Summary
상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.
Abstract
심혈관 질환은 다른 모든 사망 원인을 능가하며 전 세계적으로 사망률의 31%를 차지합니다. 이 질병은 주로 급성 심근 경색의 형태로 심장 손상으로 나타납니다. 부상 다음 약간의 탄력성으로, 한 번 건강한 심장 조직은 섬유질로 대체됩니다, 비 수축 흉터 조직종종 심장 마비의 전주곡이 될. 재생 의학에서 새로운 치료 옵션을 식별 하기 위해, 연구는 타고난 재생 기능을 가진 척추 동물에 초점을 맞추고 있다. 그러한 모델 유기체 중 하나는 강력한 심근 재생으로 심장 손상에 반응하는 신생아 마우스입니다. 임상적으로 관련이 있는 신생아 마우스의 부상을 유도하기 위해, 우리는 인간의 심장에 있는 동맥 경화증에 의해 유발된 심근 경색을 미러링하는 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)을 폐색하는 수술을 개발했습니다. 심근세포 와 비 근세포 집단 내의 변화를 추적하는 기술과 일치할 때, 이 모형은 심혼 재생을 인도하는 기계장치를 확인하는 플랫폼을 저희에게 제공합니다. 상해 다음 심장 세포 인구에 있는 변경에 통찰력을 얻는 것은 한 번 2 차원 분석으로 제한되고 수시로 프로세스에 있는 조직을 손상하는 조직 단면도 와 조직학 검사와 같은 방법에 크게 의존했습니다. 더욱이, 이 방법은 세포 계의 변경을 추적하는 기능이 부족합니다, 대신 상해 반응의 단지 스냅샷을 제공하. 여기에서는 계보 추적 모델, 전체 장기 클리어링 및 3차원(3D) 전체 마운트 현미경 검사법에서 기술적으로 진보된 방법을 사용하여 심장 수리 메커니즘을 설명하는 방법을 설명합니다. 신생아 마우스 심근 경색 수술, 조직 정리 및 3D 전체 장기 이미징을위한 프로토콜을 사용하면 심근 세포 증식을 유도하는 복잡한 경로를 풀어 심장 재생을위한 새로운 치료 목표를 드러냅니다.
Introduction
심혼은 오래 포스트 유사분열 기관으로 여겨지고 있습니다, 그러나 최근 기록은 심근 세포 갱신이 대략 1%에 성인 인간 심혼에서 일어납니다1. 그러나, 심근 세포 회전율의 이 낮은 비율은 상해 다음 생기는 조직의 거대한 손실을 보충하기 위하여 불충분합니다. 심근 경색을 겪은 심장은 심근세포 약 10억 개를 잃게 되며, 종종 심부전과 갑작스런 심장 사망의 전주곡으로 쓰일 수 있습니다2,,3. 전 세계적으로 2,600만 명 이 넘는 사람들이 심장 마비로 인해 심장 질환으로 인한 피해를 되돌릴 수있는 치료법에 대한 충족되지 않은필요성이 있습니다 4.
치료에 있는 이 격차를 해소하기 위하여는, 과학자는 상해 다음 내인성 재생의 기초가 되는 진화적으로 보존한 기계장치를 조사하기 시작했습니다. 포유류 심장 재생을 연구하기위한 하나의 모델은 신생아 마우스입니다. 출생 다음 주 안에, 신생아 마우스는 심장 손상 다음 강력한 재생 반응이5. 우리는 이전에 신생아 마우스가 정점 절제술5에 따라 심근 세포 증식을 통해 심장을 재생할 수 있음을 입증했습니다. 이 기술은 신생아에서 심장 재생을 불러 일으킬 수 있지만, 수술은 인간의 심장 부상에 임상 관련성이 부족합니다. 신생아 마우스 모델에서 사람의 상해를 모방하기 위해 관상동맥 폐색을 통해 심근경색을 유도하는 기술을개발하도6. 이 기술은 좌심실 심근 에 혈액의 40%-50%를 전달하는 책임있는 좌측 전방 내림차종 동맥 (LAD)의 외과결찰을 요구합니다 6,,7. 따라서, 수술은 좌심실 벽의 상당 부분에 영향을 미치는 경색을 초래한다. 심근에 이 손상은 신생아에 있는 심근 세포 증식 그리고 심혼 재생을 자극할 것입니다5.
