Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Detta protokoll beskriver cryoAPEX-metoden, där ett APEX2-märkt membranprotein kan lokaliseras genom överföring elektronmikroskopi inom optimalt bevarad cellultrastruktur.

Abstract

Viktiga cellulära händelser som signaltransduktion och membranhandel är beroende av korrekt proteinplats i cellulära fack. Att förstå exakt subcellulära lokalisering av proteiner är därför viktigt för att svara på många biologiska frågor. Strävan efter en robust etikett för att identifiera proteinlokalisering i kombination med adekvat cellulär bevarande och färgning har historiskt utmanande. De senaste framstegen inom elektronmikroskopi (EM) bildbehandling har lett till utveckling av många metoder och strategier för att öka cellulära bevarande och etikett målproteiner. En relativt ny peroxidasbaserad genetisk tagg, APEX2, är en lovande ledare inom klonbara EM-aktiva taggar. Provberedning för transmissionelektronmikroskopi (TEM) har också avancerat under de senaste åren med tillkomsten av cryofixation genom högtrycksfrysning (HPF) och lågtemperaturuttorkning och färgning via frysningsubstitution (FS). HPF och FS ger utmärkt bevarande av cellulär ultrastruktur för TEM-avbildning, näst efter direkt kryo-imaging av glaskroppen prover. Här presenterar vi ett protokoll för cryoAPEX-metoden, som kombinerar användningen av APEX2-taggen med HPF och FS. I detta protokoll är ett protein av intresse märkt med APEX2, följt av kemisk fixering och peroxidasreaktion. I stället för traditionell färgning och alkoholuttorkning i rumstemperatur, provet är kryokefixet och genomgår uttorkning och färgning vid låg temperatur via FS. Med cryoAPEX kan inte bara ett protein av intresse identifieras inom subcellulära fack, utan även ytterligare information kan lösas med avseende på dess topologi inom ett strukturellt bevarat membran. Vi visar att denna metod kan ge tillräckligt hög upplösning för att dechiffrera proteindistributionsmönster inom en organelllumen, och att skilja uppdelningen av ett protein inom en organelle i närheten av andra omärkta organeller. Vidare är cryoAPEX procedurmässigt enkelt och mottagligt för celler som odlas i vävnadskultur. Det är inte mer tekniskt utmanande än typisk cryofixation och frysa substitutionsmetoder. CryoAPEX är allmänt tillämplig för TEM-analys av membranprotein som kan märkas genetiskt.

Introduction

Biologiska studier inkluderar ofta frågor om att lösa subcellulära proteinlokalisering inom celler och organeller. Immunofluorescensmikroskopi ger en användbar lågupplösning sett till proteinlokalisering, och de senaste framstegen inom super-upplösning imaging driver gränserna för upplösning för fluorescerande taggade proteiner1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) är fortfarande guldmyntfoten för imaging högupplöst cellulära ultrastruktur, även om märkning av proteiner är en utmaning.

Historiskt sett har flera EM-metoder använts för att närma sig frågor om strukturella proteinlokalisering. En av de vanligaste metoderna är immunoelectron mikroskopi (IEM), där antigen-specifika primära antikroppar används för att upptäcka protein av intresse. EM-signal genereras av tillämpningen av sekundära antikroppar som konjugeras med elektrontäta partiklar, oftast kolloidalt guld4,5. Alternativt kan antikroppar som konjugeras med enzymer som pepparräd (HRP) användas för att producera en elektrontät fällning6,7,8. Det finns två huvudsakliga metoder för IEM, besiktigad förinbäddning och postbäddsmärkning. I pre-inbäddning IEM, antikroppar införs direkt i celler, vilket kräver ljusfixering och permeabilisering av cellerna9,10,11. Båda stegen kan skada ultrastructure12,13. Utveckling av betydligt mindre antikroppar bestående av ett antikroppsFab-fragment som konjugerats med 1,4 nm nanoguld gör att mycket milda permeabiliseringsförhållanden kan användas. Nanogold är dock för liten för direkt visualisering under TEM och kräver ytterligare förbättringssteg för att bli synliga14,15,16. I efterinbäddning IEM appliceras antikroppar på tunna delar av celler som har bearbetats helt genom fixering, uttorkning och inbäddning i harts17. Även om detta tillvägagångssätt undviker permeabilisering steg, bevara epitop av intresse under provberedning är utmanande18,19,20. Den Tokuyasu metoden för ljusfixering följt av frysning, cryo-snittning, och antikroppar upptäckt ger förbättrad epitop bevarande21,22. Men de tekniska kraven för cryo-ultramicrotomy, liksom den suboptimala kontrast som uppnås i cellen, är nackdelar23.

