Summary
Kardiomycyttspredning etter skade er en dynamisk prosess som krever en symfoni av ekstracellulære signaler fra ikke-myocyttercellepopulasjoner. Ved hjelp av avstamningssporing, passiv CLARITY og tredimensjonale helmonteringskonfokalmikroskopiteknikker kan vi analysere påvirkningen av en rekke celletyper på hjertereparasjon og regenerering.
Abstract
Kardiovaskulær sykdom overgår alle andre dødsårsaker og er ansvarlig for svimlende 31% av dødeligheten over hele verden. Denne sykdommen manifesterer seg i hjerteskade, hovedsakelig i form av akutt hjerteinfarkt. Med liten motstandskraft etter skade, vil det en gang friske hjertevevet bli erstattet av fibrøse, ikke-kontraktile arrvev og ofte være et forspill til hjertesvikt. For å identifisere nye behandlingsalternativer i regenerativ medisin, har forskning fokusert på virveldyr med medfødte regenerative evner. En slik modell organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust hjerteinfarkt regenerering. For å indusere en skade i neonatal mus som er klinisk relevant, har vi utviklet en operasjon for å okkta venstre fremre synkende arterie (LAD), speiling en hjerteinfarkt utløst av aterosklerose i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien for å spore endringer både innen kardiomyocytter og ikke-myocytter populasjoner, gir denne modellen oss en plattform for å identifisere mekanismene som styrer hjerteregenerering. Få innsikt i endringer i hjertecellepopulasjoner etter skade en gang var sterkt avhengig av metoder som vevssnitting og histologisk undersøkelse, som er begrenset til todimensjonal analyse og ofte skader vevet i prosessen. Videre mangler disse metodene muligheten til å spore endringer i cellelinjer, i stedet gir bare et øyeblikksbilde av skaderesponsen. Her beskriver vi hvordan teknologisk avanserte metoder i avstamningssporingsmodeller, hele organrydding og tredimensjonal (3D) helmontert mikroskopi kan brukes til å belyse mekanismer for hjertereparasjon. Med vår protokoll for neonatal mus hjerteinfarkt kirurgi, vev clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veier som induserer kardiomyocyte spredning kan raknes, avsløre nye terapeutiske mål for hjerte regenerering.
Introduction
Hjertet har lenge vært ansett for å være et post-mitotisk organ, men nyere bevis viser at kardiomyocytter fornyelse forekommer i voksen menneskelig hjerte på ca 1% per år1. Imidlertid er disse lave frekvensene av kardiomycyttomsetning utilstrekkelig til å fylle det massive tapet av vev som oppstår etter skade. Et hjerte som har lidd en hjerteinfarkt vil miste rundt en milliard kardiomyocytter, ofte fungerer som et forspill til hjertesvikt og plutselig hjertedød2,3. Med over 26 millioner mennesker rammet av hjertesvikt over hele verden, er det et udekket behov for terapeutiske midler som kan reversere skadene påført av hjertesykdom4.
For å bygge bro over dette gapet i terapeutiske midler, har forskere begynt å undersøke evolusjonært bevarte mekanismer som ligger til grunn for endogen regenerering etter skade. En modell for å studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal musen. I løpet av uken etter fødselen har nyfødte mus en robust regenerativ respons etter hjerteskade5. Vi har tidligere vist at neonatalmus kan regenerere sitt hjerte via kardiomycyttspredning etter en apikal reseksjon5. Selv om denne teknikken kan fremkalle hjerteregenerering i nyfødte, mangler operasjonen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For å etterligne en menneskelig skade i neonatal musemodell, har vi utviklet en teknikk for å indusere et hjerteinfarkt gjennom en koronarokklusjon6. Denne teknikken krever kirurgisk ligation av venstre geerior synkende arterie (LAD), som er ansvarlig for å levere 40%-50% av blodet til venstre ventrikulær myokardiet6,7. Dermed resulterer operasjonen i en infarkt som påvirker en betydelig del av venstre ventrikulær vegg. Denne skaden på myokardiet vil stimulere kardiomycytt spredning og hjerte regenerering i nyfødte5.
Koronararterienokklusjonkirurgi gir en svært reproduserbar og direkte translasjonell metode for å avdekke den indre driften av hjerteregenerering. Neonatal kirurgi paralleller koronar aterosklerose i det menneskelige hjerte, hvor akkumulering av plakk innenfor de indre veggene i arteriene kan forårsake en okklusjon og påfølgende hjerteinfarkt8. På grunn av et tomrom i terapeutiske behandlinger for hjertesviktpasienter, er en okklusjon i LAD forbundet med dødelighet som når opp til 26% innen et år etter skade9, og følgelig har blitt kalt "enkemakeren". Fremskritt i terapeutiske midler krever en modell som nøyaktig gjenspeiler de komplekse fysiologiske og patologiske effektene av hjerteskade. Vår kirurgiske protokoll for neonatal mus hjerteskade gir en plattform som gjør det mulig for forskere å undersøke molekylære og cellulære signaler som signaliserer pattedyr hjerteregenerering etter skade.