관상 동맥 폐색 수술은 심장 재생의 내부 작용을 밝히기 위해 매우 재현가능하고 직접적인 번역 방법을 제공합니다. 신생아 수술은 인간의 심장에 관상 동맥 동맥 경화증을 평행, 여기서 동맥의 내벽 내에서 플라크의 축적은 폐색 및 후속 심근 경색을 일으킬 수 있습니다8. 심부전 환자를 위한 치료 치료에 있는 무효 때문에, LAD에 있는 폐색은 상해9다음 년 안에 26%까지 도달하는 사망률과 연관되고, 결과적으로 "과부 제조자"로 불려졌습니다. 치료법의 발전은 심장 손상의 복잡한 생리적 및 병리학적 효과를 정확하게 반영하는 모델이 필요합니다. 신생아 마우스 심장 부상에 대한 우리의 수술 프로토콜은 연구원이 부상 후 포유류 심장 재생을 신호 분자 및 세포 단서를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
최근 연구는 세포 외 환경과 증식 심근 세포 사이의 동적 관계를 강조합니다. 예를 들어, 산후 재생 창은심장(10)을둘러싼 세포외 기질의 강성을 감소시킴으로써 연장될 수 있다. 신생아 외 세포 질성에서 생체 물질은 또한 심장 부상 다음 성인 포유류 심장에서 심장 재생을 촉진 할 수있습니다 11. 또한 수반되는 심근세포 증식은 혈관신생 반응12,,13; 신생아 마우스의 재생심장에 특이적인 부수적인 동맥 형성은 심장 재생을 자극하는 데 필수적인 것으로 나타났다12. 더욱이, 우리의 실험실은 신경 신호가 성장 인자 수준의 변조를 통해 심근 세포 증식 및 심장 재생을 조절하고, 부상 다음 염증반응14를입증했다. 이 사실 인정은 심장 상해에 응하여 비 근세포 세포 인구를 추적하는 필요를 강조합니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 계보 추적을 위한 형광 리포터 단백질의 구성또는 조건부 표현을 통합하기 위하여 형질전환 마우스 라인에 있는 Cre-lox 재조합 시스템을 이용했습니다. 더욱이, 우리는 표적 세포집단(15)의클론 팽창을 결정하기 위해 Cre 의존성, 다색 형광기의 스토컨스 발현에 의존하는 레인보우 마우스 라인으로 클론 팽창 패터닝을 결정하기 위한 고급 방법을 사용할 수 있다. 신생아 관상 동맥 폐색 수술과 계보 추적을 채택하는 것은 심장 재생의 복잡한 세포 메커니즘을 해부하기위한 강력한 도구입니다.
3차원(3D) 전체 장기 이미징으로 형광표지된 세포의 혈통을 추적하는 것은 전통적인 단면화 및 재건 기법을 사용하여 달성하기 가 어렵습니다 - 특히 신경 섬유 나 혈관과 같은 세포 집단이 취약할 때. 광학 단면에 의하여 기관의 직접적인 전체 마운트 화상 진찰이 표면 적인 세포 인구를 붙잡을 수 있는 동안, 조직 내의 깊은 곳에 있는 구조물은 접근할 수 없는 남아 있습니다. 이러한 장벽을 우회하기 위해 전체 장기 조직의 불투명도를 줄이기 위해 조직 정리 기술이 개발되었습니다. 최근에는 지질추출을통해 고정조직을 클리어하는 클리어 지질교환 아크릴아미드-혼성화 강성 이미징 호환 조직 hYdrogel(CLARITY)-기반 방법(CLARITY)에 상당한 진전이 이루어지고 있다. 단계는 또한 굴절률을 균질화하고 이후에 화상 진찰17동안 광 산란을 감소시키기 위하여 취합니다. 이러한 방법 중 하나는 활성 CLARITY이며, 이는 전기 활성을 이용하여 조직 전체에 세제를 침투시킴으로써 지질 분해를가속화한다(18). 효과적이지만, 이 조직 정리 방법은 고가의 장비를 필요로 하고 조직 손상을 일으킬 수 있으며, 심장신경(19)과같은 연약한 세포 집단과 호환되지 않는 접근법을 만드는 것이다. 따라서, 우리는 부드럽게 세제 침투를 용이하게하기 위해 열에 의존 수동 CLARITY 접근 방식을 채택, 따라서 복잡한 세포 구조의 보존에 도움20,,21.
수동 선명도는 일반적으로 활성 CLARITY 보다 덜 효율적인 것으로 생각된다 18,기술은 종종 두 가지 주요 장애물을 동반: 전체 장기 깊이 지우지 못하는 성인 조직을 취소 하는 데 필요한 시간의 광범위 한 금액. 우리의 수동적인 CLARITY 접근법은 신생아와 성인 심장 조직을 완전히 지를 수 있는 신속한 클리어링 프로세스로 이러한 장벽을 모두 극복합니다. 우리의 수동 CLARITY 조직 정리 기술은 성인 심혼을 통하여 분포된 희소한 인구를 포함하여 심장 세포 인구의 다양한 의 시각화를 허용하는 효율성에 도달했습니다. 지워진 심혼이 공초점 현미경으로 심상될 때, 발달, 질병 및 재생 도중 세포 특정 패터닝의 건축은 점등될 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 위스콘신 - 매디슨 대학의 의학 및 공중 보건 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. 모든 방법은 잭슨 연구소에서 얻은 야생 형 C57BL / 6J (B6) 및 형질전환 마우스 라인에서 수행되었다.
1. 관상 동맥 폐색 (심근 경색) 1 일 된 신생아 마우스에서 왼쪽 전방 내림차순 동맥 (LAD)의 결찰을 통해 유도6
- 1일된 신생아 새끼를 원래의 둥지 재료와 함께 깨끗한 케이지에 넣어 어머니와 분리합니다.
- 케이지의 절반을 중간 불로 설정된 가열 패드에 놓습니다. 새끼는 케이지의 가열되지 않은 쪽에 남아 있어야하며 수술 후 가열 된 쪽에만 놓아야합니다.