Användningen av genetiskt kodade taggar eliminerar många av svårigheterna med IEM i samband med upptäckt av protein av intresse. En mängd olika taggar finns tillgängliga, inklusive HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG och metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Var och en av dessa har fördelar jämfört med tidigare metoder, men var och en har också nackdelar som förhindrar utbredd användning. Dessa nackdelar sträcker sig från inaktivitet av HRP i cytosol till den stora storleken på ferritin taggen, ljuskänslighet ReAsH, och liten storlek och brist på kompatibilitet med cellulära färgning av metallothionein. Nyligen har ett protein som härrör från askorbat peroxidas e konstruerats som en EM-tagg, som heter APEX233,34. Som en peroxidas kan APEX2 katalysera oxidationen av 3,3'diaminobenzidine (DAB), som producerar en fällning som reagerar med osmiumetroxid för att ge lokal EM kontrast med minimal diffusion från protein av intresse (mindre än 25 nm)33,35. Till skillnad från traditionella HRP-baserade metoder är APEX2 extremt stabil och förblir aktiv i alla cellulära fack33. Prover kan bearbetas för TEM med traditionella EM-provfärgning och metoder som möjliggör bra visualisering av de omgivande strukturerna33,34,36. På grund av sin ringa storlek, stabilitet och mångsidighet har APEX2 vuxit fram som en EM-tagg med stor potential.

Många av de tillvägagångssätt som diskuteras ovan kan antingen inte vara eller ännu inte har kombinerats med det aktuella läget i konsten i strukturella bevarande, kryofixation och låg temperatur fryssubstitution. Således lider de av brist på membran bevarande och / eller cell färgning för att bestämma korrekt proteinlokalisering. Detta begränsar nödvändigtvis upplösningen och tolkningen av de uppgifter som kan erhållas. Cryofixation av högtrycksfrysning (HPF) innebär snabb frysning av prover i flytande kväve vid ett högt tryck (~2 100 bar), vilket orsakar förvinning snarare än kristallisering av vattenprover, vilket bevarar celler i ett nästan inbyggt tillstånd37,38,39. HPF följs av frysningsubstitution (FS), en låg temperatur (-90 °C) uttorkning i aceton i kombination med inkubation med typiska EM-fläckar som osmiumetroxid och uranylacetat. HPF och FS ger tillsammans en klar fördel jämfört med traditionell kemisk fixering (en längre process som kan leda till artefakter) och alkoholuttorkning vid rumstemperatur eller på is (vilket kan leda till extraktion av lipider och sockerarter), och därmed är önskvärda att kombinera med de bästa EM-taggarna för proteindetektering.

En anledning till att HPF/FS inte har kombinerats med APEX2-märkning är att ljuskemisk fixering är en förutsättning för peroxidasreaktionen, vilket begränsar spridningen av DAB-reaktionsprodukten. I APEX2-studier följs hittills fixering och peroxidasreaktion av traditionella EM-metoder för färgning och alkoholuttorkning33,36. Det har dock visat sig att efter kemisk fixering med HPF/FS ger en tydlig fördel i bevarandet över traditionell kemisk fixering och alkoholuttorkning ensam40. Förlusten av strukturell integritet sett i traditionella TEM prover verkar mindre ansluten till fixering än uttorkning, som vanligtvis görs med alkohol i rumstemperatur eller på is, och kan leda till extraktion av lipider och sockerarter 40,41. För att utveckla cryoAPEX-metoden hypoteser vi att kemisk fixering och peroxidasreaktion, följt av HPF och FS, skulle ge ett optimalt resultat när det gäller strukturellbevarande.

Här presenterar vi cryoAPEX-protokollet, som kombinerar APEX2-märkning med kryofixation och fryser substitutionsmetoder (figur 1). Detta enkla protokoll består av transfection av ett APEX2-märkt protein av intresse, kemisk fixering av celler och peroxidasreaktionen. HPF och FS utförs sedan följt av typisk harts inbäddning och tunn snittning. TEM imaging avslöjar utmärkt bevarande av ultrastruktur med hjälp av denna metod. Dessutom observerades högupplöst subcellulär lokalisering och rumslig fördelning av en endoplasmatisk reticulum (ER) lumenalprotein. Denna metod är allmänt användbar för detektion av membranproteinlokalisering inom celler för elektronmikroskopi analys. I våra händer har metoden fungerat framgångsrikt för en mängd olika cellinjer som odlas i vävnadskultur, inklusive HEK-293T (mänskliga embryonala njurar), HeLa (human livmoderhalscancer), Cos7 (afrikansk grön apa njurfibroblast), och BHK (baby hamster njure). Detaljerade instruktioner beskrivs nedan med HEK-293T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellkultur och transfection