Nyere forskning fremhever det dynamiske forholdet mellom det ekstracellulære miljøet og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vinduet forlenges ved å redusere stivheten til den ekstracellulære matrisen rundt hjertet10. Biomaterialer fra neonatal extracellulær matrise kan også fremme hjerteregenerering hos voksne pattedyrhjerter etter hjerteskade11. Også medkardiomyocytter proliferasjon er en angiogen respons12,13; sikkerhet arterie dannelse unik for regenererende hjertet av neonatal musen ble vist å være avgjørende for å stimulere hjerte regenerering12. Videre har vårt laboratorium vist at nervesignalering regulerer kardiomycyttspredning og hjerteregenerering via modulering av vekstfaktornivåer, samt den inflammatoriske responsen etter skade14. Disse funnene understreker behovet for å spore ikke-myocytter cellepopulasjoner som svar på hjerteskade. For å oppnå dette målet har vi benyttet oss av Cre-lox rekombinasjonssystemet i transgene muslinjer for å innlemme konstitutivt eller betinget uttrykk for fluorescerende reporterproteiner for avstamningssporing. Videre kan vi bruke avanserte metoder for å bestemme klonal ekspansjonsmønster med Rainbow-muselinjen, som er avhengig av stokastisk uttrykk for de Cre-avhengige, multifargede fluorescerende journalistene for å bestemme klonal utvidelse av målrettede cellepopulasjoner15. Å bruke avstamning sporing med neonatal koronar okklusjon kirurgi er et kraftig verktøy for dissekering intrikate cellulære mekanismer for hjerteregenerering.
Sporing av avstamning av fluorescerende merkede celler med tredimensjonale (3D) hele organavbildning er vanskelig å oppnå ved hjelp av tradisjonell snitting og rekonstruksjonsteknikk – spesielt når cellepopulasjoner er skjøre, for eksempel nervefibre eller blodkar. Mens direkte hele mount avbildning av orgelet ved optisk snitting kan fange overfladiske cellepopulasjoner, strukturer som bor dypt inne i vevet forblir utilgjengelig. For å omgå disse barrierene, vev clearing teknikker har blitt utviklet for å redusere opasitet av hele organvev. Nylig har det blitt gjort betydelige fremskritt for å fjerne lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert Rigid Imaging kompatibel Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserte metoder, som fjerner fast vev via lipid utvinning16. Det iverksettes også tiltak for å homogenisere brytningsindeksen og deretter redusere lysspredning mens bildebehandling17. En slik metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipidnedbrytning ved hjelp av elektroforese for å trenge inn i vaskemiddelet gjennom hele vevet18. Selv om effektiv, krever denne vevsfjerningsmetoden dyrt utstyr og kan forårsake vevsskade, noe som gjør tilnærmingen uforenlig med skjøre cellepopulasjoner som hjertenervene19. Dermed bruker vi den passive CLARITY-tilnærmingen, som er avhengig av varme for å forsiktig lette vaskemiddelpenetrasjon, og hjelper derfor til oppbevaring av intrikate cellestrukturer20,,21.
Passiv KLARHET er vanligvis antatt å være mindre effektiv enn aktiv CLARITY18, da teknikken ofte ledsages av to store hindringer: manglende evne til å fjerne hele organdybden og den omfattende tiden som kreves for å fjerne voksent vev. Vår passive CLARITY-tilnærming overvinner begge disse barrierene med en fremskyndet clearingprosess som er i stand til å fullstendig rydde neonatal og voksent hjertevev. Vår passive CLARITY vevingsteknikk har nådd en effektivitet som tillater visualisering av en rekke hjertecellepopulasjoner, inkludert sjeldne populasjoner distribuert over hele det voksne hjertet. Når det ryddet hjertet er avbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen av cellespesifikk mønster under utvikling, sykdom og regenerering belyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Guide for bruk og omsorg for laboratoriedyr og i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder ble utført på vill type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer hentet fra Jackson Laboratories.
1. Koronararterie okklusjon (hjerteinfarkt) Indusert via Ligation av venstre anterior synkende arterie (LAD) i 1-dagers gamle neonatal mus6
- Skill de 1-dagers gamle neonatalvalpene fra moren ved å plassere dem i et rent bur sammen med noe av det opprinnelige hekkematerialet.