- 수술 현미경으로 멸균 수술 영역을 만듭니다. 멸균 수술 장비를 수집합니다(표1).
- 저체온증을 통해 강아지를 마취 : 얼음과 직접 피부 접촉을 피하기 위해 거즈에 새끼를 감싸약 3-4 분 동안 얼음 침대에 묻습니다. 발가락 핀치를 수행하여 주기적으로 마우스의 저체온증을 확인합니다. 신생아는 저체온증을 잘 견딜 수 있지만, 저체온증에 장기간 노출되면 동상과 후속 사망이 발생할 수 있습니다.
- 일단 마취되면, 테이프로 팔과 다리를 고정, 척추 위치에 수술 영역에 마우스를 배치합니다. 살균 용액으로 마우스의 수술 부위를 살균하십시오.
- 하부 가슴 부위를 찾아 작은 해부 가위로 피부에 가로 절개를합니다. 갈비뼈의 수술 보기를 넓히기 위해 드레싱 포셉으로 피부를 부드럽게 들어 올려 근육에서 피부를 분리하고 닫힌 위치에서 작은 가위로 늑간 근육을 부드럽게 누릅니다.
- 네 번째 늑간 공간(그림 1A)을찾아 날카로운 집게를 사용하여 작고 표면적인 구멍을 만들어 내부 장기에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 드레싱 집게와 늑간 근육 사이의 영역을 확대하여 무딘 해부를 수행합니다. 절개의 적절한 해부학 적 위치는 심장에 대한 적절한 접근을 위해 필수적입니다.
- 손가락을 배치하고 드레싱 집게로 늑간 공간을 열어 유지하면서 복부의 왼쪽에 증가 압력을 가하여 가슴 구멍에서 심장을 부드럽게 안내(그림 1B). 심장이 가슴 바깥쪽에 있으면 드레싱 집게를 제거하고 압력을 완화하고 심장이 늑간 근육에 쉬도록하십시오.
- LAD를 혈액이 적고 올바른 해부학 적 위치에있는 심장 영역으로 LAD를 찾습니다(그림 1C). LAD는 심혼이 수술 시작의 몇 분 안에 접근되는 경우에 현미경의 밑에 만 보일 수 있습니다.
- LAD를 6-0 봉합술로 봉합하여 LAD 결찰을 수행한다(도1D). 심근 경색을 유도하기 위해 사각형 매듭을 두 번 묶습니다(그림 1E). 심근으로 봉합사의 깊이는 다를 수 있습니다, 그러나, LAD 결찰의 적당한 해부학적인 위치는 재현성을 위해 결정적이다. LAD를 결찰 할 때, 봉합사는 LAD를 끊지 않도록 단단히 단단히 당기어야하지만 조심스럽게 당겨야합니다. 심장의 정점에 희게 즉시 볼 수 있습니다(그림 1E)
- 심장이 가슴 구멍으로 다시 미끄러 지게하십시오. 이 과정은 드레싱 집게로 부드럽게 촉진 될 수 있습니다. 늑골의 매듭과 함께 봉합을 하고 사각형 매듭을 하고 무딘 집게를 사용하여 갈비뼈의 상부 세트를 6-0 봉합사를 통과하는 동안 갈비뼈의 상부 세트를 들어 올립니다.
- 강아지의 뒷다리를 고정하는 데 사용 된 테이프를 제거합니다.
- 상부 복부에 소량의 피부 접착제를 배치하여 피부를 함께 부착하십시오. 그런 다음 하복부의 피부를 미세 한 집게로 잡고 노출 된 가슴 부위를 덮습니다. 이 어머니에 의해 거부와 식인 풍습의 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에, 새끼에 남아있는 과잉 접착제의 양을 제한합니다.
- 즉시 중간 열로 설정 난방 패드에 강아지를 배치하여 마취에서 회복을 용이하게. 주기적으로 신생아의 위치를 전환하여 신체의 모든 부분을 고르게 따뜻하게하십시오.
- 신생아가 10-15 분 동안 가열 패드에 직접 남아 있게하십시오. 일반적으로 열에 놓인 후 5 분 이내에 운동이 회복됩니다.
- 잔여 혈액을 닦고 알코올 닦음으로 접착제를 닦으소.
- 원래 케이지에서 침구로 몸 전체를 문질러 신생아에 외국 향기를 커버. 다른 수술이 수행되는 동안 가열 된 측면에 케이지에 새끼를 배치합니다.
- 모든 수술이 완료되고 새끼가 따뜻하고 이동되면 원래 중첩 물질과 함께 쓰레기를 어머니의 새장에 옮니다.
- 수술 후 30-60 분 동안 마우스를 모니터링하고 중첩 및 / 또는 그루밍에 의해 새끼의 어머니의 수용을 감시.
- 수술 다음날 아침 에 마우스를 확인하십시오. 어머니가 고민하고 새끼를 중첩하지 않은 경우, 새끼를위한 수양 어머니를 고려하십시오.
2. 패시브 선명도로 마우스 심장 지우기21,,22,,23
- 이소플루란으로 마우스를 마취시다. 발가락 핀치를 수행하여 마우스가 완전히 진정되었는지 확인합니다.