  1. Seed HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller större vävnad kultur rätt och växa till 60%-90% sammanflödet i en cell kultur inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
  2. Transfect celler med APEX2-märkta däggdjur uttryck plasmids med transfection reagens (se Table of Materials) enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Vid 12–15 h efter transfection, tvätta celler en gång med fosfat buffrad koks (PBS). Ta bort celler från skålen genom mild tvättning med PBS. En dissociationreagens som trypsin kan användas om det behövs för en viss celltyp. Centrifug vid 500 x g i 5 min för att bilda en pellet.

2. Kemisk fixering och peroxidasreaktion

  1. Ta försiktigt bort supernatanten och resuspend pelleten i 2 ml 2% glutaraldehyd (v/v) i 0,1 M natriumkacodylate buffert, pH 7,4, i rumstemperatur. Placera provet på is och inkubera i 30 min. Pellet provet vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Från denna punkt fram till steg 2.3.3, håll provet och lösningarna på is och utför centrifugering vid 4 °C.
    VARNING: Både glutaraldehyd och natriumkacodylate buffert (innehållande arsenik) är giftiga. Lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning bör användas vid hantering. Lösningar som innehåller glutaraldehyd och/eller natriumkacodyatbuffert bör kasseras som farligt kemiskt avfall.
  2. Tvätta pelleten 3x i 5 min med 2 ml 0,1 M natriumcacodylate buffert. För dessa samt efterföljande tvättar, försiktigt avbryta cellpelleten i önskad lösning, sedan centrifugera i 5 min vid 500 x g och försiktigt ta bort och kassera supernatant. Försiktighet bör iakttas med upprepade pelleterings- och återsuspensionssteg för att minimera provförlust.
  3. Utför peroxidasreaktionen
    1. Förbered en ny lösning som innehåller 1 mg/ml av 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) i 0,1 M natriumkacodylate buffert. Lös upp DAB genom kraftig virveli 5–10 min.
      VARNING: DAB är giftigt och en potentiell cancerframkallande och bör hanteras med lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning. Lösningar som innehåller DAB bör behandlas som farligt kemiskt avfall.
    2. Tvätta pelleten genom att avbryta i 3 ml DAB-lösning följt av pelletering vid 500 x g i 5 min.
    3. Återsuspendpelleten i 3 ml DAB-lösning som väteperoxid har tillsatts för att uppnå en slutlig koncentration på 5,88 mM. Inkubera i 30 min på rumstemp. Pelleten blir synligt brunfärgad som indikerar närvaron av den olösliga DAB-reaktionsprodukten.
      DAB-inkubationstiden kan behöva optimeras för varje prov. Färgändringen kan övervakas på ljusmikroskopet. Enligt vår erfarenhet är en 15–45 min inkubation tillräcklig för de flesta proteiner. Väteperoxid ska erhållas från en nyöppnad flaska eller en som har hållits välförseglad efter öppnandet.
    4. Pellet cellerna, tvätta sedan 2x i 5 min med 0,1 M natriumcacodylate buffert, följt av en tvätt i Dulbecco modifierade Eagle's medium (DMEM) eller cellmedia val.
  4. Resuspend cellpelleten i 500 μL av en kryoskyddad lösning av DMEM (eller andra cellmedier val) som innehåller 10% fetalt bovinserum och 15% bovinserumalbumin. Pellet igen, något öka centrifughastigheten från 500 x g om det behövs för att uppnå en pellet i den tjocka kryoskyddslösningen. Kasta majoriteten av supernatanten, se till att tillräckligt med vätska lämnas så att pelleten inte torkar ut. Transportera cellpelleten till instrumentet för frysning av högt tryck.

