Cancer Foundation/KWF buit 2015-7545 og prostatacancer Foundation PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
