Summary
在这里，我们提出了一个方案，通过硅胶油的宫内注射和从前腔中取出硅油的程序，诱导小鼠眼睛的眼内高血压和青光眼神经变性， 以返回升高的眼内压力正常。
Abstract
眼内压力升高 （IOP） 是青光眼的一个详细记录的危险因素。在这里，我们描述了一种在小鼠中持续诱导稳定的IOP高程的新方法，该方法模仿了在人类视网膜手术中使用硅油（SO）作为棉布剂的术后并发症。在此协议中，SO被注射到小鼠眼睛的前室，以阻止学生，防止水性幽默的流入。后室积累水性幽默，这反过来又增加了后段的IOP。单次SO注射可产生可靠、充足和稳定的IOP高程，从而诱发显著的青光眼神经退化。此模型是眼科诊所中继发性青光眼的真实复制。为了进一步模拟临床设置，SO 可以从前室中取出，以重开排水通道，并允许水性幽默的流入，水性幽默通过前室的角度通过眼网状工程 （TM） 排出。由于 IOP 很快恢复正常，该模型可用于测试降低 IOP 对青光眼视网膜性结条细胞的影响。该方法简单明了，不需要特殊设备或重复程序，密切模拟临床情况，可适用于多种动物物种。但是，可能需要稍作修改。
Introduction
视网膜结结细胞（RGCs）及其斧头的逐渐丧失是青光眼的标志，青光眼是视网膜1中常见的神经退行性疾病。到2040年，它将影响超过1亿40-80岁的人。IOP仍然是青光眼发展和进展中唯一可改变的风险因素。为了探索青光眼的发病机制、进展和潜在治疗，一种可靠、可重复和诱导的实验性眼高血压/青光眼模型，复制人类患者的关键特征势在必行。
IOP 取决于从后室的纤毛体流入前室的水性幽默，并在前室的角度通过眼网状物 （TM） 流出。达到稳定状态后，IOP 保持不变。当流入超过或小于流出时，IOP 将分别上升或下降。通过通过遮挡前腔室的角度或破坏TM来减少水流出，已经建立了3、4、5、6、7、8、9、10。这些模型通常与不可逆的眼组织损伤相关，前腔的高 IOP 也会导致不必要的并发症，如角膜水肿和眼内炎症，这使得视网膜成像和视觉功能测定难以执行和解释。
为了开发一个克服这些缺点的模型，我们专注于由硅油（SO）引起的二次青光眼，它作为人类视网膜手术的术后并发症发生11，12。SO因其高表面张力而被用作视网膜手术中的棉签。然而，SO可以物理遮挡学生，因为它比水液和vita流体轻，防止水流入前室。由于水性幽默积累，阻碍导致后室的IOP高程。这促使我们开发和描述基于宫内SO注射和小孔块13的新型眼高血压小鼠模型，其关键特征是继发性青光眼：有效的小毛块、在SO去除后可恢复正常的显著IOP高程，以及青光眼神经变性。
在这里，我们提出了一个详细的协议，SO诱导眼高血压在小鼠眼睛，包括SO注射和去除和IOP测量。
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Protocol
所有程序都已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 通过SO宫内注射诱导眼部高血压
- 通过用移液器拉拔器拉制玻璃毛细管来生成微移液器，为宫内 SO 注射准备玻璃微移液器。在微移液器尖端切一个开口，用微磨机进一步锐化尖端，以制作 35°40° 斜面。
- 抛光斜面的边缘，用水清洗清除所有碎屑。使用前对微管进行高压灭菌。
- 为角膜进入准备百分泌针。为此，请将 32 G 针头连接到 Luer 锁上的 5 mL 注射器上，然后用胶带将其进一步固定。将针斜面朝上弯曲 30°。
- 首先在 10 mL 注射器上连接并固定钝端 18 G 针头，为 SO 注射器做好准备。然后，在一端连接一个带有 18 G 指针的塑料管，然后根据需要通过另一端填充 SO。
- 将消毒微管连接到塑料管，然后推动注射器柱塞，用 SO 填充整个微管。
2. 一只眼睛的宫内SO注射
- 将一只9~10周大的雄性C57B6/J小鼠放入感应室，其中3%的杂氧与氧气混合，2升/分钟，3分钟。
- 以0.3毫克/克体重为重注射2，2，2-三溴二溴二苯醚乙醇。
注：与氯胺酮/西拉津不同，2，2，2-三溴二苯丙醇不会引起明显的学生扩张。 - 检查对脚趾捏没有反应，以及胡须或尾巴缺乏运动，以确定麻醉强度。
- 将鼠标放在手术平台上的横向位置。为了降低手术过程中的灵敏度，在注射前对角膜施用一滴0.5%的盐酸丙烷。
- 在超时态象限处用32G百岁针进行入口切口，距离边缘约0.5毫米。
- 穿过角膜层约0.3毫米，然后穿入前室。小心不要触摸镜头或虹膜。