3. Frysning av högt tryck

  1. Fyll frysbehållaren med högt tryck med flytande kväve (LN2)och starta pumpen för att fylla provkammaren med LN2.
    VARNING: Använd lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning när du arbetar med flytande kväve.
    OBS: Dessa steg är specifika för Leica EMPACT2 högtrycksfrys.
  2. Vevar bort eventuell kvarvarande vätska från cellpelleten med hjälp av hörnet av en laboratorietorka eller pappershandduk. Tillräckligt med vätska bör förbli att pelleten bildar en pasta liknande i konsistens en tandkräm. Den ska vara tillräckligt tunn för att aspireras in i en 20 μL rörspets.
  3. Aspirera 2–3 μl av cellpelleten och sätt in den på en membranbärare. Fyll brunnen på membranhållaren helt, så att ytspänningen skapar en liten kupol ovanpå, men vätskan inte spiller ut ur brunnen. Inga luftbubblor bör finnas.
  4. Skjut membranhållaren i patronen och säkra. Placera patronen i HPF-maskinen som har förberetts och primats och tryck på Börja frysa.
  5. Kontrollera temperaturen kontra tid och tryck kontra tidgrafer för att kontrollera att trycket nådde 2100 bar och temperaturen nådde -196 °C inom 200 ms, och båda parametrarna förblev stabila för 600 ms mätning.
  6. Upprepa steg 3.3 till 3.5 tills cellpelleten har använts eller önskat antal prover har frysts.
  7. Hålla patronerna nedsänkta i LN2,ta bort varje membranbärare från sin patron, placera i en plastkapsel och placera plastkapseln i en kryoinjektionfull med LN2.
    Protokollet kan pausas här. Kryoflaskorna med prover kan förvaras i en LN2 dewar i kryorör eller kryolådor.

4. Frys substitution

VARNING: Använd lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning när du arbetar med flytande kväve. Dessutom, många av de kemikalier som används i steg 4 är giftiga, inklusive garvsyra, osmium tetroxid, och uranyl acetat. Dessa kemikalier måste hanteras enligt lämpliga säkerhetsförfaranden och bortskaffas som farligt kemiskt avfall.

  1. Fyll den automatiska frysersättningsenheten med LN2. Ta temperaturen till -90 °C.
  2. Förbered FS Mix 1 och börja FS.
    1. I en kemisk huva, förbereda en lösning på 0,2% garvsyra (w /v) och 5% DI vatten i aceton och aliquot 1 ml per prov i cryo-flaskor. Placera i LN2 för att frysa.
    2. Placera Injektionsflaskorna FS Mix 1 och kryoflaskorna som innehåller de frysta cellpelletsen i FS-enhetens provkammare. Överför den inre kapseln som innehåller membranhållaren från LN2-flaskan till motsvarande injektionsflaskan som innehåller FS Mix 1.
    3. Starta ett FS-protokoll med sitt första steg är 24 timmar vid -90°C. Efter 24 h, pausa FS och tvätta proverna 3x i 5 min med aceton som har kylts till -90 °C.
  3. Förbered FS Mix 2 och komplett FS
    VARNING: Osmium tetroxid är en mycket giftig och oxiderande kemikalie som endast bör hanteras av utbildade individer enligt fastställda säkerhetsprotokoll. Protokoll för lagring och bortskaffande av osmiumhaltiga lösningar skall följas samt märkning av laboratorieområden där osmiumetroxid används. Osmium etroxid bör hanteras i en kemisk huva med personlig skyddsutrustning inklusive ögonskydd, ett labbskikt som ger full arm skydd, dubbla Nitrilhandskar och en valfri andningsskydd.
    1. I en kemisk huva, förbereda en lösning på 1% osmium etroxid, 0,2% uranyl acetat, och 5% DI vatten i aceton. Aliquot 1 ml per prov i kryoflaskor och placera i LN2 för att frysa.
      OBS: Lagerlösningar av garvsyra (10% w/v i aceton), osmiumtetroxid (10% w/v i aceton) och uranylacetat (8% w/v i metanol) kan beredas och lagras i kryoflaskor i en LN-dewar för enkel beredning av FS-mixar.
    2. Placera kryoflaskorna med FS Mix 2 i FS-enheten och överför kapslarna från den tredje acetontvätten till FS Mix 2-flaskorna. Inkubera i FS Mix 2 för 72 h vid -90 °C, följt av gradvis uppvärmning till 0 °C över 12-18 h.
  4. Håll temperaturen vid 0 °C och tvätta 3x i 30 min med förkyld aceton från en nyöppnad flaska.

5. Harts Infiltration och inbäddning

VARNING: Hartsen som används här (se Materialtabell)är giftig före polymerisering och bör hanteras med lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning. Opolymeriserade harts ska kasseras som farligt kemiskt avfall.

