Summary
ここでは、シリコーンオイルのカメラインジェクションによるマウス目の眼圧高血圧および緑内化神経変性を誘導するプロトコルと、眼圧の上昇を戻すための前房からのシリコーンオイル除去の手順を提示する。通常。
Abstract
眼内圧の上昇(IOP)は緑内障の十分に文書化された危険因子である。ここでは、ヒトのビトレチナル手術でタンポネード剤としてシリコーンオイル(SO)を用いた術後合併症を模倣するマウスにおいて、安定なIOP上昇を一貫して誘導するための新規で効果的な方法について説明する。このプロトコルでは、SOは、瞳孔を遮断し、水性ユーモアの流入を防ぐために、マウスの眼の前房に注入される。後室は水性のユーモアを蓄積し、これは順番に後部セグメントのIOPを増加させます。単一のSO注射は、信頼性が高く、十分で安定したIOP上昇を生み出し、これは重大な緑内障神経変性を誘発する。このモデルは眼科医科で二次緑内障の真の複製である。さらに臨床設定を模倣するために、SOは、排水経路を再び開き、前房の角度でトラベキュラーメッシュワーク(TM)を通して排出される水性ユーモアの流入を可能にするために、前房から取り外すことができる。IOPはすぐに正常に戻るので、モデルは緑内障網膜神経節細胞に対するIOPを低下させる効果をテストするために使用することができる。この方法は簡単で、特別な装置や繰り返し手順を必要とせず、臨床状況を綿密にシミュレートし、多様な動物種に適用可能であり得る。ただし、わずかな変更が必要な場合があります。
Introduction
網膜神経節細胞(RGC)及びその軸索の進行性喪失は、網膜1における一般的な神経変性疾患である緑内障の特徴である。2040年までに40~80歳の1億人以上の個人に影響を及ぼす。IOPは緑内障の発症および進行における唯一の変更可能な危険因子のままである。緑内障の病因、進行、および潜在的な治療法を探索するためには、ヒト患者の主要な特徴を複製する信頼性が高く、再現性があり、誘導可能な実験的高血圧/緑内障モデルが不可欠である。
IOPは、後房内の毛様体から前房への水性液流入と、前房の角度でトラベキュラーメッシュワーク(TM)を通る流出に依存する。定常状態に達すると、IOP は維持されます。流入が流出を超えたり下回ったりすると、IOP はそれぞれ上昇または下降します。前房の角度を閉塞するか、またはTMを損傷することによって水性流出を減少させることにより、いくつかの緑内障モデルが確立された3、4、5、6、7、8、9、10である。これらのモデルは通常、不可逆的な眼組織損傷に関連しており、前房内の高いIOPは角膜浮腫や眼内炎症などの望ましくない合併症を引き起こし、網膜イメージングおよび視覚機能アッセイを行い、解釈することが困難になる。
これらの欠点を克服するモデルを開発するために、ヒトの静脈小体手術11、12の術後合併症として生じるシリコーンオイル(SO)によって引き起こされる十分に文書化された二次緑内障に着目した。SOは、その高い表面張力のために網膜手術のタンポナードとして使用されます。しかし、SOは水性および静脈内液体よりも軽く、前房への水性の流れを防ぐので、瞳孔を物理的に閉塞させることができる。閉塞は水性ユーモアの蓄積のために後部室のIOPの上昇を引き起こす。これは、二次緑内障の主な特徴を持つ、カメラルSO注射と瞳孔ブロック13に基づく新規な眼高血圧マウスモデルを開発し、特徴づける動機となった:効果的な瞳孔ブロック、SO除去後に正常に戻ることができる重要なIOP上昇、緑内障神経変性。
ここでは、SO注射と除去およびIOP測定を含むマウス眼におけるSO誘発性眼圧の詳細なプロトコルを提示する。
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Protocol
すべての手続きは、スタンフォード大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. SOのカメラ内注入による眼圧誘発
- ピペットプーラーでガラスキャピラリーを引っ張ってマイクロピペットを生成し、カメラ内SO注入用のガラスマイクロピペットを準備します。マイクロピペットの先端で開口部を切り、さらにマイクログラインダーベベルマシンで先端を研ぎ、35°-40°ベベルを作ります。
- ベベルの端を磨き、水洗いですべての破片を取り除きます。使用前にマイクロピペットをオートクレーブします。
- 角膜の入り口のための麻痺の針を準備します。これを行うには、Luerロックの5 mLシリンジに32 G針を取り付け、テープでさらに固定します。針のベベル先端を30°で上に曲げる。
- 最初に10 mLシリンジに鈍い端18 G針を取り付けて固定して、SOインジェクターを準備します。次に、一方の端に18 G針を付けたプラスチックチューブを取り付け、もう一方の端を通して必要に応じてSOで満たします。
- 殺菌したマイクロピペットをプラスチックチューブに取り付け、シリンジプランジャーを押してマイクロピペット全体をSOで満たします。
2. 片目のためのカメラ内SO注射
- 9-10週齢の雄C57B6/Jマウスを誘導室に入れ、3%のアイソフルランを酸素と混合し、2L/分で3分間
- 腹腔内は、0.3 mg/g体重で2,2,2-トリブロモエタノールを注入します。
注:ケタミン/キシラジンとは異なり、2,2,2-トリブロモエタノールは明らかな瞳孔拡張を引き起こさない。 - つま先のピンチに対する応答の欠如と、ひげや尾部の動きの欠如をチェックして、麻酔強度を決定します。
- 手術用プラットフォーム上の横の位置にマウスを置きます。処置の間に感受性を減らすために、注射の前に角膜に0.5%のプロパラカイン塩酸塩の1滴を適用する。
- 32 Gのパラセンテシス針を、辺縁から約0.5mm離れた側頭象で切開します。
- 前房に突き刺す前に、角膜の層を約0.3mmトンネルで貫通する。レンズや虹彩に触れないように注意してください。
- 針をゆっくりと引き出し、トンネル(パラセンテシス)を通して前房からいくつかの水性ユーモア(約1−2°L)を放出します。
- IOP をさらに減らすには、~8分間待ちます。これは、対向的な、コントロール眼を測定することによって決定することができる。
- 角膜トンネルを通してSOをプリロードしたガラスマイクロピペットを前房に挿入し、面取りを虹彩面に向けます。
- シリンジプランジャーをゆっくりと押して、SO液滴が虹彩表面の大部分(直径約2.3−2.4mm)を覆うまで、前房にSOを注入します。
- マイクロピペットを前房に10個入れたままゆっくりと引き出してください。
- SO漏れを最小限に抑えるために、上部まぶたをゆっくりと押して角膜切開を閉じます。
- 眼表面に抗生物質軟膏(バチトラシン-ネオマイシン-ポリミキシン)を塗布する。
- 処置を通して、頻繁に人工涙で角膜を湿らせた。
- 麻酔から完全に回復するまで、加熱パッドの上にマウスを保持します。
3. SOの除去
- 灌漑システムを準備します。
- 製造元の指示に従って灌漑ソリューションを準備し、灌漑ボトルに入れます。灌漑ソリューションボトルを手術用プラットフォームの上の110−120 cm(81−88 mmHg)に引き上げます。
- 灌漑液ボトルにIV管理セットを取り付けます。IVチューブから気泡を取り除きます。33 G針を20°の面に接続してIVチューブに接続します。
- 排水システムを準備するには、1 mLシリンジからプランジャーを取り外します。33 G針を注射器に取り付け、針を20°に曲げる。
- 前房からSOを取り外します。
- 腹腔内注射 2,2,2-トリブロモエタノール (0.3 mg/g 体重).つま先のピンチに対する応答の欠如をチェックして、麻酔強度とウィスカーまたは尾部の動きの欠如を判断します。
- マウスを手術用プラットフォームに置き、テープで横の位置に固定します。0.5%の塩酸プロパラカインを角膜に1滴塗布し、感度を低下させます。
- 所定の32 Gのパラセンテシス針を使用して、SO液滴の端で〜2と5時の間に角膜の側頭象に2つの切開を行います。
- 1つの角膜切開、最高速度を介して灌漑溶液に接続された33 G灌漑針を挿入します。
- 他の角膜切開部を通してプランジャーなしでシリンジに取り付けられた別の33G排水針を挿入し、灌漑溶液を灌漑しながら、SO液滴が前房を出るようにします。
- 排水針を引き出し、次に灌漑針を引き出します。
- 気泡を前房に注入して通常の深さを維持し、角膜切開部を閉じるために押す。
- 両方の眼に抗生物質軟膏を塗布する。
- 麻酔から完全に回復するまで、加熱回復パッド上でマウスを維持します。
4. 週1回のIOP測定
- 3%のアイソフルランを酸素と混合した誘導室にマウスを3分間置きます。
- 腹腔内注射キシラジンとケタミン (0.01 mg キシラジン/g, 0.08 mg ケタミン/g).
- 手順全体を通して人工涙を適用することにより、角膜の湿った保湿を保ちます。
- 瞳孔が完全に拡張できるように約15分間待ちます。
- 製品の指示に従って、眼のIOPを測定します。マウスの目の近くに眼計を持って来てください。プローブの先端からマウス角膜までの距離を約3~4mmに保ち、測定ボタン6xを押して1つの読み取り値を生成します。平均IOPを取得するために、各眼から3つの機械生成測定値が得られます。
- SO注射後8週間で動物を犠牲にし、全マウント網膜の免疫ヒストケミストリー、RGCカウント、視神経(ON)半薄切片、および13以前に記載されている生存軸索の定量を行う。
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Representative Results
注射の直後に、SO液滴が小さすぎ(≤1.5mm)13のために安定した眼圧を産生しないマウスを容易に同定できる。これらの動物は、その後の実験から除外されます。注射手順に従って、SO注射マウスの80%以上が1.6mmを超える液滴で終わる。これらのマウス眼のIOPを1回のSO注射後8週間、週に1回測定した。眼を受けるSOのIOPは高いままで、一般に対側対照眼のIOPを2倍にし、有効な瞳孔遮断を示す(図1)。マウス角膜の浮腫は、通常回収に2~3日かかるカメラ内注射後、光解剖顕微鏡で検査することができる。瞳孔拡張には時間がかかり、IOP測定を行う前に瞳孔拡張を待たなければなりません。したがって、注射後の IOP の測定が早すぎないようにしています。同じ理由で、IOP を頻繁に測定することはお勧めしません。別のマウス群を用いて、SO注射の2週間後に前房からSOを洗い流し、IOPを測定する前に角膜が回復するのをもう1週間待った(図1)。
SO注入によって引き起こされる眼高血圧がRGCに及ぼす影響を調べ、SO注入後8週間でPPD染色16によりRBPMS染色14、15及びONセミチン断面における生き残った軸索により網膜全山の周辺領域における生存RGCソマを定量した。緑内障RGC死と軸索変性は、SO誘発性眼高血圧の検出力不足(SOHU)において劇的であった(図2)。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。
図1:SO除去の有無にかかわらず、SO目および対照眼におけるIOP測定。SO = SO注入された目;CL = 対国間制御眼。データは平均±S.E.M,n=12として提示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SOHUにおける緑内障RGCソーマおよび軸索変性を示す上部パネルは、全装着網膜のSO注入後8週間でRGC(RBPMS+,赤色)を示す周辺領域を示す。スケールバー = 20 μm. 下部パネルは、SO注入後8週間でPPDで染色されたONの断面の半薄い画像を描いています。スケールバー = 10 μm. (B) 末梢網膜における生存RGCの定量データ (n = 12) と ON (n = 10) の軸索は、反定対照(CL)眼と比較して8週間後にSO注射後8週間で行われた。データは平均 ± S.E.M. ****: P < 0.0001 として表示されます。学生のペアtテスト。RGC = 網膜神経節細胞;ON = 視神経。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、SOのカメラインスインジェクションによってマウスの目に持続的なIOP上昇を誘導するための簡単で効果的な手順を示します。この手順は顕微鏡の下のマイクロディセクションの経験を持つ誰によってすぐに学ぶことができる。障害の主な潜在的なリスクは、角膜切開からのSOの漏出です。しかし、SOを用いた利点の一つは、油滴が目に見えて測定可能であるため、小さすぎて注射後すぐに安定した眼圧を誘発するマウスを簡単に特定し、その後の実験から除外できることです。我々は日常的に80%の成功率を達成し、小さなSO液滴(≤1.5mm)13のためにマウスの約20%を除外した。しかし、角膜の層内に比較的長いトンネル(0.3mm)を作って、角膜をベベレージ先端で前房に浸透させることができる経験豊富な外科医は、角膜トンネルの内側の開口部を外側の開口部よりもはるかに小さくすることで、SO漏出をほとんど防ぐことができます。そこで、ほぼ全てのマウスに1.8mmを超えるSO液滴を注入した。トンネルの長さに加えて、他のいくつかの重要なポイントは強調する価値があります。まず、注射された眼のIOPを低く保ち、前房からSOを押し出さないようにすることが重要である。一般的な間違いの 1 つは、SO を注入しすぎて漏れが容易になる場合です。前房内のSOの体積を制限し、虹彩表面をほぼ完全に覆うわけではないようにします。このSO液滴の直径は約2.3−2.4mmである。第二に、角膜トンネル切開は、虹彩に近づくことを可能にするために、四肢にできるだけ近づけられるが、虹彩が容易に切開を取ることができるようにする。第三に、射出速度は、前房へのSOの過度のオーバーフローを避けるために、できるだけ遅くする必要があります。第四に、注射後の上眼瞼マッサージは角膜切開を閉じるのを助け、時には角膜切開を閉じ、したがって油漏れを避けるために末梢虹彩の前体のシネキアーを助ける。
IOPは眼の後部のみで増加しているが、前房では増加しておらず、このモデルのユニークな特徴である。瞳孔ブロッキングは、前房への水性ユーモアの流入を防ぎ、従って後部のみでIOPを増加させる。SOによって形成された物理的な障壁は、虹彩および大きな眼レンズと共に、後部セグメントから前房を切り離し、水性物質が蓄積する後部セグメントでのみIOPの標高を制限することがある。マウス瞳孔が膨張後のSO液滴よりも大きい場合、前房と後室が再接続され、水性洪水によって前房内のIOPの迅速な増加が可能になります。したがって、眼計は瞳孔ブロックを除去した後にのみ増加したIOPを検出することができるので、後部セグメントの真のIOPは間違いなく過小評価されています。そこで、このモデルをSO誘発性眼高血圧過少検出モデル(SOHU)と名付け、モデルのこの重要な特徴をより正確かつ有用に反映した。後部セグメントのIOPを直接測定できるのが最善ですが、今のところはできません。SOHUモデルのこのユニークな病因は2つの有利な特徴を有する:第一に、実験眼は視覚機能および形態の生体内評価を可能にする明確な眼要素を有し、第二に、重度の緑内障神経変性神経保護剤を検査するあらゆる利点を検出することができます。
SO注射は角膜浮腫を一時的に引き起こす可能性があり、IOP測定を早すぎたり頻繁に行わないことをお勧めします。SOHUの眼の前房や角膜の炎症は検出されなかったが、SO注射を受けた100匹以上のマウスで角膜新血管形成の2つの例に遭遇した。
SOはヒト患者とマウスの両方で眼高血圧を引き起こすので、この概念的に新規かつ実質的に有意な緑内障モデルは、前臨床用途に適したより大きな動物に適応することができると仮定するのが妥当である。このモデルの神経機能と形態の欠陥の特徴は確かに緑内障に関する重要な質問を追求するためにそれを利用する他の研究者を奨励し、さらに広く、RGCとONを誘発する疾患変性。
要約すると、これは特別な装置や繰り返し傷害を必要とせず、他の動物種に適用可能である可能性がある簡単な動物緑内障モデルです。興味深いことに、SOHUモデルのIOP上昇は、前房から油を除去することによって逆転することができ、したがって、IOP低下療法と組み合わせた神経保護治療をスクリーニングするのに有用である。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、NIHがYHに対するEY024932、EY023295、およびEY028106を付与することによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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