Summary
Разработка моделям мурин с специфическими генами, мутировавшими у больных раком головы и шеи, необходима для понимания неоплазии. Здесь мы представляем протокол для преобразования в пробирке первичных клеток языка мурина с помощью адено-ассоциированной системы вирус-Cas9 для генерации линий клеток murine HNC с конкретными геномными изменениями.
Abstract
Использование первичных нормальных эпителиальных клеток позволяет воспроизводимо вызывать геномные изменения, необходимые для клеточной трансформации, вводя специфические мутации в онкогены и гены супрессоров опухолей, используя кластерные регуляторные межпространственные краткое палиндромическое повторение (CRISPR) на основе технологии редактирования генома у мышей. Эта технология позволяет нам точно имитировать генетические изменения, которые происходят в раковых заболеваний человека с использованием мышей. Путем гениально преобразовывая первичные клетки murine, мы можем более лучше изучить развитие рака, прогрессирование, обработка, и диагноз. В этом исследовании мы использовали Cre-индуцированных Cas9 мышь язык эпителиальных клеток для редактирования генома с помощью адено-ассоциированного вируса (AAV) в пробирке. В частности, путем изменения KRAS, p53, и APC в нормальных эпителиальных клеток языка, мы создали морин головы и шеи рака (HNC) клеточной линии в пробирке, которая опухолевых в сингенных мышей. Представленный здесь метод подробно описывает, как генерировать линии клеток HNC с конкретными геномными изменениями и объясняет их пригодность для прогнозирования прогрессирования опухоли у сингенных мышей. Мы предусматриваем, что этот перспективный метод будет информативным и полезным для изучения биологии опухоли и терапии HNC.
Introduction
HNC является распространенной злокачественной во всем мире1. Моделирование генезиса HNC неоплазии в настоящее время на научном поворотный момент2. Хотя многие генетические мутации были выявлены в HNC2,3,4 (например, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 и RAS) конкретные комбинации геномных изменений, необходимых в согласии, чтобы побудить HNC остаются неясными.
Текущее использование человеческих линий клеток HNC значительно помогло выяснить механизмы, связанные с патогенезом илечением 3. Тем не менее, изучение человеческих клеточных линий в иммунокомпромиссных систем мурин имеет свои ограничения, потому что эти системы не касаются неопластического процесса in vivo, роли специфических генных мутаций и реакций на лечение в иммунной микросреде. Таким образом, развитие и создание линий моринных клеток с конкретными генетическими изменениями имеют первостепенное значение для изучения того, как различные гены способствуют процессу трансформации и для тестирования новых молекул на основе терапии в иммунокомпетентных мышей.
Исследования функции генов в биомедицинских исследованиях были значительно затронуты достижениями в технологиях редактирования ДНК, путем введения двухструнных перерывов (DSB), например5. Эти технологии, в том числе использование цинковых пальцев nucleases, транскрипции активатор-как эффектора nuclease, и кластерных нормативных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR/Cas9), позволяют манипулировать любым геном, представляющим интерес на его локуса. Последние системы CRISPR/Cas9 состоят из направляющей РНК (gRNA), которая направляет нуклеазу Cas9 для создания DSB на определенном участке в геноме. Эта система получила широкое признание в изменении эндогенных генов в любой клетке или целевой ткани, даже в самых традиционно трудно поддающихся лечению организмов5. Он имеет множество преимуществ по сравнению с другими системами из-за своей простоты, скорости и эффективности.
В онкологии технология CRISPR/CAS9 выполнила потребность эффективно имитировать раковые клетки. Чтобы установить эту систему в HNC, мы манипулировали мощным онкогеном KRAS и двумя важными генами супрессора опухоли, APC и p536. Согласно базе данных GENIE7, эта комбинация встречается редко в HNC. Мутации РАН (HRAS, NRAS и KRAS) присутствуют лишь в 7% всех популяций HNC. Эти опухоли, как правило, устойчивы к терапии8,9.