  1. Infiltrera proverna med ökande koncentrationer av harts upplöst i aceton från en nyöppnad flaska. Förbered en blandning av hartskomponenter A, B och D i en plastbägare enligt tillverkarens anvisningar och inkubera prover i följande hartskoncentrationer: 2%, 4%, och 8% för 2 h vardera vid 0 °C. Inkubera i 15%, 30%, 60%, 90%, och 100% harts för 4 h vardera i rumstemperatur. Inkubera för 4 h i en blandning av komponenter A, B, C och D.
  2. Placera membranbärarna med cellpelletssida upp i platta inbäddningsformar och fyll med harts (A, B, C och D). Pappersetiketter för proverna kan läggas till brunnarna just nu.
  3. Polymerisera i en ugn vid 60 °C för 24-36 h.
    OBS: Protokollet kan pausas efter polymeriseringen.
  4. Ta bort blocken från formen och låt svalna. För att ta bort membranhållaren placerar du provet först i ultramicrotomens vertikala chuck där det kan visualiseras med förstoring. Separera membranhållaren från blocket genom en kombination av dabbing flytande kväve på membranhållaren för att separera metallen från plasten, och med hjälp av ett rakblad för att chip bort hartsen runt membranhållaren. När separeras, lyft försiktigt bort membranhållaren lämnar cellpelletskupolen i blockets yta.
  5. Placera blocket med den exponerade cellpelleten uppåt i en platt inbäddningsform som är något djupare än den första formen och fyll med harts. Polymerisera vid 60 °C för 24–36 h.
    OBS: Protokollet kan pausas efter polymeriseringen.

6. Avsnitt

  1. Trimma blocket runt cellpelleten med ett rakblad. Placera sedan blocket i provchucken på snittarmen på ett ultramikrotome. Använd ett glas eller en diamantkniv, trimma blocket i en trapetsformad form nära kring cellpelleten.
  2. Få 90 nm ultratunna delar av cellpelleten med hjälp av ett glas eller diamantkniv.
  3. Plocka upp ett menyfliksområde med avsnitt på ett TEM-rutnät. Formvar-belagda kopparkortsgaller (1 x 2 mm 2-kortplats) är användbara för bildserier. Torka nätet genom att blotta kanten på ett filterpapper och förvaras i en TEM-rutnätsförvaringslåda.
    Protokollet kan pausas efter avsnitt.

7. TEM Imaging

  1. Montera gallret på TEM-hållaren och placera i mikroskopet. Vi använder rutinmässigt en Tecnai T12 på 80 kV för screening cryoAPEX prover. Skaffa bilder av celler och subcellulära strukturer av intresse med APEX2-märkning.
  2. Om så önskas, få ytterligare membran kontrast genom användning av bly post-färgning. Se figur 2 för jämförelse av icke-postfärgade prover(figur 2I–K) och bly efterfärgade prover(figur 2A–H).
    1. Flyta torra galler avsnitt-sida ner på en droppe utspädd natriumklorid lösning (~ 1,5 mM), 2x för 1 min vardera, sedan 1x i 10 min.
    2. Flytgaller på en droppe Satos blylösning i 1 min. Tvätta genom att flyta på natriumkloridlösning 3x i 1 min, sedan på DI vatten 3x i 1 min. Blot överflödig vätska från galler och lagra i en rutnätslåda.
      VARNING: Bly är en giftig kemikalie och bör hanteras med lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning. Lösningar som innehåller bly ska kasseras som farligt kemiskt avfall.
  3. Bild efter-färgade prover på TEM.
    OBS: I traditionell provberedning för TEM utförs blykontraststeget före TEM-avbildning. För cryoAPEX-prover rekommenderas dock att bildbehandling utförs först på icke-kontrasterade prover. Detta säkerställer att signalen från taggen lätt kan placeras av dess starka kontrast med de mer lättfärgade cellulära strukturer. För många prover kommer ingen ytterligare färgning att krävas; Om ytterligare membrankontrast önskas kan dock bly efter färgning utföras (steg 7.2) och provet som avses på ett nybildat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att jämföra det strukturella bevarandet med kryoAPEX-metoden med traditionell fixering och uttorkning, förberedde vi prover där ett endoplasmaiskt reticulummembran (ERM; ER membran) peptid var märkt med APEX2 och transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserar till ER:s cytoplasmatiska ansikte och ommodellerar ER-strukturen till morfologiskt distinkta strukturer som kallas organiserad smooth ER (OSER)34,42,43. OSER morfologi omfattar regioner med släta, parallella, tätt staplade membran som fungerar som en optimal region för att jämföra strukturella bevarande. Beredningen av provet med traditionella APEX-metoder resulterade i tydlig märkning av OSER-strukturer(figur 2A–D). Vid inspektion vid hög förstoring, verkade staplade membran ruggig och icke-enhetliga luckor fanns mellan koncentriska membran tätheter, vilket indikerar dålig membran bevarande och lipidextraktion (Figur 2D). Provet som utarbetats av cryoAPEX hade också tydligt definierat märkning av OSER-strukturer; Membranen var dock släta och parallella, och lite eller ingen lipidextraktion sågs (Figur 2E–H). Resultaten från cryoAPEX var av liknande bevarande av hög kvalitet som de som erhållits från ett prov som genomgick HPF/FS utan ytterligare kemisk fixering och APEX2/DAB-reaktionssteg (figur 2I–K).