- 慢慢拔下针头，通过隧道（百岁半月食）从前室释放一些水性幽默（约1⁄2 μL）。
- 等待 ±8 分钟以进一步降低 IOP。这可以通过测量反向控制眼来确定。
- 将预装SO的玻璃微移液器通过角膜隧道插入前室，斜面朝下朝向虹膜表面。
- 缓慢地推动注射器柱塞将 SO 注入前室，直到 SO 水滴覆盖大部分虹膜表面，直径为 ±2.3±2.4 mm。
- 将微管放在前室中10s以上，然后慢慢取出。
- 轻轻推上眼睑以关闭角膜切口，以尽量减少 SO 泄漏。
- 在眼表面涂抹抗生素膏（巴氏霉素-新霉素-多霉素）。
- 在整个过程中，经常用人工眼泪润湿角膜。
- 将鼠标放在加热垫上，直到完全从麻醉中恢复。
3. SO 去除
- 准备灌溉系统。
- 根据制造商的说明准备灌溉溶液，并将其放入灌溉瓶中。将灌溉溶液瓶提升到手术平台上方 110×120 厘米（81⁄88 mmHg）。
- 将 IV 管理套连接到灌溉溶液瓶。从 IV 管中清除气泡。将弯曲的 33 G 针连接到 20° 面朝 IV 管。
- 要准备排水系统，请从 1 mL 注射器中取出柱塞。将 33 G 针头连接到注射器，并将针头弯曲至 20°。
- 从前室中取出 SO。
- 内渗透注射2，2，2-三溴二苯醚乙醇（0.3毫克/克体重）。检查对脚趾捏没有反应，以确定麻醉强度和胡须或尾巴缺乏运动。
- 将鼠标放在手术平台上，用胶带将其固定在横向位置。在角膜上涂抹一滴0.5%的盐酸二甲苯，以降低其敏感性。
- 在 SO 液滴边缘的 ±2 至 5 点之间，在角膜的时间象限中进行两次切口，使用预制的 32 G 百岁针。
- 插入一个33 G灌溉针连接到灌溉溶液通过一个角膜切口，最大速度。
- 插入另一个 33 G 排水针连接到注射器，无需通过另一个角膜切口插入柱塞，使 SO 液滴在用灌溉溶液灌溉时退出前室。
- 取出排水针，然后拔下灌溉针。
- 将气泡注入前室以保持正常深度，然后按压关闭角膜切口。
- 在两只眼睛上涂抹抗生素膏。
- 将鼠标放在加热恢复垫上，直到完全从麻醉中恢复。
4. IOP 每周测量一次
- 将鼠标放入与3%的杂氧混合的感应室中，以2L/min的速度进行3分钟。
- 内渗透注射木氨酸和氯胺酮（0.01毫克木兰素/克，0.08毫克氯胺酮/克）。
- 在整个过程中，通过涂抹人工眼泪，保持角膜湿润。
- 等待约15分钟，让学生完全胶着。
- 根据产品说明，使用测速仪测量两只眼睛的 IOP。将测光仪靠近鼠标眼睛。保持从探头尖端到鼠标角膜的距离约3⁄4毫米。按测量按钮6倍可生成一个读数。从每只眼睛获得三个机器生成的读数，以获得均值 IOP。
- 在SO注射后8周内牺牲动物，对全座视网膜进行免疫组织化学、RGC计数、视神经（ON）半薄部分，以及对存活的斧头的定量，这在13日之前已经描述过。
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Representative Results
注射后不久，我们可以很容易地识别小鼠，不产生稳定的眼部高血压，因为SO液滴太小（±1.5毫米）13。这些动物被排除在后续实验中。按照注射程序，超过80%的SO注射小鼠最终滴大于1.6毫米。在一次SO注射后，我们每周测量一次这些小鼠眼睛的IOP，持续8周。眼睛接收SO的IOP仍然很高，一般是反向控制眼的IOP的两倍，表明有效的孔阻滞（图1）。小鼠角膜水肿可在宫内注射后在光解剖显微镜下检查，恢复通常需要2~3天。学生扩张需要时间，在进行 IOP 测量之前，必须等待学生扩张。因此，我们尽量不测量IOP太快后注射。出于同样的原因，我们不建议过于频繁地测量 IOP。与另一组小鼠一起，我们在SO注射后2周从前室冲出SO，我们再等一周，让角膜恢复，然后再测量IOP，使IOP恢复正常（图1）。
为了确定SO注射诱导的眼高血压对RGCs的影响，我们量化了视网膜整体层周围区域的存活RGC索马塔，通过RBPMS染色14，15和在ON半薄横截面的存活的斧头在SO注射后8周通过PPD染色16。青光眼RGC死亡和斧子退化是戏剧性的SO诱导眼部高血压检测不足的眼睛（SOHU）（图2）。有关此内容的进一步详细信息，请放在讨论部分。
图1：SO眼和反向控制眼的IOP测量，有或没有SO去除。SO = SO 注射的眼睛;CL = 反向控制眼睛。数据以均值 = S.E.M，n = 12 表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SOHU .（A）上面板中的青光眼RGC索马和斧子退化描绘了在SO注射全挂式视网膜后8周内显示RgCs（RBPMS+，红色）的外围区域。比例尺 = 20 μm. 下面板描绘了 SO 注射后 8 周内 ON 的横截面的半薄图像，该图像与 PPD 染色。刻度条 = 10 μm. （B） 与反向控制 （CL） 眼睛相比，在 SO 注射后 8 周内在 SO 注射 8 周内在外周视网膜 （n = 12） 中存活的 RgCs 和 ON （n = 10） 中的安注重剂的定量数据。数据以方法形式呈现 = S.E.M. *： P < 0.0001;学生的配对 t 测试。RGC = 视网膜性结伙细胞;打开 = 视神经。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们演示了一个简单但有效的程序，通过内部注入SO诱导小鼠眼睛持续IOP升高。在显微镜下有微解剖经验的人可以很快地学习这个程序。失效的主要潜在风险是角膜切口的SO泄漏。然而，使用SO的优点之一是，由于油滴是可见的和可测量的，我们可以很容易地识别接收的液滴太小，在注射后很快诱导稳定的眼高血压的小鼠，并将其排除在后续实验中。我们通常取得了80%的成功率，并排除了约20%的小鼠由于一个小的SO滴（±1.5毫米）13。然而，一个有经验的外科医生，谁可以在角膜层内做一个相对长的隧道（0.3毫米），然后用刀尖将角膜穿透前室，通过使角膜隧道的内开口比外开口小得多，几乎可以防止任何SO泄漏。因此，几乎所有的小鼠都注射了大于1.8毫米的SO滴。除了隧道的长度，其他一些要点也值得强调。首先，在注射眼睛中保持 IOP 低，以避免将 SO 推出前室，这一点很重要。一个常见的错误是注入过多的SO，这使得泄漏更容易。我们限制前腔室中的SO体积，使其几乎（但不是完全）覆盖虹膜表面。此 SO 滴的直径为 ±2.3±2.4 mm。其次，角膜隧道切口尽可能靠近边缘，使切口接近虹膜，但不会伤害虹膜，以便虹膜能够轻松进行切口。第三，注射速度应尽可能慢，以避免SO过度溢出到前室。第四，注射后上眼睑按摩有助于角膜切口关闭，有时帮助周围虹膜的前膜闭合角膜切口，从而避免漏油。
IOP 仅在眼睛的后半部分增加，但在前室没有增加，使其成为此模型的独特功能。学生阻塞可防止水幽默流入前室，因此仅在后部增加 IOP。SO 与虹膜和大眼透镜一起形成的物理屏障可能会断开前室与后段的连接，这可能仅在水物质积聚的后段限制 IOP 高程。当小鼠孔在扩张后大于SO液滴时，前腔室和后腔室重新连接，通过水淹进入前腔室，使IOP迅速增加。因此，一个托数只能检测在去除小孔块后增加的IOP，因此后段中真正的IOP无疑被低估了。因此，我们给该模型命名了SO诱导的眼部高血压检测不足模型（SOHU），该模型更准确、更有益地反映了该模型的这一关键特征。最好能够直接在后段测量 IOP，但到目前为止是不可能的。SOHU模型的独特发病机制具有两个有利特征：一是实验眼睛具有清晰的眼部元素，允许在体内评估视觉功能和形态;二是严重的青光眼神经退化允许检测神经保护剂的任何好处。
SO 注射可以暂时导致角膜水肿，我们建议不要过早或过于频繁地执行 IOP 测量。我们没有在SOHU眼睛的前腔或角膜中检测到任何炎症，尽管我们在100多只接受SO注射的小鼠中遇到了两例角膜新血管化。
由于SO在人类患者和小鼠中都会导致眼高血压，因此有理由假设，这种概念新颖且实际意义显著的青光眼模型可以适用于更适合临床前应用的大型动物。该模型的神经功能缺陷和形态的表征肯定会鼓励其他研究者利用它来研究有关青光眼的重要问题，更广泛地说，诱发RGC和ON的疾病。变性。
总之，这是一个简单的动物青光眼模型，不需要特殊设备或重复伤害，可能适用于其他动物物种。有趣的是，SOHU 模型的 IOP 高程可以通过从前腔中取出油来反转，因此可用于筛选神经保护治疗与 IOP 降低疗法相结合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由NIH授予EY024932、EY023295和EY028106至YH支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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