- 마우스를 깨끗한 수술 부위에 놓고 테이프로 팔과 다리를 고정시됩니다.
- 심장이 추출 될 때까지 코 콘을 사용하여 마우스에 isoflurane 침강을 유지합니다.
- 조직 집게로 xiphoid 과정 바로 아래에 모피를 잡고 하부 가슴을 열고 큰 해부 가위를 사용하여 흉곽의 폭을 가로 막는다.
- 수술 가위로 늑골 케이지의 말단 부분과 함께 잘라.
- 조직 집게로 xiphoid 과정을 파악하여 횡격막 근육을 노출. 곡면 집게를 사용하여 다이어프램을 분리합니다.
- xiphoid 프로세스의 이해를 유지하면서, 박동 심혼이 접근할 수 있는 때까지 조직을 두개골로 당깁니다.
- 구부러진 집게로 베이스의 심장을 잡고 대류와 우수한 정맥카바를 무당색 가위로 절단하여 가슴 구멍에서 심장을 해부하십시오.
- 심장이 여전히 뛰는 동안, 심장이 계속 박동할 때 심장이 피를 내뿜을 수 있도록 PBS로 채워진 페트리 접시에 하트를 넣습니다. 심근 경색은 봉합사의 배치가 LAD 결찰을위한 적절한 해부학 적 위치에 있는지 확인함으로써 확인할 수 있습니다.
- 심장이 잔여 혈액을 추방 할 수 있도록 집게로 부드럽게 심장을 짜냅니다.
- 일회용 2.5 mL 유리 껍질 바이알에 마우스 심장을 전송 2 mL의 PBS. 실온(RT)에서 10분 동안 셰이커에 심장을 배양하여 잔류 혈액을 여러 번 씻어내주세요. PBS가 명확해질 때까지 매번 PBS 솔루션을 변경합니다.
- PBS를 버리고 바이알을 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)의 2 mL로 채웁니다. RT에서 4 시간 동안 배양하십시오(그림 2A).
- 배양 후, PFA 및 바이알을 2 mL의 PBS로 버린다. RT에서 10 분 동안 쉐이커에 심장을 씻어. 세척 단계를 두 번 반복하고, 배수하고 완전히 초과 PFA를 씻어 때마다 새로운 PBS로 유리병을 작성합니다.
- PBS를 버리고 바이알을 4% 아크릴아미드 2 mL 및 0.5% VA-044 용액으로 채웁니다. 4 °C에서 밤새 배양.
- 다음날, 바이알을 37°C로 설정된 열 블록으로 3시간 동안 이송하여 중합을 수행한다.
- 새로운 유리 껍질 바이알에 심장을 전송하고 반복 단계 2.12 (PBS 세척 주기).
- PBS를 버리고 2 mL의 클리어링 솔루션으로 바이알을 채웁니다(표2). 심장이 깨끗해질 때까지 37°C에서 배양합니다. 솔루션을 교체하고 2-3일마다 신선한 클리어링 솔루션으로 리필하십시오. 정리 프로세스는 최대 몇 주가 걸릴 수있습니다(그림 2B-C).
참고 : P1 하트는 일반적으로 약 3-5 일이 걸리는 반면 P21 하트는 해결 솔루션 배양이 완료되기 까지 거의 한 달이 걸릴 수 있습니다. - PBS를 버리고 바이알을 2 mL의 PBS로 채우고 2.12 단계 (PBS 세척 주기)를 반복합니다. 바이알을 신선한 PBS로 리필하고 37°C에서 밤새 배양한다.
- 면역 염색이 수행될 경우, 단계 2.21-2.22를 건너뛰고 면역 염색을 위해 섹션 3으로 진행합니다. 내인성 형광에전적으로 의존하는 경우, 단계 2.21-2.22를 진행하고 섹션 3을 건너뜁니다.
- PBS를 폐기하고 솔루션을 굴절률 일치 솔루션(RIMS)(표3)으로변경합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 배양 후, 지워진 조직은 RT. 조직에서 RIMS 용액에 저장될 수 있다. 몇 주 동안 실온에서 RIMS에서 배양된 후 조직이 투명해져야합니다(그림 2D).
3. 선택 사항: 전체 마운트 마우스 심장의 면역 화학 염색
- RIMS 용액에서 제거된 심장을 제거하고 2mL의 PBST(0.1% 트리톤-X 100의 PBS)로 깨끗한 2.5mL 유리 병으로 넣습니다.
- RT에서 30 분 배양으로 궤도 회전에 PBST에서 심장을 3 번 씻어.
- 20% 차단 완충제(PBST에서 희석)의 2 mL에 심장을 침지하여 비특이적 항체 결합을 차단하고 RT에서 3시간 동안 회전하여 배양하여 밤새 회전으로 얼룩을 4°C로 옮김한다.
참고: 차단 완충제는 이차 항체가 제기된 종과 일치하는 정상 혈청으로 만들어집니다. - RT에서 5 분 배양동안 회전하여 PBST에서 심장을 3 번 씻어 내보하십시오.