Förutom visuellt märkbarmembranbevarande bevarar cryoAPEX-metoden proteinet av intresse så att aspekter av proteindistributionsmönster kan observeras i vissa fall. För att illustrera denna punkt använde vi en annan ER-lokaliserat protein, huntingtin jäst interagerar protein E (HYPE). HYPE är ett membranprotein som ligger på ER-membranets luminala yta 44,45,46,47. HYPE-APEX2 konstruktioner överuttrycktes i HEK-293T celler. TEM analys av 90 nm tunna sektioner visade att HYPE var närvarande i hela perifera ER samt kärnhölje(figur 3A,B). Dessutom kunde HYPE densitet lösas i regelbundet fördelade foci längs lumenal ER membran(Figur 3C, pilar). HYPE distribution och foci var också synliga i ett prov som utarbetats med traditionell fixering och uttorkning; Omfattande membranstörningar och extraktion var dock närvarande, vilket gjorde provet suboptimalt(figur 3D,E).

För att visa den robusta organellar specificitet och tillämplighet cryoAPEX metoden för en rad taggade proteiner, utförde vi APEX2 märkning med hjälp av tre cellulära markörer. Mitokondrierna var märkta med mito-V5-APEX234. Denna markör för mitokondriell matris som särskild färgning av mitokondrierna endast(figur 4A). På samma sätt bedömde vi plasmamembranmärkning med CAAX-APEX234, som endast producerade distinkt färgning av plasmamembranet (figur 4C). Ingen märkning observerades i intracellulära organeller(figur 4C). Dessutom skapade vi en ny konstruktion som en markör för Golgi lumen genom att smälta de första 118 aminosyrorna i musen isoform av α-mannosidase med APEX2genen 48. Den resulterande MannII-APEX2 en transiently transfected in i celler som därefter bereds av cryoAPEX-metoden. Färgade Golgi stackar var tydligt urskiljbara från de omgivande organeller (Figur 4B). Individuella stackar, cisternae och vissa blåsor var märkta, typiska för Golgi färgning(figur 4B). Sammantaget visar dessa markörer att cryoAPEX-metoden ger specifik märkning av membranproteiner inom olika organeller med tillräckligt hög upplösning för att skilja dem från omgivande subcellulära strukturer.