- Plasser halvparten av buret på en varmepute satt til middels varme. Valpene skal forbli på den uoppvarmede siden av buret, bare plassert på den oppvarmede siden etter operasjonen.
- Lag et sterilt kirurgisk område under et driftsmikroskop. Samle sterilisert kirurgisk utstyr (Tabell 1).
- Bedøvelse av valpen via hypotermi: pakk valpen i gasbind for å unngå direkte hudkontakt med is og begrav den i en isseng i ca. 3–4 min. Kontroller hypotermi av musene med jevne mellomrom ved å utføre en tåklemme. Nyfødte tolererer hypotermibrønn, men langvarig eksponering for hypotermi kan føre til frostskader og påfølgende dødelighet.
- Når bedøvet, plassere musen på det kirurgiske området i supine posisjon, sikre armer og ben med tape. Steriliser det kirurgiske området av musen med en antiseptisk løsning.
- Finn den nedre brystregionen og lag et tverrgående snitt i huden med liten dissekerende saks. For å utvide det kirurgiske synet på ribbeina, skill huden fra muskelen ved å løfte huden forsiktig med et par dressing tang og forsiktig presse mot interkostalmusklene med den lille saksen i lukket stilling.
- Finn det fjerde interkostalrommet (Figur 1A)og foreta en liten, overfladisk punktering ved hjelp av skarpe tang, vær forsiktig så du ikke punkterer indre organer. Utfør en stump disseksjon ved å utvide området mellom interkostalmusklene med dressingtang. Riktig anatomisk posisjonering av snittet er avgjørende for riktig tilgang til hjertet.
- Før hjertet forsiktig ut av brysthulen ved å plassere en finger og legge økende press på venstre side av magen mens du holder det interkostale rommet åpent med dressingtang (figur 1B). Når hjertet er utenfor brystet, fjern dressingtang, lindre trykk, og la hjertet hvile på interkostalmusklene.
- Finn LAD som hjertetsom har mindre samlet blod og er i riktig anatomisk stilling (figur 1C). LAD kan bare ses under mikroskopet hvis hjertet er tilgjengelig innen få minutter etter begynnende kirurgi.
- Utfør LAD ligation ved å suturere LAD med en 6-0 sutur (Figur 1D). Bind en firkantet knute to ganger for å indusere hjerteinfarkt (figur 1E). Dybden av suturen i myokardiet kan variere, men riktig anatomisk posisjonering av LAD ligation er avgjørende for reproduserbarhet. Når ligating LAD, bør suturen trekkes tett, men nøye for ikke å bryte LAD. Blanching på toppen av hjertet vil bli sett umiddelbart (Figur 1E)
- La hjertet gli tilbake i brysthulen; denne prosessen kan forsiktig lettes med dressing tang. Suturer ribbeina sammen med en kirurgknute etterfulgt av en firkantet knute, ved hjelp av stumpe tang for å løfte det øvre settet av ribbeina mens du passerer en 6-0 sutur gjennom øvre og nedre sett med ribbein.
- Fjern båndet som ble brukt til å feste bakbenene på valpen.
- Hold huden sammen ved å plassere en liten mengde hudlim på overlivet. Deretter griper du huden på underlivet med fine tang og dekker den eksponerte brystregionen. Begrens mengden overflødig lim som forblir på valpene, da dette kan øke sannsynligheten for avvisning og kannibalisme av moren.
- Umiddelbart lette utvinningen fra anestesi ved å plassere valpen på en varmepute satt til middels varme. Bytt regelmessig plasseringen av nyfødte til jevnt varme alle deler av kroppen.
- La neonatet forbli direkte på varmeputen i 10–15 min. Vanligvis gjenvinnes bevegelsen innen 5 minutter etter å ha blitt plassert på varme.
- Rengjør gjenværende blod og lim med en alkoholserviett.
- Dekk utenlandske dufter på nyfødte ved å gni hele kroppen med sengetøy fra det opprinnelige buret. Plasser valpen i buret på den oppvarmede siden mens andre operasjoner utføres.
- Når alle operasjonene er fullført og valpene er varme og mobile, overfør kullet sammen med det opprinnelige hekkematerialet til morens bur.
- Overvåk musene i 30–60 minutter etter operasjonen og se etter morens aksept av valpene ved å hekke og/eller pleie.
- Sjekk på musene morgenen etter operasjonen. Hvis mor er plaget og ikke har nestet valpene, bør du vurdere en fostermor for valpene.
2. Rydde musehjertet med passiv KLARHET21,,22,,23
- Bedøve musen med isoflurane. Utfør en tåklype for å sikre at musen er fullstendig bedøvet.
- Plasser musen på et rent, kirurgisk område i supine posisjon, og fest armer og ben med tape.
- Vedlikehold isofluransedasjon på musen ved hjelp av en nesekjegle til hjertet er ekstrahert.
- Åpne den nedre brystet ved å holde pelsen like under xiphoid prosessen med vev tang og gjøre et snitt som spenner over bredden av brystkassen ved hjelp av den store dissekering saks.
- Klipp sammen med de distale delene av brystkassen med kirurgisk saks.
- Utsett membranmuskelen ved å gripe xiphoid prosessen med vev tang. Løsne membranen ved hjelp av buede tang.
- Mens du opprettholder en forståelse av xiphoid prosessen, trekk vevet kraniet til det bankende hjertet er tilgjengelig.
- Ta tak i hjertet ved basen med buede tang og dissekerhjertet fra brysthulen ved å kutte aorta og overlegen vena cava med iridectomy saks.
- Mens hjertet fortsatt slår, legg hjertet i en Petri-skål fylt med PBS slik at hjertet pumper ut blodet inni som det fortsetter å slå. Hjerteinfarkt kan bekreftes ved å kontrollere at plasseringen av suturen er i riktig anatomisk stilling for LAD ligation.
- Klem forsiktig hjertet med tang for å la hjertet utvise gjenværende blod.
- Overfør musehjertet til et engangs hetteglass med glassskall på 2,5 ml med 2 ml PBS. Vask bort gjenværende blod ved å inkubere hjertet på en shaker i 10 minutter ved romtemperatur (RT) flere ganger. Endre PBS-løsningen hver gang til PBS forblir klar.
- Kast PBS og fyll hetteglasset med 2 ml kald 4% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 4 timer ved RT (Figur 2A).
- Etter inkubasjon, kast PFA og hetteglasset med 2 ml PBS. Vask hjertet på en shaker i 10 min ved RT. Gjenta vasketrinnet to ganger, tøm og fyll hetteglasset med nye PBS hver gang for å vaske bort overflødig PFA.
- Kast PBS og fyll hetteglasset med 2 ml 4 % akrylamid og 0,5 % VA-044-oppløsning. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Neste dag, utføre polymerisering ved å overføre hetteglasset til en varmeblokk satt til 37 °C i 3 timer.
- Overfør hjertet til et nytt hetteglass med glassskall og gjenta trinn 2.12 (PBS-vaskesyklus).
- Kast PBS og fyll hetteglasset med 2 ml avregningsløsning (tabell 2). Inkuber ved 37 °C til hjertet er ryddet. Endre ut løsningen og fyll på med fersk clearingløsning hver 2–3 dag. Avregningsprosessen kan ta opptil flere uker (Figur 2B-C).
MERK: P1 hjerter tar vanligvis rundt 3–5 dager, mens P21 hjerter kan ta nesten en måned før Clearing Solution inkubasjon er fullført. - Kast PBS og fyll hetteglasset med 2 ml PBS og gjenta trinn 2.12 (PBS vaskesyklus). Fyll hetteglasset med fersk PBS og inkuber over natten ved 37 °C.
- Hvis immunfarging vil bli utført, hopp over trinn 2.21–2.22 og fortsett til avsnitt 3 for immunfarging. Hvis du bare stoler på endogen fluorescens, fortsett med trinn 2.21–2.22 og hopp over avsnitt 3.
- Kast PBS og endre løsningen til Refractive Index Matching Solution (RIMS) (Tabell 3). Inkuber over natten ved 37 °C.
- Etter inkubasjon kan det klarerte vevet lagres i RIMS-oppløsning ved RT. Vev kan synes å være hvitt og ugjennomsiktig i midten når det først overføres til RIMS; vev skal bli gjennomsiktig etter å ha blitt inkubert i RIMS ved romtemperatur i flere uker (Figur 2D).
3. Valgfritt: Immunhistochemistry Farging av hele Mount Mouse Heart
- Fjern det klare hjertet fra RIMS-oppløsningen og legg det i et rent 2,5 ml hetteglass med 2 ml PBST (PBS med 0,1 % Triton-X 100)
- Vask hjertet i PBST 3 ganger på en orbital rotator med 30 min inkubasjoner ved RT.
- Blokker ikke-spesifikk antistoffbinding ved å fordype hjertet i 2 ml med 20 % blokkeringsbuffer (fortynnet i PBST) og inkuber med rotasjon i 3 timer ved RT. Overfør til 4 °C for å flekke med rotasjon over natten.
MERK: Blokkeringsbuffer en normal serumsom samsvarer med arten der det sekundære antistoffet ble hevet. - Vask hjertet i PBST 3 ganger med rotasjon i 5 min inkubasjoner ved RT.
- Dypp hjertet i primær antistoff (fortynnet i 2% blokkerende buffer med PBST) og forhindre lyseksponering ved å pakke hetteglasset i aluminiumsfolie. Inkuber med rotasjon over natten på RT.
MERK: Fra dette punktet fremover bør aluminiumsfolie kontinuerlig brukes til å beskytte den sekundære mot eksponering for omgivelseslys. - Inkuber i ytterligere 24 timer med rotasjon ved 4 °C.
- Etter primær farging, gjenta trinn 3.2 (lang PBST vaskesyklus) for å fjerne det ubundne primære antistoffet fra vevet. Trekk vasken med en inkubasjon over natten med rotasjon ved RT.
- Arbeide i et område med begrenset belysning for å hindre sekundær antistoff lyseksponering, dypp hjertet i sekundærantistoff (fortynnet i 2% blokkerer buffer med PBST) og inkuber med rotasjon i 3 timer ved RT. Overfør til 4 °C for å flekke med rotasjon over natten.
- På neste dag gjentar du trinn 3.2 (lang PBST-vaskesyklus) for å fjerne ubundet sekundært antistoff.
- Skift ut oppløsningen med 2 % blokkeringsbuffer (fortynnet i PBST). Fjern gjenværende ubundet antistoff ved å vaske over natten med rotasjon ved RT.
- Neste dag, kontroller at overflødig sekundærantistoff er fjernet ved hjelp av konfokal mikroskopi. Forleng vasken etter behov, og skift ut 2% blokkerende bufferløsning daglig. Fortsett når det ikke er noen ikke-spesifikk sekundær.
- Oppbevar immunisk hjertet i PBS ved 4 °C.
- Rett før helmontert mikroskopi, inkuber hjertet i RIMS-løsningen over natten ved 37 °C. Utvid inkubasjonen ytterligere 24 timer hvis vevet fortsatt ikke er helt ryddet.
- Oppbevar det helt ryddet og immunfargede hjertet i RIMS ved RT.
4. Visualisere ikke-myocytter populasjoner i 3D med single-foton confocal mikroskopi avbildning av ryddet mus hjerte
MERK: Hvis musehjerter høstes embryotisk, fortsett med pkt. 4.1. For musehjerter høstet postnatalt, fortsett med pkt. 4.2.
- Bilde av det klarerte embryonale musehjertet
- Fyll mikroskopet depresjon lysbildet med PBS-løsningen.
- Plukk forsiktig opp det klarehjertet med buede tang og plasser vevet på lysbildet.
- Monter skysen med en glassdekselslip. Vevet kan nå avbildes under et konfokalmikroskop.
- Bilde av det klarerte postnatale musehjertet
- Fyll halvparten av kammeret i depresjonslysbildet med PBS-løsning. For å skape et kammer som er stort nok til å passe et voksent musehjerte, ble en 3D-trykt polypropylen depresjonlysbilde skreddersydd (figur 4).
- Plukk forsiktig opp det ryddet hjertet med buede tang og plasser vevet i kammeret. Fyll det gjenværende volumet av kammeret med PBS.
- Fyll kammeret med PBS slik at overflaten av væsken danner en kuppel over toppen av kammeret. Monter dekselet. Vevet kan nå avbildes under et oppreist konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ofte styrer de to mest utfordrende trinnene hjertet ut av brysthulen og ligating LAD. For å feilsøke disse trinnene, kan justeringer gjøres i plassering av den første punkteringen mellom de fjerde interkostale musklene; hvis punktering og sløv disseksjon er for nær i nærheten av brystbenet, kan hjertet ikke være i stand til å gå ut av brysthulen (Figur 1A).
I tillegg kan økt trykk på venstre underliv være nødvendig for å lette denne prosessen (figur 1B). Komplikasjoner kan også oppstå når du hviler hjertet på interkostalmusklene. Vi fant hjertet vil forbli utenfor hulrommet uten å trekke seg når den stumpe disseksjonholdes til en minimal størrelse og utføres hovedsakelig i horisontal retning. Denne retningen gir også klar visualisering og tilgjengelighet til LAD (Figur 1C).
Når du plasserer suturnålen bak LAD, foreslås det å trenge dypt inn i den fremre veggen i venstre ventrikkel, da en overfladisk ligation har mindre rom for justering i den endelige suturplasseringen (figur 1D). Binding av sutur rundt LAD bør utføres med kontrollerte, stabile bevegelser, da LAD er skjør og bryte denne koronararterien og den fremre veggen vil forårsake dødelighet (Figur 1E). Innen 5–10 minutter etter at operasjonen er fullført, bør nyfødte være livlig og puste normalt.
Når du går videre til den passive CLARITY-protokollen, bør hjerter høstet fra en muselinje som inkorporerer en endogen fluorescerende reporter for celleavstamningssporing beskyttes mot lys (Figur 2), som kan oppnås ved å pakke hetteglasset i aluminiumsfolie. Under clearing trinn, tiden inkubere i Clearing Solution er variabel avhengig av alderen på musen når hjertet ble høstet. Dette trinnet er fullført når hele vevet er konsekvent ugjennomsiktig, uten misfarging i midten (Figur 2B-C). Hjertene vil bli stadig mer gjennomsiktige etter lagring i RIMS-løsning ved romtemperatur i et par dager (Figur 2D). Det bør bemerkes at vevsutvidelse kan oppstå under clearingprosessen.
Vår passive CLARITY-protokoll tillater effektiv antistoffpenetrasjon og er dermed kompatibel med immunhistokjemimetoder for å merke protein(er) av interesse. Dette ble validert i Actl6bCre; Rosa26tdT transgene mus, som merker modne nevroner med tdTomato (tdT) reporterprotein. Hjertenervene er hovedsakelig overfladiske, med noen populasjoner bosatt i epikardiale lag, derfor brukte vi denne cellepopulasjonen som en proof-of-principal modell for reproduserbarhet av endogene reportersignal (Figur 3A), samt bevaring av reporterproteinkonformasjon før og etter CLARITY ( Figur3B-C). Våre representative resultater fra Actl6bCre; Rosa26tdT mus viser at endogene tdT protein signal sett i nerver av en uklarert P7 hjerte ble trofast rekapitulert i nerver av både uklarert og ryddet tdT immunmerket P7 hjerter (Figur 3). For å immunmerke tdT-positive nerver, en Rød Fluorescerende Protein (RFP) primær antistoff (kanin polyklonal; 1:200 fortynning; Rockland #600-401-379) ble brukt sammen med en Alexa Fluor 488 sekundærantistoff (geit polyklonal; 1:1000 fortynning; Invitrogen #A-11008). For å visualisere det klare hjertet ved øye under immunfarging og bildetrinn, kan en ultrafiolett lommelykt brukes kort til å belyse hjertet.
Figur 1: Induksjon av hjerteinfarkt i neonatal mus gjennom koronararterie okklusjon av venstre anterior synkende arterie (LAD). (A) Det fjerde interkostalrommet, angitt med en enkelt stjerne (*), er plassert og en stump disseksjon utføres. (B) Trykk påføres på venstre underliv for å lede hjertet ut av brysthulen. (C) LAD, preget av en dobbel stjerne (**), er identifisert som den dominerende arterien og ved anatomisk stilling. - Jeg har ikke noe åsi. En sutur blir deretter passert bak LAD og en firkantet knute er bundet rundt LAD for å indusere en koronarokklusjon og påfølgende infarkt. (E) Når fullført, blanching kan sees under suturen, på toppen av hjertet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Progresjon av passiv KLARHET-metode på et P14-mushjerte. Hjerter ble høstet fra P14 mus, (A) fast, og (B-D) gjennomgikk passiv CLARITY-protokollen. For hjerter tatt på et P14-punkt, er Clearing Solution inkubasjonstrinn (B) ufullstendig når misfarging i midten av hjertet er tydelig, sett etter 6 dager, og (C) komplett når hjertet vises jevnt ugjennomsiktig, sett etter 10 dager. (D) Etter at hjertet er lagret i RIMS, er vevet helt ryddet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Whole-Mount 3D Imaging av P7 Mouse Hearts med confocal mikroskopi. Representative hele mount 3D-bilder fra P7 Actl6bCre; Rosa26tdT transgene mus hjerter er vist som maksimal intensitet projeksjoner av z-stablet bilder. Hjerter ble avbildet for å vise (A) endogene tdTomato (tdT) fluorescens direkte etter høsting (rød) (B) immunfarging av tdT-positive nerver i et uklart hjerte (Alexa Fluor 488; grønn) og (C) reproduserbar immunmerking av tdT-positive nerver i et ryddet hjerte (Alexa Fluor 488; grønn). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: 3D trykt polypropylen depresjon lysbilder. For å bilde av postnatal hjerteprøver, tilpasset depresjon lysbilder ble 3D trykt på polypropylen. Lysbildedimensjonene er 25 mm x 75 mm x 1 mm, med en lysbildedepresjon godt 13 mm i diameter og enten (A) 6,5 mm eller (B) 17 mm i dybden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Utstyr Type | Beskrivelse | Selskapet | Katalognummer |
| Hetteglass i glass | 12 x 35mm hetteglass med hette | Fisherbrand (andre er i seg selv | 03-339-26A (andre kan være på vei mot |
| 6-0 Prolene Suturer | Polypropylen suturer | Ethicon (andre betydninger) | 8889H (andre er i seg selv) |
| Skarpe tang | Fint tips, Rett, 4.25 tommer | Sigma-Adrich | Z168777 (andre kan være på denne siden) |
| Dressing Tang | Dissekering, 4,5 tommer | Fisherbrand (andre er i seg selv | 13-812-39 |
| Nåleholder | Mayo-Hegar, 6 i | Fisherbrand (andre er i seg selv | 08-966 |
| Liten dissekering saks | 30 mm skjærekant | Walter Stern Inc | 25870-002 |
| Vev tang | Middels vev, 1X2 tenner | Excelta (andre) | 16050133 |
| Stor dissekering saks | Rett, 6 i | Fisherbrand (andre er i seg selv | 08-951-20 |
| Iridectomy Saks | 2 mm cutting edge | Verktøy for finvitenskap | 15000-03 |
| Buede tang | Halvbuet, taggete, 4 tommer | Excelta (andre) | 16-050-146 |
Tabell 1: Kirurgisk utstyr.
| Rydde løsning | |||
| Reagens | Endelige | Beløpet | Notater |
| Natrium dodecyl sulfat (SDS) | 8,0 % m/v | 40 g | |
| Borsyre | 1,25 % m/v | 6,25 g | |
| 1-thioglycerol | 0,5 % m/v | 5 μL/ml | Lagt til etter behov for å løsning |
| Tilsett 400 ml ultraren H20 til 1 L beger. Bland i SDS og Boric Acid med magnetisk omrøring. | |||
| Juster pH til 8,5 med 6M NaOH. Ta volumet til 500 ml og Autoklav. | |||
| Oppbevar løsningen ved romtemperatur. | |||
| Andre CLARITY-reagenser | |||
| Reagens | Endelige | Lager | Notater |
| Pfa | 4.0% | 16% | Fortynnet i PBS |
| Akrylamid | 4.0% | 40% | Fortynnet i PBS |
| Va-044 (andre kan være på den siden) | 0.5% | 10% | Lagt til etter behov for å løsning |
Tabell 2: Ryddeløsning og andre CLARITY-reagenser.
| Reagens | Endelige | Beløpet |
| Fosfat buffer | 0,02 M (0,02) M | 90 ml |
| Histodenz (Andre) | 133,3 % m/v | 120 g |
| Natriumazid | 0,05 % m/v | 45 mg |
| Tilsett 90 ml 0,02 M Fosfat Buffer til 250 ml glassmedieflaske innpakket i aluminiumsfolie. | ||
| Bland i reagenser som er oppført med magnetisk omrøring. La komponentene oppløses over natten. | ||
| Vortex løsning og filter rense med filtreringssystem i en steril 250 ml glass medieflaske. | ||
| Pakk flaske i aluminiumsfolie og lagre løsning ved romtemperatur. | ||
Tabell 3: Brytningsindekssamsvarsløsning (RIMS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellecelleinteraksjoner mellom kardiomyocytter og ikke-myocytter populasjoner er en avgjørende faktor for om hjertet vil gjennomgå fibrose eller reparere etter skade. Funn har blitt gjort som viser at en rekke celletyper, inkludert nerver14, epikardiale celler24, peritoneal makrofager25, arterioler12,13, og lymfatiske endotelceller26, alle spiller en viktig rolle i å megle hjertereparasjon. Disse celleslektene og andre av interesse kan spores genetisk under utvikling, sykdom og regenerering ved å bruke Cre-lox og CRISPR-Cas9-teknologier hos mus. Når de er kombinert med organrydding og avanserte mikroskopimetoder, kan bidragene fra ikke-myocytterpopulasjoner vurderes nøyaktig, og åpne døren for å belyse cellulære og molekylære mål for myokardregenerering etter skade.
Effektiviteten av protokollen er avhengig av konsekvent og reproduserbar ligation av LAD under koronarokklusjon kirurgi. Neonatal mus er følsomme for utvidet eksponering for hypotermi; dermed må operasjonen ikke bare utføres med nøyaktighet, men også i løpet av minutter. Fra start til slutt bør hjerteinfarktoperasjonen ta mindre enn 8 minutter. Vi anbefaler først å praktisere på flere kull med samme bakgrunn som de eksperimentelle musene til ferdigheter er oppnådd.
Progresjon av hjertereparasjon kan vurderes ved hjelp av ekkokardiografi for å måle hjertefunksjon (dvs. fraksjonell forkortelse, utstøtingsfraksjon, systolisk og diastolisk volum) en gang innen 3 til 7 dager etter operasjonen og igjen kort tid før høsting av hjertet , foreslått mellom 21- og 28-dagers etterskade. Hjerter kan samles for rydding på flere tidspunkter etter hjerteinfarkt kirurgi.
Clearing trinn (trinn 2.17) er gjenstand for variasjon i varighet avhengig av alder og belastning av musen som hjertet ble høstet, noe som kan resultere i forskjeller i hjertestørrelse. For en B6-bakgrunnsmus er ryddingsvarighet basert på alder anslått som følger: P1 (7-10 dager), P7 (14-17 dager), P14 (21-24 dager), P21 (28-31 dager), P28 (35-38 dager). Selv om laboratoriets primære fokus er hjerterydding, har vår passive CLARITY-metode vært vellykket for å rydde muslunger (upubliserte resultater), og vi forutser ingen grense for å bruke dette bredt på andre organer. Samlet sett er vår fremskyndede clearingprosess høyt verdsatt for evnen til å fjerne vev raskt og effektivt.
Det bør bemerkes at komplikasjoner kan oppstå ved bruk av vevsryddingsteknikker i organer med endogene journalister i sjeldne underpopulasjoner. Reporter signal i tette cellepopulasjoner (som myocytter23) synes å være mer motstandsdyktig mot clearing prosessen og dermed signalet er vanligvis beholdt; Andre mer følsomme cellepopulasjoner (som hjertenerver) er imidlertid utsatt for å ha endogene fluorescerende proteinsignal slukket etter langvarig fiksering eller rydding. Dette ble tydelig i Actl6bCre; Rosa26tdT reporter mus modell, hvor P7 hjerter fast kort i 15 minutter viste sterk tdT signal (Figur 3A), men dette fluorescerende signalet ble slukket etter fiksering i 1 time eller over natten inkubasjon i Clearing Solution (data ikke vist). I scenariet med tapt reportersignal er antistofffarging rettet mot reporterproteinet kompatibelt med vevsrydding for å forsterke signalet (Figur 3). Tilsetning av et immunmerkingstrinn kan være en fordel for vev som gjennomgår omfattende bildebehandling, da konjugerte antistoffer er blekemiddelbestandige og produserer stabilt, langsiktig uttrykk. Med evnen til å spore proteiner endogene og gjennom immunfarging, vår protokoll unikt tillater presis lokalisering av sjeldne hjertecellepopulasjoner som bor dypt inne i hjertet.
Ryddet hjerter kan gjennomgå avstamning sporing eller fluorescerende protein uttrykk analyse ved hjelp av helmontert 3D konfokal mikroskopi. Konfokalmikroskopet er utstyrt med laserlinjer optimalisert for å opphisse blomstrende reportere (eller konjugerte sekundære antistoffer), for eksempel: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) og APC (Cy5, Alexa Fluor 647) på 405 nm, 488 nm, 561 nm og 683 nm, henholdsvis. For hjerteprøver som ikke får plass i en depresjonssklie – vanlig hvis hjertet høstet postnatalt – kan et tilpasset depresjonslysbilde gjøres ved 3D-utskrift på polypropylen. Tilpassede lysbilder fulgte dimensjoner på et mikroskop depresjon lysbilde (25 mm x 75 mm x 1 mm), varierende brønndybde til enten 6,5 mm eller 17 mm(Figur 4).
For å visualisere reportercellelinjene i 3D, er konfokalmikroskopet satt til å skaffe z-stablede bilder over hele hjertet. Når du forestiller større hjerter, kan hele hjertet ikke være i stand til å bli fanget i et enkelt z-stablet bilde selv med et lavt forstørrelsesmål. I dette scenariet kan en serie med flere z-stablede bilder tatt i forskjellige hjerteområder settes sammen ved hjelp av en stor bildefunksjon. Dette oppnås ved å kalibrere mikroskopet til riktig objektivlinse og angi feltet for det store bildeskanneområdet. Deretter gjennomgår z-stablede bilder 3D-rekonstruksjon ved hjelp av et volumgjengivelsesprogram og maksimal intensitetsprojeksjon (figur 3). Høyoppløselige bilder som er anskaffet, kan analyseres for å bestemme nøyaktig 3D-romlig cellemønster av målrettede cellepopulasjoner.
Samlet gir denne protokollen et kraftig molekylært verktøy for å forstå de dynamiske cellulære endringene som oppstår under hjertereparasjon og regenerering. Denne metoden beskriver trinnene for å indusere et hjerteinfarkt, utføre hele organrydding, spore cellespesifikke populasjoner og analysere 3D-cellemønster. Sammen gir disse teknikkene tilgang til sporingscellepopulasjoner som tidligere var utilgjengelige på grunn av deres sparsomme tilstedeværelse eller plassering i vevet. Dette vil muliggjøre videre undersøkelse av spørsmål som er avgjørende for å fremme terapeutiske tilnærminger i regenerativ medisin, spesielt de som tar sikte på å stimulere endogene hjerteregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Finansieringen av dette prosjektet ble gitt av UW School of Medicine and Public Health fra Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), og en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