- 1 차 항체에 심장을 담그고 (PBST로 2 % 차단 버퍼로 희석) 알루미늄 호일에 유리 유리병을 포장하여 빛 노출을 방지하십시오. RT에서 하룻밤 회전으로 인큐베이팅합니다.
참고: 이 시점부터 알루미늄 호일은 주변 광 노출로부터 보조 를 보호하기 위해 지속적으로 사용되어야합니다. - 4 °C에서 회전하여 추가로 24 시간 동안 배양하십시오.
- 1차 염색 후, 3.2단계(긴 PBST 세척 주기)를 반복하여 조직에서 언바운드 원발성 항체를 제거한다. RT에서 회전하여 밤새 배양하여 세척을 연장합니다.
- 이차 항체 빛 노출을 방지하기 위해 제한된 조명이있는 지역에서 작업하고, 이차 항체 (PBST로 2 % 차단 버퍼로 희석)에 심장을 담그고 RT에서 3 시간 동안 회전하여 배양하십시오.
- 다음날, 단계 3.2(긴 PBST 세척 주기)를 반복하여 언바운드 이차 항체를 제거한다.
- 용액을 2% 블로킹 버퍼(PBST에서 희석)로 교체합니다. RT에서 회전하여 밤새 세척하여 잔류 언바운드 항체를 제거합니다.
- 다음 날, 공초점 현미경을 사용하여 과잉 이차 항체가 제거되었는지 확인하십시오. 필요에 따라 세척을 연장하고 매일 2% 블로킹 버퍼 용액을 교체합니다. 비특이적 보조 보조가 존재하지 않는 경우 한 번 진행하십시오.
- 면역 염색된 심장을 PBS에서 4°C로 저장합니다.
- 전체 마운트 현미경 검사법 직전에 37 °C에서 RIMS 용액으로 밤새 심장을 배양하십시오. 조직이 아직 완전히 제거되지 않은 경우 추가 24 시간 배양을 연장합니다.
- 완전히 지워지고 면역이 묻은 심장을 RT의 RIMS에 보관하십시오.
4. 삭제된 마우스 심혼의 단 하나 광자 공초점 현미경 현미경 화상 진찰을 가진 3D에 있는 비 근균 인구를 가시화하십시오
참고: 마우스 하트가 배아로 수확되는 경우 섹션 4.1을 계속하십시오. 마우스 하트가 산후적으로 수확되면 섹션 4.2를 계속하십시오.
- 클리어 배아 마우스 심장 이미징
- PBS 용액으로 현미경 우울증 슬라이드를 채웁니다.
- 조심스럽게 구부러진 집게로 맑은 심장을 집어 들고 티슈를 슬라이드에 놓습니다.
- 유리 커버 슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 조직은 지금 공초점 현미경의 밑에 심상될 수 있습니다.
- 클리어 된 출생 후 마우스 심장 이미징
- PBS 용액으로 우울증 슬라이드의 챔버 의 절반을 채웁니다. 성체 마우스 심장에 맞을 수 있을 정도로 큰 챔버를 만들기 위해, 3D 프린팅 폴리프로필렌 우울증 슬라이드를 맞춤 제작하였다(도4).
- 조심스럽게 구부러진 집게로 맑은 심장을 집어 들고 조직을 챔버에 넣습니다. 챔버의 남은 부피를 PBS로 채웁니다.
- 액체의 표면이 챔버의 상단 위에 돔을 형성할 수 있도록 PBS로 챔버를 채웁니다. 커버 슬라이드를 장착합니다. 조직은 지금 똑바로 공초점 현미경의 밑에 심상될 수 있습니다.
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Representative Results
종종 가장 어려운 두 단계는 가슴 구멍에서 심장을 안내하고 LAD를 결찰하는 것입니다. 이러한 단계를 해결하기 위해, 조정은 제 4 늑간 근육 사이의 초기 펑크의 배치에 이루어질 수있다; 천자와 무딘 해부가 흉골에 너무 가깝으면 심장이 흉강을 빠져 나갈 수 없을 수 있습니다(그림 1A).
추가적으로, 좌측 복부에 증가한 압력은 이 프로세스를 촉진하기 위하여 필요할 수 있습니다(그림 1B). 합병증은 늑간 근육에 심혼을 쉬게 할 때 또한 생길 수 있습니다. 우리는 무딘 해부가 최소한의 크기로 유지되고 주로 수평 방향으로 수행 될 때 심장이 철회하지 않고 공동 의 외부에 남아 있다는 것을 발견했습니다. 이 방향은 또한 LAD(그림 1C)에대한 명확한 시각화 및 접근성을 허용합니다.
LAD 뒤에 봉합사 바늘을 배치 할 때, 표면 결찰이 최종 봉합사 배치에서 조정을위한 공간이 적기 때문에 좌심실의 전방 벽 깊숙이 침투하는 것이 좋습니다(그림 1D). LAD가 깨지기 쉽고 이 관상 동맥과 전방 벽을 분리하면 사망률이 발생할 수 있으므로 LAD 주위의 봉합사를 제어하고 꾸준한 움직임으로 수행해야합니다(그림 1E). 수술이 완료 된 후 5-10 분 이내에, 신생아는 활발하고 정상적으로 호흡해야합니다.
수동 CLARITY 프로토콜로 진행할 때, 세포 계보 추적을 위한 내인성 형광 리포터를 통합하는 마우스 라인에서 수확된 하트는 알루미늄 호일에 유리 바이알을 래핑함으로써 달성될 수 있는 빛으로부터 보호되어야한다(그림 2). 클리어링 단계 동안, 클리어링 솔루션에서 배양시간은 심장이 수확되었을 때 마우스의 나이에 따라 가변적이다. 이 단계는 전체 조직이 중앙에 변색없이 일관되게 불투명 할 때 완료됩니다(그림 2B-C). 며칠 동안 실온에서 RIMS 용액에 보관한 후 하트가 점점 투명해질것입니다(그림 2D). 조직 확장은 청산 과정에서 발생할 수 있음을 주목해야한다.
우리의 수동 CLARITY 프로토콜은 효과적인 항체 침투를 허용하고 따라서 관심단백질(들)을 라벨화하는 면역조직화학 방법과 호환됩니다. 이는 액트6bCre에서검증되었다. Rosa26tdT 형질전환 마우스는 tdTomato (tdT) 리포터 단백질로 성숙한 뉴런에 라벨을 붙인다. 심장 신경은 주로 표상이며, 일부 인구가 후두층에 거주하므로, 이 세포 집단을 내인성 리포터 신호의 재현성에 대한 증명 모델로 사용하였다(그림3A),CLARITY 전후의 단백질 형태 보존(그림3B-C). 액트6bCre의대표성과 Rosa26tdT 마우스는 불분명한 P7 심장의 신경에서 볼 수 있는 내인성 tdT 단백질 신호가 불분명하고 클리어된 tdT 면역표지 된 P7 하트둘다의 신경에서 충실하게 재발되었다는 것을보여준다(도 3). 면역표지 tdT 양성 신경에, 적색 형광 단백질(RFP) 1차 항체(토끼 다발성; 1:200 희석; 록랜드 #600-401-379)는 알렉사 플루어 488 이차 항체(염소 폴리클로날; 1:1000 희석)와 함께 사용하였다; 인비트로겐 #A-11008). 면역 염색 및 이미징 단계 동안 눈으로 맑은 심장을 시각화하기 위해 자외선 손전등은 심장을 비추는 데 잠시 사용될 수 있습니다.
그림 1: 왼쪽 전방 내림차순 동맥(LAD)의 관상 동맥 폐색을 통해 신생아 마우스에서 심근 경색의 유도. (A)단일 별표(*)로 표시된 네 번째 늑간 공간이 위치하고 무딘 해부가 수행됩니다. (B)왼쪽 복부에 압력이 가해 가슴 구멍에서 심장을 유도합니다. (C)이중 별표 (**)로 표시된 LAD는 우세한 동맥및 해부학적 위치로 식별됩니다. (D, E) 봉합사는 LAD 뒤에 통과되고 사각형 매듭은 관상 동맥 폐색 및 후속 경색을 유도하기 위하여 LAD의 주위에 묶입니다. (E)일단 완료되면, 희게는 심장의 정점에, 봉합사 아래 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: P14 마우스 심장에 대한 패시브 선명도 방법의 진행. 하트는 P14 마우스로부터 수확하였고,(A)고정, 및(B-D)패시브 CLARITY 프로토콜을 시행하였다. P14 타임포인트에서 찍은 하트의 경우, 클리어링 솔루션 배양 단계는(B)심장의 중심에 변색이 명백할 때 불완전하며, 6일 후에 볼 수 있으며,(C)심장이 고르게 불투명하게 나타날 때, 10일 후에 볼 수 있다. (D)심장이 RIMS에 저장된 후 조직이 완전히 제거됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 공초점 현미경으로 P7 마우스 하트의 전체 마운트 3D 이미징. P7 Actl6bCre의대표적인 전체 마운트 3D 이미지; Rosa26tdT 형질전환 마우스 하트는 z-스택이미지의 최대 강도 프로젝션으로 도시된다. 하트는(A)내인성 tdTomato(tdT) 형광을 수확 한 직후 (적색)(B)불분명한 심혼에 있는 tdT 양성 신경의 면역 염색(Alexa Fluor 488; 녹색) 및(C)클리어된 심혼에 있는 tdT 양성 신경의 재현가능한 면역 라벨링(Alexa Fluor; 48;48)을 표시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3D 인쇄 폴리프로필렌 우울증 슬라이드. 출생 후 심장 샘플을 이미지화하기 위해 맞춤형 우울증 슬라이드는 폴리 프로필렌에 3D 인쇄되었습니다. 슬라이드 치수는 25mm x 75mm x 1mm이며, 슬라이드 우울증은 직경이A13mm, 깊이는 6.5mm 또는(B)17mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 장비 유형 | 설명 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| 유리 병 | 캡이 있는 12 x 35mm 바이알 | 피셔 브랜드 | 03-339-26A |
| 6-0 프롤렌 봉합사 | 폴리프로필렌 봉합사 | 에티콘 (주) | 8889H |
| 날카로운 집게 | 파인 팁, 스트레이트, 4.25 in | 시그마-아드리히 | Z168777 |
| 드레싱 집게 | 해부, 4.5 in | 피셔 브랜드 | 13-812-39 |
| 바늘 홀더 | 마요 헤가르, 6 인치 | 피셔 브랜드 | 08-966 |
| 작은 해부 가위 | 30mm 절삭날 | 월터 스턴 | 25870-002 |
| 조직 집게 | 중간 조직, 1X2 치아 | 엑셀타 (주) | 16050133 |
| 큰 해부 가위 | 직선, 6in | 피셔 브랜드 | 08-951-20 |
| 이라이드크토미 가위 | 2mm 절삭날 | 정밀 과학 도구 | 15000-03 |
| 곡선 집게 | 하프 커브드, 톱니 모양, 4 in | 엑셀타 (주) | 16-050-146 |
표 1: 수술 장비.
| 클리어링 솔루션 | |||
| 시약 | 최종 | 금액 | 노트 |
| 나트륨 도데실 황산염 (SDS) | 8.0% w/v | 40g | |
| 붕산 | 1.25% w/v | 6.25 g | |
| 1 티오글리세롤 | 0.5% w/v | 5 μL/mL | 솔루션에 필요에 따라 추가 |
| 초순수 H20- 1 L 비커 400 ml를 넣습니다. SDS와 붕산을 마그네틱 교반과 섞으세요. | |||
| 6M NaOH를 사용하여 pH를 8.5로 조정합니다. 500ml와 오토클레이브에 볼륨을 가져옵니다. | |||
| 용액을 실온에서 보관하십시오. | |||
| 기타 선명도 시약 | |||
| 시약 | 최종 | 주식 | 노트 |
| Pfa | 4.0% | 16% | PBS에서 희석 |
| 아크릴아미드 | 4.0% | 40% | PBS에서 희석 |
| VA-044 | 0.5% | 10% | 솔루션에 필요에 따라 추가 |
표 2: 클리어링 솔루션 및 기타 선명도 시약.
| 시약 | 최종 | 금액 |
| 인산염 버퍼 | 0.02 M | 90 mL |
| 히스토덴츠 주 | 133.3% w/v | 120g |
| 아지데 나트륨 | 0.05% w/v | 45 mg |
| 알루미늄 호일로 감싼 250 mL 유리 미디어 병에 0.02 M 인산완충의 90 mL를 추가합니다. | ||
| 마그네틱 교반과 함께 나열된 시약에 섞으세요. 구성 요소가 밤새 용해되도록 합니다. | ||
| 소용돌이 용액 및 필터는 멸균 250 mL 유리 매체 병에 여과 시스템으로 정화. | ||
| 병을 알루미늄 호일에 싸서 실온에서 보관하십시오. | ||
표 3: 굴절률 매칭 솔루션(RIMS).
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Discussion
심근세포와 비 근세포 집단 사이의 세포 세포 상호 작용은 심장이 섬유증을 겪거나 부상 다음 수리를 받을지 여부를 결정하는 요소입니다. 발견은 신경14,후막 세포24,복막 대식세포25,동맥12,,13,및 림프내피세포(26)를포함한 다양한 세포 유형이 모두 심장 수리를 중재하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 입증하였다. 이러한 세포 계선 및 관심의 다른 쥐에 Cre-lox 및 CRISPR-Cas9 기술을 적용 하 여 개발, 질병, 그리고 재생 하는 동안 유전적으로 추적될 수 있다. 기관 정리 및 고급 현미경 검사법과 결합될 때, 비 근심세포 인구의 기여는 상해 다음 심근 재생의 세포와 분자 표적을 해명하는 문을 열어 정확하게 평가될 수 있습니다.
프로토콜의 효율은 관상 동맥 폐색 수술 동안 LAD의 일관되고 재현 가능한 결찰에 의존한다. 신생아 마우스는 저체온증에 대한 확장된 노출에 민감합니다. 따라서 수술은 정확도뿐만 아니라 몇 분 이내에 수행되어야합니다. 처음부터 끝까지 심근 경색 수술은 8 분 미만이 소요됩니다. 숙련도가 달성될 때까지 실험 생쥐와 같은 배경의 여러 쓰레기를 먼저 연습하는 것이 좋습니다.
심장 수리의 진행은 심장 기능을 측정하기 위해 심초음파를 사용하여 평가 할 수있다 (즉, 분획 단축, 배출 분획, 수축기 및 확장기 볼륨) 한 번 내에서 3 받는 사람은 수술 후 일 7 일 다시 심장을 수확하기 전에 , 21- 28 일 후 부상 사이에 제안. 심근 경색 수술 후 여러 시점에서 클리어를 위해 하트를 수집할 수 있습니다.
클리어링 단계(단계 2.17)는 심장이 수확된 마우스의 연령 및 변형에 따라 지속 기간의 변화가 발생할 수 있으며, 이는 심장 크기의 차이를 초래할 수 있습니다. B6 배경 마우스의 경우, 연령에 따른 클리어링 기간은 다음과 같이 추정됩니다: P1(7-10일), P7(14-17일), P14(21-24일), P21(28-31일), P28(35-38일). 우리의 실험실의 1 차적인 초점은 심혼 정리이지만, 우리의 수동적인 CLARITY 방법은 마우스 폐를 지우기 위해 성공적이었습니다 (게시되지 않은 결과) 우리는 그밖 기관에 광범위하게 이것을 적용하는 것에 아무 제한도 없습니다. 전반적으로, 우리의 신속한 청산 과정은 신속하고 효과적으로 조직을 정리 할 수있는 능력에 대한 높은 평가된다.
희귀 한 하위 집단에서 내인성 기자와 함께 장기에 조직 지우기 기술을 적용 할 때 합병증이 발생할 수 있음을 주목해야합니다. 조밀한 세포 집단(예: myocytes23)에서리포터 신호는 클리어링 공정에 더 저항하는 것으로 보이며, 따라서 신호는 전형적으로 유지된다; 그러나, 그밖 더 과민한 세포 인구 (심장 신경와 같은)는 머리말을 붙인 고정 또는 정리 후에 담금질하는 내인성 형광 성 단백질 신호가 있는 경향이 있습니다. 이것은 Actl6bCre에서명백해졌습니다. Rosa26tdT 리포터 마우스 모델은 P7 하트가 15분 동안 짧게 고정된 경우 강한 tdT신호(도 3A)를보였지만, 이러한 형광 신호는 클리어링 솔루션에서 1시간 또는 하룻밤 동안 침양한 후 담금질되었다(데이터는 도시되지 않음). 리포터 신호를 분실한 시나리오에서, 리포터 단백질을 표적화하는 항체 염색은 신호를 증폭시키기 위해 조직 클리어링과 호환된다(도3). 면역 표지 단계의 추가는 공액 항체가 표백저항이고 안정하고 장기적인 발현을 일으키기 때문에 광범위한 이미징을 받는 조직에 유리할 수 있다. 내인성 및 면역 염색을 통해 단백질을 추적 할 수있는 기능을 통해, 우리의 프로토콜은 독특하게 심장 깊은 곳에 거주하는 희귀 심장 세포 집단의 정확한 국소화를 허용합니다.
삭제된 심혼은 전체 마운트 3D 공초점 현미경 검사법을 사용하여 계보 추적 또는 형광 단백질 발현 분석을 겪을 수 있습니다. 공초점 현미경은 예를 들어, 형광 기(또는 공액이 있는 이차 항체)를 자극하기 위해 최적화된 레이저 라인을 갖추고 있습니다: BFP (DAPI, 알렉사 플루어 405), EGFP (FITC, 알렉사 플루어 488), DsRed (TRITC, 알렉사 플루어 546/555), 및 APC (Cy5, 알렉사 플루어 647) 405 nm, 488 nm, 561 nm, 및 683 nm. 우울증 슬라이드에 맞지 못하는 심장 샘플의 경우 - 심장이 산후 수확하는 경우 공통 - 맞춤형 우울증 슬라이드는 폴리 프로필렌에 3D 인쇄로 만들 수 있습니다. 사용자 정의 슬라이드는 현미경 우울증 슬라이드 (25mm x 75mm x 1mm)의 치수를 따라 6.5 mm 또는 17mm(그림 4)로잘 깊이를 변화시다.
리포터 세포주를 3D로 시각화하기 위해 공초점 현미경은 심장 전체에 z-stacked 이미지를 획득하도록 설정되어 있습니다. 더 큰 심혼을 영상할 때, 전체 심혼은 낮은 배율 목표조차 단 하나 z 스택한 심상에서 포착될 수 없을 지도 모릅니다. 이 시나리오에서는 서로 다른 심장 영역에서 찍은 일련의 z 스택 이미지 큰 이미지 기능을 사용 하 여 함께 스티치 수 있습니다. 이것은 적절한 대물 렌즈에 현미경을 보정하고 큰 이미지 스캔 영역에 대한 필드를 지정하여 수행됩니다. 그런 다음 z-스택 이미지는 볼륨 렌더링 프로그램 및 최대 강도 프로젝션을 사용하여 3D 재구성을 거칩니다(그림3). 획득 된 고해상도 이미지를 분석하여 표적 세포 집단의 정확한 3D 공간 세포 패터닝을 결정할 수 있습니다.
전체적으로, 이 프로토콜은 심장 수리 및 재생 중에 발생하는 동적 세포 변화를 이해하는 강력한 분자 도구를 제공합니다. 이 방법은 심근 경색을 유도하고, 전체 장기 정리를 수행하고, 세포 특이 적 집단을 추적하고, 3D 세포 패터닝을 분석하는 단계를 설명합니다. 함께, 이 기술은 조직 내의 그들의 희소한 존재 또는 위치 때문에 이전에 접근할 수 없었던 추적 세포 인구에 접근을 제공합니다. 이것은 재생 의학에 있는 치료 접근을 전진하기 위하여 가장 중요한 질문의 추가 조사를 가능하게 할 것입니다, 특히 내인성 심장 재생을 자극하기 위한 그.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 기금은 위스콘신 파트너십 프로그램 (A.I.M.)에서 UW 의과 공중 보건 학교와 미국 심장 협회 경력 개발 상 19CDA34660169 (A.I.M.)에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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