Figure 1
Bild 1: Schematisk av de viktigaste stegen i CryoAPEX-protokollet. (A)Celler odlas och transfected med en APEX2 plasmid. (B)Cellerna pelleteras och fixeras med glutaraldehyd, följt av(C)inkubation med DAB och väteperoxid för att producera peroxidasreaktionsprodukten. (D)Pelleten kryokonas av HPF, (E) frysa ersättas med tungmetaller och aceton, och (F) inbäddad i harts. Tunna sektioner samlas in på mikrotomen. (G)TEM-avbildning utförs och ytterligare kontrast kan läggas till genom efter färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Jämförelse av OSER membran bevarande med traditionell kemisk fixering, cryoAPEX och HPF / FS. DAB:s omorganiserade ER-morfologi i kemiskt fasta, DAB reagerade ERM–APEX2-uttrycksceller som bearbetades via traditionell kemisk fixering och alkoholuttorkning (A-D)eller genom kryoAPEX (E–H)jämfördes med ERM–APEX2 som uttryckte celler som var kryokfasta levande och utan DAB-reaktionen(I–K). De levande kryofasta cellerna representerar det bästa uppnåeliga strukturella bevarandet och fungerar här som ett mått för att utvärdera membranbevarande som erhållits via de två APEX-baserade detektionsprotokollen (A–H). Den jämnt fördelade parallelllamellarstaplingen av ER-härledda membran som erhållits genom cryoAPEX (exemplifieras i paneler G och H), i motsats till de ruggiga membran som erhållits med traditionella metoder (paneler C och D), belyser det överlägsna membranbevarande som kryoapex erhålls. Denna siffra har ändrats från Sengupta m.fl. 201948. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Proteinlokalisering av ett APEX2-märkt ER-protein kan lösas till periodisk foci. (A) En bild av en tunn del av en HEK-293T cell uttrycker HYPE-APEX2 och bearbetas av cryoAPEX avslöjar färgning av ER i en välbevarad (tät) cytoplasmatisk bakgrund (B,C). Högre förstoringsbilder av en liten del av den perifera ER (avgränsas av gul låda i A och visas i B, med ytterligare förstoring av röd låda i B visas i C) uppvisar periodisk foci av APEX2-genererad densitet(B,röd låda och C, vita pilspetsar som visar periodicitet mellan HYPE foci). (D)Bild av en tunn del av en cell som uttrycker HYPE-APEX2 och framställs av traditionell kemisk fixering och uttorkning visar specifik färgning av den näreriska ER och kärnhöljet (röda pilar). (E)Vid en högre förstoring var periodiska HYPE-specifika foci uppenbara inom sträckor av ER (gul låda och vita pilhuvuden i inloppet), trots omfattande membranstörningar, indikeras av röda pilar. NE = kärnhölje. Denna siffra har ändrats från Sengupta m.fl. 201948. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Organellemarkörer visar specificiteten hos den signal som erhålls från APEX2-märkta proteiner. APEX2-märkta proteinkonstruktioner utformade för att lokalisera till mitokondriell matris (mito-V5-APEX2; visas i A), eller Golgi lumen (α-mannII-APEX2; visas i B), eller plasmamembranet (CAAX-APEX2; visas i C) uttrycktes tillfälligt i HEK293 celler och de prover som bearbetas av cryoAPEX. Varje konstruktion gav organelle specifika tätheter. Förstorade vyer av två sektioner (gula eller röda rutor) från cellerna som uttrycker α-mannIIAPEX2 (panel B)eller CAAX-APEX2 (panel C)visas. Denna siffra har ändrats från Sengupta m.fl. 201948. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CryoAPEX-protokollet som presenteras här ger en robust metod för att karakterisera lokaliseringen av membranproteiner i cellmiljön. Inte bara användningen av en genetiskt kodade APEX2 tagg ger exakt lokalisering av ett protein av intresse, men användningen av cryofixation och låg temperatur uttorkning ger utmärkt bevarande och färgning av den omgivande cellulära ultrastruktur. Kombinerat är dessa metoder ett kraftfullt verktyg för att lokalisera ett protein med hög precision i sitt subcellulära sammanhang.

Den springande punkten i utvecklingen av denna metod är det faktum att förlusten av ultrastruktur upplevs efter beredning av traditionella TEM metoder kommer främst från uttorkning steg snarare än fixering steg40. Man trodde tidigare att peroxidasbaserade metoder var oförenliga med HPF/FS eftersom de kräver kemisk fixering före peroxidasreaktionen. För att komma runt detta, ett protokoll som heter CryoCHEM utvecklades nyligen där prover ursprungligen cryofixed, följt av rehydrering och peroxidasreaktion49. Detta tillvägagångssätt ger utmärkt mållokalisering med betydande förbättringar i provfärgning och bevarande. Det har visat sig vara användbart för vävnadsprover och i de fall där korrelerad fluorescens och elektronmikroskopi önskas. Parallellt med kryochem kombinerar vår metod glutaraldehydfixering med HPF och FS. CryoAPEX erbjuder ett strömlinjeformat protokoll som fungerar effektivt även för små cellprover.

Tillgång till högtrycksfrysnings- och frysersättningsinstrument är avgörande för cryoAPEX-metoden. Dessa instrument och färdigheter blir allt vanligare i EM:s anläggningar. Även om HPF- och FS-utrustning inte är lätt tillgängliga är det kemiskt fasta provet tillräckligt stabilt under en kort tid som skall transporteras blygsamma avstånd40. Vi har funnit att prover kan lagras efter DAB reaktion vid 4 ° C i minst 48 timmar före HPF utan betydande förlust av kvalitet. En annan kritisk aspekt av cryoAPEX-protokollet är införandet av kontroller, vilket är avgörande för ett robust experiment och övertygande resultat. Prover som utarbetats av övergående transfection med effektivitet mindre än 100% kommer att innehålla negativa kontrollceller samt märkta celler i samma prov. Om du använder cellinjer med stabilt uttryck för APEX2, bör en separat negativ kontroll beredas genom transfection av celler med icke-APEX2-märkt protein av intresse. Flera konstruktioner som kan fungera som organellar kontroller finns tillgängliga via Addgene, och publicerade bilder finns i detta och andra publikationer som kan användas för verifiering33,34,36,48. Fördjupad diskussion om experimentell design och verifiering av nya APEX2 fusionskonstruktioner har tillhandahållits av Martell et al.36