Доставка Cas9 и его gRNA достигается с помощью вирусной трансдукции с использованием либо AAVs или лентивирусов. Рекомбинантный AAV часто является предпочтительным методом доставки генов в клетки-мишени из-за его высокого титра, мягкий иммунный ответ, способность преобразовывать широкий спектр клеток, и общая безопасность. С помощью системы AAV были созданы различные тканевые линии клеток мыши, и новые клеточные линии все еще разрабатываются10,11,12. Тем не менее, эффективная система геномного редактирования, которая может генерировать моделя линии клеток murine HNC, еще предстоит разработать. В этом исследовании мы стремились разработать систему AAV-Cas9 на основе in vitro для преобразования первичных клеток языка мурин в опухолевое состояние. Этот уникальный протокол преобразования CRISPR/Cas9 и установленная линия опухолевых клеток могут быть использованы для лучшего понимания биологии HNC, вызванной разнообразием геномных изменений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Бен-Гурион университета Негев животных по уходу и использованию комитета. Эксперименты на животных были одобрены МАКУК (IL.80-12-2015 и IL.29-05-2018 (E)). Все аспекты тестирования на животных, жилья и экологических условий, используемых в этом исследовании были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных13.
1. Производство адено-ассоциированных вирусов
- День 1: Клеточная культура
- Семена 4 х 106 HEK293T клеток на 14,5 см пластины в 15 мл DMEM. Приготовьте 10 пластин для трансфекции полиэтилениным (PEI) (1 мкг/Л).
- День 2: Трансфекция клеток HEK293T с использованием PEI
- Удалите носители и покормите теплым DMEM 1 ч перед трансфекцией.
- Претеплые трансфекционные реагенты и DMEM.
- Используйте 10 мкг плазмиды интереса, содержащего AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 мкг AAV 2/9n капсид плазмида (с геном rep AAV2 и геном крышки AAV9, и 10 мкг помощника плазмида (pAdDelta F5 помощник) на тарелку (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Новое поколение помощник плазмида - pAdDeltaF614,15,16, которые также могут быть использованы для производства AAV доступна. - Смешайте плазмиды в 1 мл простой DMEM на тарелку. Затем добавьте 90 л полиэтиленина (общая плазмида: концентрация PEI 1:3) в плазмидную смесь и вихрь кратко.
- Инкубировать смесь ДНК PEI-плазмида в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
- Добавьте смесь dropwise поверх клеток HEK293T и перенесите пластины в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.
- День 3: Средние изменения после трансфекции
- Удалить среду полностью и добавить 15 мл свежего DMEM.
- День 5: Сбор вируса
- Приготовьте сухую ледовую/этаноловую ванну.
- Соберите клетки с помощью клеточного скребока и перенесите их в трубки 50 мл (2 пластины на 50 мл трубки).
- Спиновые трубки при 800 х г в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта из всех труб. Добавьте 0,5 мл буфера лисиса (150 мм NaCl, 50 мм Tris-HCl, рН 8,5) на тарелку (т.е. 5 мл для 10 пластин) только к первой трубке. Приостановите работу клеток и перенесите общий объем на следующую трубку и продолжайте до последней трубки.
- Перенесите подвеску ячейки на свежую трубку 50 мл. Вымойте трубки с тем же объемом буфера лисиса (0,5 мл на тарелку) с помощью того же метода передачи, как описано в шаге 1.4.4.
- Обязать суспензию клеток до трех раундов циклов замораживания/оттепели на 10 мин между сухой льдом/этаноловой баной и водяной баной 37 градусов. Вихрь кратко после каждого оттаивания.
- Если очистка осуществляется в тот же день, установите буфер равновесия и elution (см. таблицу 1 для рецепта) на RT.
- Добавьте 50 единиц бензоназы на тарелку и инкубировать при 37 градусах по Цельсию за 1,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бензоназиспользуется используется для переваривания остаточных нуклеиевых кислот из клеток производителя хозяина и плазмидной ДНК, присутствуют в клеточной подвеске. - Спин трубки на 3000 х г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия.
- Соберите супернатант в шприц с помощью 18 G стальной иглы и нажмите раствор через фильтр 0,45 мкм в трубку 15 мл для получения сырого лизата.
- Храните сырой лизат при 4 градусах Цельсия в течение нескольких недель до очистки или продолжения очистки.
2. Очистка AAV
- День 5 или позже
- Поместите буфер равновесия и улюдовимы на RT.
- Вымойте столбцы хроматографии с 10 мл буфера равновесия.
- Добавьте 0,5 мл на тарелку гепарина-агарозы в столбец17, а затем добавьте буфер равновесия (4x объем гепарина-агарозы). Смешайте решения, инвертируя столбец и пусть осадок агарозы.
- буфер равновесия из колонны гравитацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте некоторый буфер равновесия, чтобы предотвратить высыхание агарозы. - Загрузите сырой лисат на колонку и инкубировать в течение 2 ч при 4 градусах Цельсия с постоянным возбуждением. Доведите столбец в вертикальное положение и дайте агарозе осадок.
- Выявите сырой лизат под действием силы тяжести.
- Вымойте столбец с буфером равновесия (4x объем гепарина-агарозы).
- Поместите 100 kDa центробежный фильтр белка ниже столбца и утилизировать вирус с помощью elution буфера (3x объем гепарина-агарозы) в фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: буфер elution не должен превышать 15 мл. - Centrifuge фильтр на 3000 х г в течение 30 минут до менее 1 мл остается в фильтре.
- Заполните фильтр PBS и центрифугу на 3000 х г в течение 30 минут до тех пор, пока менее 1 мл остается в фильтре. Повторите этот шаг 2x, чтобы удалить все соли.
- Сосредоточьтесь на вирусном растворе в фильтре путем центрифугирования при 3000 х г, чтобы достичь максимально небольшого объема (менее 200 л).
- Аспирируй раствор вируса с помощью иглы и шприца и проталкивай раствор через фильтр 0,22 мкм в трубку.
- Сделать aliquots концентрированных вирусных частиц для хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты должны быть 20 евро для кратковременного хранения при 4 градусах цельсия и 5 градусов по Цельсию для длительного хранения при -80 градусов по Цельсию. - Определите эффективность вирусного титра и вирусного трансдукции, как описано ранее14,18,19,20.
3. Изоляция и культура первичных клеток
- День 1
- Эвтаназия 6-недельный мужчина или женщина B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9", -EGFP)Феж/J по CO2 удушья или любой другой протокол IACUC утвержденных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти CRISPR / Cas9 knockin мышей Cre рекомбиназы зависимых выражение cas9 эндонуклеазы и EGFP режиссер CAG промоутер. Восходящая последовательность Lox-Stop-Lox (LSL) в геноме этих мышей предотвращает экспрессию Cas9 и EGFP в отсутствие рекомбиназы Cre. При использовании в сочетании с одним руководством РНК (sgRNAs) и Cre источник, они позволяют редактирования одного или нескольких генов мыши in vivo или ex vivo14. - Вскрыть язык от эвтанированных мышей с помощью хирургических ножниц.
- Вручную разъединяют ткани, разрезая ткань языка на очень маленькие фрагменты с помощью скальпеля. Соберите фрагменты ткани в трубке 15 мл, содержащей 4,5 мл rpMI простой среды (с из сыворотки).
- Добавьте тройную ферментную смесь (200 л) (см. таблицу 1 для рецепта) к фрагментам ткани.
- Инкубировать ткани-фермента смесь на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут и нажмите трубку каждые 10 минут для повышения ферментативной диссоциации ткани.
- Добавьте 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), содержащие HBSS/PBS, в смесь ткани-фермента, чтобы остановить действие фермента.
- Фильтр выше указанной суспензии клеток через стерильную 70 мкм нейлоновой сетки, чтобы отделить рассеянные клетки и большие фрагменты ткани.
- Вымойте фильтрованную подвеску ячейки центрифугированием в течение 300 х г в течение 5 мин в HBSS/PBS на RT.
- Приостанавливайте пеллеты в культурной среде (10% FBS в RPMI/DMEM) и выращивайте в 60 мм культурных блюдах до тех пор, пока не образуются отдельные клеточные колонии.
- Культурные агрегаты клеток, сохраненные на верхней части фильтра в 60-мм культурном блюде, содержащем 3 мл полных носителей (10% FBS в RPMI/DMEM) до формирования клеточных колоний.
- Микроскопически исследуют первичные клетки на наличие фибробластного загрязнения после 1 недели культуры. Лечить первичные клетки, разработанные из агрегатов и клеточных суспензии с 0,25 трипсина 0,02% EDTA решение на 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин, чтобы удалить фибробласты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно первичная культура из клеточных агрегатов производит больше колоний по сравнению с одноклеточными суспензиями. Клетки из этих колоний обеспечивают лучшую эффективность трансдукции с трансдукцией AAV.
- Эвтаназия 6-недельный мужчина или женщина B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9", -EGFP)Феж/J по CO2 удушья или любой другой протокол IACUC утвержденных.
4. Трансдукция AAV первичных клеток
- День 10
- Семена 2 х 105 первичных клеток на скважину в 6 скважинных пластинв в 2 мл полного носителя (10% FBS в RPMI / DMEM).
- На следующий день преобразуем клетки с 1012 вирусными геномами/мл (1010 преобразующих единиц/мл) и инкубируют клетки в вирусных частицсодержащих носителях 48 ч при 37 градусах Цельсия.
- Удалите вирусные частицы, содержащие носители и кормите AAV-трансиндуцированные клетки с полными носителями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только клетки, которые подверглись трансдукции будет выражать GFP и начать размножаться. Клетки, которые не подверглись трансдукции в конечном итоге умрет в течение 2 недель. - После 2 недель расширения культуры, семена клеток для проверки и in vivo опухолевых экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная ДНК из клеток-трансиндуцированных AAV и нормальных первичных клеток мышей Cas9 были извлечены для проверки конкретного редактирования генома с помощью стандартных протоколов. Секвенирование извлеченной ДНК и анализ секвенированных данных(таблица 2)были выполнены с использованием гибридизации захвата основе следующего поколения секвенирования анализа (например, MSK-IMPACT платформы), как описано ранее21.
5. Проверка преобразования нормальных клеток в опухолевые клетки с использованием иммунофлуоресценции и западного промотирования
- Иммунофлуоресценция
- Семена 2 х 105 ячеек на 12 мм стекла охватывает и поместить их в инкубатор на ночь.
- Исправить клетки в 4% параформальдегида в PBS (pH 7.4) и процесс для иммунофлуоресцентности маркировки.
- Инкубировать фиксированные клетки с первым первичным антителом в 1% BSA или 1% сыворотки в PBST в увлажненной камере в течение 1 ч на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия. Основными антителами, используемыми являются кролик моноклональных анти-KRT 14, кролик моноклональных анти-E-кадхерин антитела, и Cas9 мыши mAb.
- Удалите основной раствор антитела из крышки путем мытья клеток 3x в течение 5 мин с 1x PBS.
- Инкубировать клетки с Cy3 осла анти-кролик IgG и / или Cy3 коза анти-мышь IgG вторичных антител в 5% BSA в PBST в течение 1 ч на RT в темноте.
- Удалите вторичный раствор антитела из крышки и мыть клетки 3x, как описано в шаге 5.1.4.
- Смонтировать крышки с каплей монтажа среды, содержащей DAPI (DAPI Fluoromount).
- Хранить в темноте при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока слайды не будут изображены с помощью флуоресценции микроскопии.
- Западный промотирование
- Семена 1 х 106 преобразованы клетки в 100 мм культуры блюдо и поместить их в инкубатор на ночь.
- Вымойте и соскребите преобразованные клетки в 200 л ледяной PBS.
- Centrifuge трубки, содержащей клеточной подвески в течение 10 минут при 2000 х г при 4 кв С, чтобы гранулировать клетки.
- Аспирировать супернатант и лиза клетки с помощью буфера лисиса (см. Таблица 1), содержащий кисфатазные ингибиторные коктейли и ингибитор протеазы в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Центрифуги лизаты в течение 10 минут при 10000 х г и 4 кв и собирать очищенные лисаты.
- Используйте коммерчески доступный набор анализов Bradford для определения концентрации белка в соответствии с протоколом производителя. Используйте 4x образец буфера (500 мм Tris pH 6,8, 40% глицерола, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% бромофенол синий) для регулировки образцов белка до 0,5 или 1 мкг / квитер при температуре 96 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 градусах Цельсия или до проведения анализа западной подьении. - Отдельно равное количество общего лизата (30 мкг) на 10% натрия додецил сульфат-полиакриламид гель электрофорес (SDS-PAGE). Убедитесь, что краситель достигает нижней части геля. Перенесите белок в нейлоновую мембрану полусухим блоттингом при 25 В в течение 30 мин.
- Налейте 5% BSA в Tris-буферизированный солен (TBS)-0.1% Tween (TBST) над мембраной, чтобы покрыть его полностью. Блок мембраны в течение 1 ч на RT. Инкубировать mebrane с первичными антителами (анти-Cre, анти-Cas9, анти-GFP, анти-я капенин, анти-p53, анти-фосфо-ERK, и анти-актин разбавленный в 5% BSA TBST) на 4 кС в одночасье.
- После инкубации, мыть мембраны в течение 10 мин с 1x TBST убедившись, что раствор охватывает мембрану полностью. Выполните эту стирку 3x, а затем добавить хрен peroxidase (HRP)-конъюгированных вторичных антител (разбавленных 1:10000 в 5% BSA TBST) в мембрану. Инкубировать 1 ч на RT.
- После инкубации, мыть мембраны в течение 10 мин с 1x TBST убедившись, что раствор охватывает мембрану полностью. Выполните хемилюминесценционную визуализацию (см. Таблицу Материалов),чтобы разоблачить полосы и соответственно захватить изображения.
- Проверка опухолевого потенциала преобразованных клеток у иммунокомпетентных мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши поддерживались и лечились в соответствии с институциональными руководящими принципами Университета Бен-Гуриона в Негеве. Кивок. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) и C57BL/6 мышей были использованы для исследования in vivo. Мыши были размещены в воздух-фильтрованных ламинарных шкафов потока с 12 часов света / темного цикла и кормили пищу и воду ad libitum.- Используйте 6-8 недельную самку NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) и C57BL/6 мышей для исследования.
- Трипсинизуйтесь AAV-Cas9 преобразованных клеток. Остановите трипсинизацию с помощью DMEM, предварительно разогреваемого при 37 градусах Цельсия, и соберите в трубке 50 мл.
- Центрифуги трубки на 800 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и resuspend клеточной гранулы в dMEM среде без FBS. Выполните центрифугацию снова и повторной концентрации клеточной гранулы в 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите клетки в 1x PBS слишком долго. Всегда держите клеточную подвеску на льду, чтобы предотвратить слипание клеток. - Используйте автоматический счетчик клеток для подсчета клеток и разбавить клетки до нужной концентрации (2,5 х 107 ячеек/мл) с помощью 1x PBS. Генерировать опухоли через подкожную инъекцию AAV-Cas9 преобразованы клеточной подвески в правом фланге каждого NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) мышь (2 x 106 ячеек/мышь). Для создания ортотропической модели у сингенных мышей вводят 0,5 и 106 первичных клеток или AAV-Cas9, преобразовав клетки в язык иммунокомпетентных мышей C57BL/6.
- Эвтаназия животных 2 недели послеинъекции CO2 асфиксии, и вскрыть опухоли от эвтаназии мышей для иммуногистохимии анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование системы AAV для преобразования нормальных ячеек Cas9
Рисунок 1 содержит подробную векторную карту трансгенной плазмиды AAV, используемой в данном исследовании. На рисунке 2 описывается конструкция и работа системы AAV-Cas9. Для производства вирусных частиц клетки HEK293T были трансфицироваться трансгенным вектором AAV и другими векторами вирусной упаковки с помощью метода трансфекции PEI. После трансфекции, вирусосодержащие клетки были собраны и лисицированы, и с помощью процесса очищения гепарина-агарозы, вирусные частицы были очищены и концентрированы(рисунок 2A). Эти очищенные вирусные частицы были использованы для преобразования в пробирке первичных клеток, изолированных от мышей Cas9, чтобы проверить эффективность. В нашей системе, AAV трансгенной экспрессии кассета вводится через гомологичную рекомбинацию в Cre-зависимый Cas9 Rosa26 шаблон ориентации в клетках мыши, которые несут вездесущий CAG промоутер (pCAG), LoxP-Stop-LoxP кассета (LSL), генCas9 nuclease, самовыделение P2A пептид, и рефоген (EGFP) Активность рекомбиназы прецизионных ячеек акционирует LSL и вызывает экспрессию Cas9 и GFP(рисунок 2B). Активность nuclease Cas9 вводит двухцепочечный разрыв на целевых участках интереса, направленных через gRNAs, и помогает в редактировании генов. Система AAV, используемая в этом исследовании, помогает в доставке мультиплексированных гРНК (sgRNAs для KRAS, p53 и APC), а также в выражении онкогенного аллеля KRASG12D через гомологический ремонт (HDR) в трансиндуцированных клетках.
Рисунок 1: Векторная карта трансгенной плазмиды AAV, используемой в данном исследовании. Эта система AAV имеет основную часть AAV, которая выражает Cre рекомбиназы и три U6 инициативе sgRNAs ориентации KRAS, p53, и APC. Он также содержит KRAS G12D гомологии направлены ремонт (HDR) донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Проектирование и работа системы AAV-Cas9 при преобразовании нормальных ячеек. (A) Очертания производства и очистки частиц AAV от HEK293T после трансфектации их с AAV трансгена и упаковки плазмидов. (B) Вирусная трансдукция первичных клеток с частицами AAV и механизм, с помощью которого Cre-зависимый Cas9 выражение позволяет CRISPR редактирования и преобразования первичных клеток в опухолевые клетки. Один вектор AAV интеграции gRNAs для трех различных генов с knockin kraS G12D аллель через HDR с Cre рекомбиназы экспресс-кассета была доставлена в Cre-зависимых Cas9 мыши первичных клеток. Активность рекомбиназы в транскорпорированных клетках приводит к иссечению кассеты LoxP-Stop-LoxP и вызывает экспрессию Cas9 и GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Проверка системы AAV-Cas9 in vitro в изолированных эмбриональных клетках фибробластов мыши
Первичные мыши эмбриональных фибробластных (MEF) клетки были использованы исключительно для изучения последствий абляции генов в клеточном росте и пролиферации22. Чтобы проверить эффективность системы AAV-Cas9 в преобразовании нормальных клеток, мы преобразовали клетки MEF, изолированные от эмбрионов мыши Cas9 (E14) с Помощью AAV. Ячейки MEF были изолированы, как описано ранее23,24. MEFs из 14-дневных эмбрионов мыши Cas9 были использованы, потому что они легко культуры и преобразовывания в пробирке. Короче говоря, для преобразования MeFs через AAV трансдукции, первичные MEFs примерно на 30% слияния были признаны готовыми к трансдукции. За час до трансдуктора, MEF культуры средств массовой информации была изменена. Очищенный ААВ был оттаял на льду, а средства массовой информации meF культуры были аспирированы. Вирусный супернатант с титером в размере от 106-1014 вирусных генома /мл был добавлен в каждый колодец и инкубирован на ночь при 37 градусах Цельсия. Вирусный супернатант был удален после 48 ч, заменен на 2 мл среды культуры MEF, а затем инкубируется при 37 градусах Цельсия до выражения GFP, примерно через 5 дней после трансдукции. GFP-выражение MeFs были субкультурированы и проверены. Обратите внимание, что для этого вектора мы обнаружили, что 1012 вирусных геномов/мл (эквивалент 1010 преобразующих единиц/мл) могут эффективно трансформировать первичные клетки MEF в опухолевые МЭФ(рисунок 3А). Транс-индуцированные клетки выразили Cre, Cas9 и GFP(Рисунок 3B, C). Для доступа к опухолевому потенциалу AAV, преобразуемых клеток MEF, 0,5 х 106 клеток (первичный/AAV-трансиндуированный MEF) вводили в язык, губу и подкожно в мышах NOD-SCID. Преобразованные клетки образуют опухоли у этих мышей, по сравнению с первичной MEF, которые не образуют опухоли(Рисунок 3D-F).
Рисунок 3: Проверка и трансформация в пробирке первичных клеток MEF с использованием системы AAV-Cas9. (A) Очертания преобразования в пробирке фибробластов из эмбрионов, собранных у мышей Cas9 с использованием частиц AAV. (B) Представитель иммунофлуоресценции изображение первичных MEF и AAV-транс-индуцированных клеток MEF, показывающих выражение GFP, Cre, и Cas9. DAPI был использован для окрашивания ядра. (C) Западный blotting показывая Cre, Cas9, GFP, и q-actin в зародышевых нормальных фибробластов и генетически отредактированных фибробластов. (D) Представитель изображение опухоли языка, которая развилась в NOD-SCID мыши после введения его с преобразованными клетками фибробластов. (E) Представитель изображение опухоли губ, которая формируется в NOD-SCID мыши после введения его с преобразованными клетками фибробластов. (F) Представитель изображение фланговой опухоли, которая развилась в noD-SCID мыши после введения его с преобразованными клетками фибробластов. Стрелки указывают на опухоль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
В пробирке поколения опухолевого языка мурин эпителиальной линии клеток из первичных эпителиальных клеток языка с использованием системы AAV-Cas9
После проверки преобразующего свойства системы AAV с использованием клеток MEF, мы выделили эпителиальные клетки первичного языка от мышей Cas9 и культивировали их в пробирке. Первичные клетки языка были трансумции с AAV вирусных частиц (1010 cfu/mL), и через неделю клетки начали выражать GFP. Опухолечная трансформация эпителиальных клеток первичного языка(рисунок 4А)была подтверждена с помощью иммунофлуоресценции и западного поместья(рисунок 4В, С). Преобразованные клетки обладают повышенной КРТ 14, E-кадерин, и GFP выражение(Рисунок 4B). Опухолечная трансформация эпителиальных клеток первичного языка была подтверждена выражением GFP (т.е. cre-зависимого выражения Cas9 и GFP) (Рисунок 4C). Выражение KRT14 и E-cadherin подтверждает их эпителиальные характеристики клеток. Проверка белка подтвердила усиленный экатенин, фосфо-ЭРК и снижение экспрессии p53(рисунок 4C),что указывает на эффективное регулирование БТР и p53 и включение мутанта KRAS в клетки языка, что делает их опухолевыми. Геномный анализ путем глубокого секвенирования ДНК, выделенной из преобразованных клеток, подтвердил эффективное редактирование генов и сдвиг в кадре генов TP53 и APC системой AAV-Cas9 (таблица 2). Опухолевое свойство AAV-преобразованной линии клеток языка было дополнительно оценено путем введения его в язык иммунокомпетентных диких мышей типа C57BL/6. Преобразованные клетки языка, обозначенные как мутантные эпителиальные клетки языка (KRAS Mut EpT), эффективно образуют опухоли у мышей C57BL/6 (Рисунок 4D). Опухоли KRAS Mut EpT оценивались пероральным и челюстно-лицевым патологоанатомом по обычному гематоксилину и эозину (Н И Е) и иммуногистохимии. Опухоли продемонстрировали морфологию шпиндельных клеток с выдающимися ядерными атипиями: плеоморфизм, гиперхроматизм, гигантские ядра, несколько нуклеол, и высокая митотическая скорость с нетипичными митотическими фигурами. Были также отмечены периваскулярное вторжение и ангиовторжение. Эти морфологические особенности сопровождались очень ограниченным несуществующим воспалением, связанным с опухолью. Иммуногистохимически, неопластические клетки были цитоплазмически положительными для E-кадхерин и KRT 14, оба маркера эпителиальной ткани. KRT 14 характерна для плоского эпителия, поддерживая плоское происхождение опухолевых клеток и, таким образом, диагностику плоскоклеточной карциномы(рисунок 4E). Таким образом, этот подход обеспечивает универсальную методологию для преобразования первичных клеток in vitro с желаемым изменением гена. Кроме того, эта методология облегчает использование этих развитых клеточных линий in vivo у сингенных мышей для лучшего понимания неоплазии в реальной среде микроокружения опухоли.
Рисунок 4: В пробирке трансформация первичных клеток эпителия языка с помощью системы AAV-Cas9. (A) Схематическое представление преобразования в пробирке нормальных эпителиальных клеток, полученных из языка мышей Cas9. (B) Представитель иммунофлуоресценции изображение AAV-трансудированный язык эпителиальных клеток, показывающих выражение KRT14, E-кадерин, и GFP. (C) Западная поместье, показывающее Cas9, катенин, и фосфо-ERK upregulation с p53 уровень белка downregulation, показывая генетически отредактированные эпителиальные клетки. (D) Представитель изображение опухоли, которая развилась в языке иммунокомпетентных мышей после введения их с преобразованным языком эпителиальных клеток (KRAS Mut EpT). (E) Репрезентативные изображения секций опухолевых тканей для Н и Е, E-кадерин, и KRT 14 окрашивания на 20x и 40x увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Клеточный буфер лисиса для вирусного сбора урожая | Объем |
| 150 мМ NaCl | 876.6mg |
| 50 мМ Трис-Хл | 605.7mg |
| Используйте HCl для регулировки pH 8.5 | |
| Молекулярная вода класса | Сделать до 100 мл |
| Буфер равновесия | |
| 1 мМ MgCl2 | 9,52 мг |
| 2,5 мм KCl | 18.64mg |
| Смешайте все в PBS 1X и настроить рН до 7,2 | Сделать до 100 мл |
| Буфер элуции | |
| 0.5 M NaCl | 2,92 г |
| Смешайте все в PBS 1X и настроить рН до 7,2 | Сделать до 100 мл |
| 10X Тройной фермент фондовый решение: | |
| Коллагенеза | 1 г финального конк. 10 мг/мл |
| Гиалуронидаза | 100 мг 1 мг/мл |
| DNase | 20 000 единиц окончательного conc. (200 мг/мл) |
| PBS 1X | Сделать до 100 мл |
| Плазмидная смесь (для одной 14,5 см плиты) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10 мкг |
| AAV 2/9 капсид вектор | 10 мкг |
| помощник pAD Delta F5 | 10 мкг |
| PEI (1 г/л) | 90 л |
| DMEM | 1 мл |
Таблица 1: Рецепты буферов, используемых в данном исследовании.
Таблица 2: Данные анализа генома клеток Kras Mut EpT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько методов ранее были использованы для преобразования первичных клеток в культуре с переменной степенью успеха25,26,27,28. Большинство из этих методов используют клетки фибробласта мыши для преобразования14,17,18,19 или использовать канцерогены, такие как 4-нитрокинолин-1-оксид (4-НЗО)21,22 для разработки моделей линии моринных клеток. Использование моделей нокаутистов и трансгенных мышей также значительно улучшило наше понимание различных молекулярных путей, регулирующих развитие и дифференциацию HNC. Использование мурин устных эпителиальных клеточных линий с уникальной генетической схемой, безусловно, дополняет эти исследования, и их последующие биохимические анализы будут способствовать лечению и диагностике HNC. Тем не менее, только в нескольких докладах описано создание мыши устные эпителиальные клетки28,29,30,31,32,33 и эти клеточные линии не широко используются.
Основным ограничением этих мурин устных эпителиальных клеточных линий является то, что они не характеризуются широко на молекулярном уровне и были найдены, чтобы выразить необычные генные модели. Таким образом, ограниченное молекулярное понимание этих моделей линии клеток мурин и отсутствие эффективной методологии побудили нас использовать уникальный потенциал технологии редактирования генома AAV-CRISPR у мышей Cas9 для создания линий морин-клеток с конкретные изменения генов. В этом исследовании мы внедрили и разработали систему in vitro AAV-Cas9 для преобразования первичных морин-клеток в опухолевое состояние для подтверждения генетических изменений, которые приводят к клеткам карциномы. Мы успешно создали эпителиальные клетки моринного языка с специфическими генными мутациями с высокой эффективностью с использованием AAV-опосредованного CRISPR-индуцированного соматального редактирования соматических генов несколькими комбинациями sgRNA.
Эта методология предлагает новый экспериментальный подход для лучшего понимания клеточной автономной этиологии HNC. Начиная с мурин первичного языка эпителиальных клеток, мы смогли преобразовать такие клетки в tumorigenicity путем удаления ограниченного набора генов и введения одной мутации KRAS. Используя эту методологию, теперь можно исследовать, могут ли другие гены, которые, как известно, замешаны в других карциномы, вызвать злокачественные новообразования, которые больше напоминают HNC. Морфологические характеристики опухолей из KRAS Mut EpT подтвердили плоскоклеточный рак. Гистопатологический анализ опухолей KRAS Mut EpT у сингенных мышей связан с агрессивным биологическим поведением карциномы головы и шеи. Таким образом, можно связать генотипы раковых клеток с конкретными клиническими и гистопатологическими особенностями опухолей.
Основными преимуществами этой методологии являются способность развивать клеточные линии из первичных клеток из любого органа с использованием специфических генных мутаций и использование AAV-Cas9, что делает систему более надежной и стабильной. Эндогенная система Cas9 позволяет использовать другие генные нокауты. Основным недостатком нынешней методологии является время, необходимое для изоляции и установления первичной культуры, а также высокий титр вирусных частиц, необходимых для преобразовывания первичных клеток. Однако это можно преодолеть путем стандартизации процесса изоляции для каждого типа клеток. Проблема, требующая высокой AAV вирусный титр для эффективной трансдукции может быть решена с помощью последнего поколения капсидов и помощник плазмидов для вирусной упаковки и лучшего процесса очистки.
В будущем, лучше и более эффективной системы AAV может быть разработана и экстраполирована in vivo, чтобы сделать орган конкретных генетически модифицированных моделей опухолей. В заключение, создание линий мориновых клеток с помощью этого подхода будет служить ценным инструментом культуры клеток in vitro для проверки нескольких гипотез в контексте онкологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
М.С. является членом Консультативного совета Института бионауки, а Менарини Райче получил средства на исследования от Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics и Menarini Ricerche. М.С. также является соучредителем Medendi Medical Travel, и в последние 2 года, получил гонорар от Menarini Ricerche и ADC Pharma. Всем остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Даниэля Гитлера за предоставленную нам плазмидную плазму pAd Delta 5. Эта работа была профинансирована Израильским научным фондом (ISF, 700/16) (для ME), Американско-Израильским днациональным научным фондом (BSF, 2017323) (для ME и MS), Израильской онкологической ассоциацией (ICA, 20170024) (ME), Израильским фондом исследований рака (ICRF, 17-1693-RCA #7895). Стипендия: стипендий Алон для меня и БГУ Kreitman стипендий SJ и MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N.
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D.
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