CryoAPEX är i stort sett användbart för detektion av membranproteiner, men vissa begränsningar finns. Även apex2 är en liten 28 kDa protein, vissa proteiner kanske inte kan införliva taggen33,34. APEX2 anses inte användbart för märkning av lösliga proteiner i cytosol, på grund av diffusreaktionsprodukten33,36. Dessutom utgör detektion av små mängder protein en utmaning på grund av förekomsten av färgning i den omgivande cellen. Beredning av HPF och FS bevarar cellulära komponenter som extraheras genom traditionell fixering och uttorkning. Detta leder till övergripande mörkare färgning i cellen, potentiellt konkurrerar med låga nivåer av APEX2 märkning.

CryoAPEX-tekniken är allmänt tillämplig på många proteiner, med ett begränsat antal steg som kan kräva optimering. På grund av individuell variation bland proteiner kan proteinuttrycksnivån och/eller DAB-reaktionstiden behöva justeras för att signalen ska visualiseras ovanför cellens bakgrundsfärgning. Användbar information och protokoll för validering av nya APEX2 fusion konstruktioner och optimering av uttrycket och DAB färgning tillhandahålls av Martell et al.36 Från en cellulär färgning perspektiv, FS-protokollet och / eller kemikalier kan behöva justeras för optimal visualisering av olika organellmembran, inom olika celltyper, vävnader eller organismer50,51,52,53,54. Enligt vår erfarenhet har FS-villkoren som presenteras här fungerat bra för en mängd olika däggdjurscellinjer.

KryoAPEX:s hybridmetod har potential att tillämpas på många andra genetiska märkningstekniker. Ersätta traditionell alkohol uttorkning med HPF / FS förväntas kraftigt förbättra den strukturella bevarande och protein lokalisering information. Använda safir skivor som en cell substrat för att fixa celler som ett monolayer förbättrar bevarandet av cellperiferin, inklusive cytoskelett och cell-cell kontakter. Mindre ändringar av protokollet skulle krävas för att använda safirskivor. APEX-tekniken kan användas för att upptäcka gröna fluorescerande protein (GFP) taggade proteiner via en GFP-bindande peptid35. Denna indirekta metod för upptäckt öppnar potential att utnyttja APEX-teknik för de otaliga proteiner som redan har märkts med GFP. Den nyligen introducerade split APEX2 kommer att vara fördelaktigt för närhet och interaktionstudier55. Dessutom kan befintliga HRP-baserade metoder kombineras med HPF/FS för att förbättra cellulära bevarande. Ett exempel är fluorescent indicator och peroxidase för precipitation med EM resolution (FLIPPER), där enskilda cellmarkörer har smälts med både en lysrör och HRP, som ger lumenal markörer för Golgi eller ER56. Användning av förbättrade peroxidassubstrat i stället för DAB är också möjlig med denna metod, inklusive substrat som är optimerade för RNA-märkning 57. CryoAPEX ger också in-cell märkning och strukturella bevarande som krävs för tredimensionell analys av proteindistribution genom elektron tomografi, och eventuellt på höga volymer genom SBF-SEM eller FIB-SEM48,58.

Sammantaget är CryoAPEX en robust metod med bred tillämplighet. I princip kan det appliceras på alla membranprotein, antingen inom lumenalutrymmet i en organell, på det cytoplasmatiska ansiktet, inom vesicles, på cellens plasmamembran eller till och med i det extracellulära utrymmet. För detta stora utbud av membranproteiner ger cryoAPEX-metoden potential att se lokalisering och distribution av ett protein med noggrannhet i sitt subcellulära sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Protokollet som beskrivs här härrör från en publikation av Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Detta arbete stöds av bidrag R01GM10092 (till S.M.) och AI081077 (R.V.S.) från National Institutes of Health, CTSI-106564 (till S.M.) från Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, och PI4D-209263 (till S.M.) från Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

Biologi Utgåva 156 CryoAPEX membranprotein APEX2 transmissionelektronmikroskopi kryofixation högtrycksfrysning frysning av substitution
CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter