Denne protokollen demonstrerer sanntidsregistrering av full doseresponsrelasjoner for agonist-indusert GPCR-aktivering fra et enkeltcellelag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjelp av etikettfrie impedansmålinger. Den nye doseringsordningen øker gjennomstrømningen betydelig uten tap i tidsoppløsning.
Etikettfrie impedansbaserte analyser brukes i økende grad til å ikke-invasivt studere ligandindusert GPCR-aktivering i cellekultureksperimenter. Tilnærmingen gir sanntidscelleovervåking med en enhetsavhengig tidsoppløsning ned til flere titalls millisekunder, og den er svært automatisert. Men når prøvetallene blir høye (f.eks. doseresponsstudier for ulike ligander), kan kostnaden for engangselektrodearrayene samt tilgjengelig tidsoppløsning for sekvensielle brønn-for-brønn-opptak bli begrensende. Derfor presenterer vi her en seriell agonist addisjonsprotokoll som har potensial til å øke produksjonen av etikettfrie GPCR-analyser betydelig. Ved hjelp av den seriell agonist additiv additusjonsprotokollen, legges en GPCR-agonist sekvensielt i økende konsentrasjoner til et enkelt cellelag mens du kontinuerlig overvåker prøvens impedans (agonistmodus). Med denne seriell tilnærmingen er det nå mulig å etablere en full doseresponskurve for en GPCR-agonist fra bare ett enkeltcellelag. Den serieagonist addisjonsprotokollen gjelder for ulike GPCR-koblingstyper, Gq Gi/0 eller Gs, og den er kompatibel med rekombinant- og endogene uttrykksnivåer av reseptoren under studien. Reseptorblokkering av GPCR-antagonister kan også vurderes (antagonistmodus).
Denne rapporten presenterer en detaljert beskrivelse av en seriell addisjonsprotokoll utviklet for kvantifisering av ligand-indusert G protein-koblet reseptor (GPCR) aktivering i tett dyrkede celler ved etikettfrie impedansmålinger. G protein-koblet reseptorer (GPCRs) er involvert i en rekke fysiologiske funksjoner og menneskelige sykdommer1. På grunn av dette og deres gode tilgjengelighet på celleoverflaten, gpcrs er en av de viktigste narkotika mål. Denne vurderingen gjenspeiles i et estimert antall ~ 700 godkjente legemidler rettet mot GPCRs, tilsvarende en ~ 35% andel på alle markedsførte legemidler2.
Utviklingen av nye legemidler består av to sentrale prosesser: (i) identifisering og funksjonell karakterisering av biologiske målmolekyler, og (ii) oppdagelsen av nye blystoffer og deres utvikling til administrable narkotika. I begge prosessene er det nødvendig med effektive metoder for å kvantitativt evaluere interaksjoner mot legemiddelmål og den påfølgende biologiske nedstrømsresponsen. Ulike stadier av den prekliniske legemiddelutviklingsprosessen benytter seg av ulike analysemetoder som spenner fra biomolekylære interaksjonsstudier mellom legemiddel og mål, over funksjonelle studier på celler i kultur, til eksperimenter på utskåret organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet øker fra den tidligere til de siste3. Selv om det er det overordnede målet å minimere dyreforsøk, er farmakologiske studier ved hjelp av isolerte organer fra laboratoriedyr eller til og med hele dyr ansett uunngåelig for å fullstendig karakterisere nye legemiddelkandidater. Når det gjelder analytisk avlesning, gir organfarmakologistudier en distale, integrerende “helhetlig” funksjonell respons av høyeste fysiologiske relevans. En ulempe med slike eksperimenter er at de ikke er kompatible med høy gjennomstrømningsscreening av tekniske så vel som etiske grunner og har i stor grad blitt erstattet av studier basert på in vitro cellekultur4.
Metoder for å kvantifisere GPCR-aktivering i cellekulturer inkluderer forskjellige etikettbaserte kjemiske analyser, som spesifikt oppdager andre budbringere, fosforyleringstilstand av nedstrøms signalproteiner, transkripsjonsaktivering via visse transkripsjonsfaktorer eller ligandindusert intracellulær reseptorsmugling4,5. En ulempe med slike etikettbaserte analyser er nødvendigheten av å merke cellene med potensielt skadelige fargestoffer eller radioaktive markører. Dette krever ofte å kjøre analysen som et endepunktbestemmelse for en eksponeringstid som må angis som en priori. Ved hjelp av etikettbaserte endepunktanalyser lider av denne svært begrensede og partiske timingen av eksperimentet og risikoen for at kjemiske etiketter og sonder kan forstyrre den vanlige cellefysiologien – potensielt ubemerket av eksperimentereren.
I de senere årene har etikettfrie analyser for overvåking av GPCR-aktivering dukket opp, som impedansbaserte teknikker eller optiske metoder som bruker resonant bølgeguide rister5,6. Merking av cellene er eksperimentelt ikke nødvendig med disse tilnærmingene. Ettersom disse fysiske avlesningene opererer på lave amplitudesignaler, anses slike metoder som ikke-invasive, de tillater kontinuerlig celleovervåking potensielt i sanntid, og observasjonstiden er bare begrenset av cellekulturen som ikke er av lesningen. I likhet med avlesninger fra hele organer, label-free tilnærminger ofte rapportere om holistiske cellesvar, langt nedstrøms av reseptor aktivering når integrasjon langs hele signalnettverket fører til tidsavhengige, men heller uspesifikke endringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserte analyser måler dielektrisk signatur av endringer i celleform7,8, er målinger ved hjelp av resonant waveguide rister følsomme for endringer i brytningsindeks ved cellesubstratgrensesnittet som oppstår fra dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Det integrerende tegnet gjør etikettfrie metoder ekstremt følsomme for reseptormedierte hendelser uavhengig av type(er) av G-protein (Gq, Gi/0,Gs,G12/13)eller β-arrestin involvert i signalkaskade6 og godt egnet for endogene uttrykksnivåer av reseptoren.
I en standard etikettfri impedansbasert analyse dyrkes cellene tett i multi-brønnplater med coplanar gullfilmelektroder avsatt på bunnen av hver brønn10. Disse elektrodearrayene er koblet til en impedansanalysator, og celleresponsen på en eksperimentell stimulans registreres fra individuelle brønner ved tidsløstimpedansmålinger. I en typisk GPCR analyse en ligand er lagt i individuelt forskjellige konsentrasjoner til hver enkelt brønn. De ligand-induserte endringene i impedanstidskurset analyseres deretter med hensyn til karakteristiske kurvefunksjoner som maksimal signalendring, område under kurven, signalendring innen et gitt tidsintervall eller helling av kurven på et bestemt tidspunkt, for å kvantifisere ligandens styrke og effekt11.
Kostnaden for elektrodearrayene kan begrense anvendelsen av denne teknikken i høy gjennomstrømningsscreening (HTS)-kampanjer. Videre, med økende antall prøver som skal følges parallelt, øker antall individuelle målinger og reduserer dermed tilgjengelig tidsoppløsning for hver brønn gradvis – selv for toppmoderne flerkanalsopptak. Under slike forhold kan raske og forbigående celleresponser unnslippe målingen. I tillegg pålegger den konvensjonelle en brønn – en konsentrasjonstilnærming en betydelig tid og kostnadsfaktor på perfundert organ-on-chip- eller body-on-chip-utvikling med hensyn til deres egnethet i ligand-GPCR interaksjonsanalyse.
Av denne grunn utviklet vi en trinnvis doseringsprotokoll som muliggjør registrering av full doseresponskurver av ligand-indusert GPCR-aktivering i kultiverte cellemonolag ved kontinuerlig å overvåke impedansen til en enkelt brønn mens den pinefulle konsentrasjonen økes trinnvis. Den serieagonist addisjonsprotokollen øker gjennomstrømningen betydelig per brønn fra en konsentrasjon til 10 eller flere konsentrasjoner, som vist på det nåværende eksempelet på humane U-373 MG-celler, som endogene uttrykker histamin 1 reseptoren (H1R). Dermed har metoden potensial til å forbedre gjennomstrømningen betydelig i etikettfrie doseresponsstudier, mens tidsoppløsningen beholdes på det instrumentelle maksimumet.
Denne protokollen beskriver en metode for etikettfrie impedansmålinger for å bestemme doseresponsforholdet mellom agonist-indusert GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse av spesifikke antagonister for samme reseptor. Bevis på begrepet denne metoden ble presentert i en nylig publikasjon12. Så vidt vi vet er det den første studien som beskriver etableringen av en full doseresponskurve av agonist-mediert GPCR-aktivering ved hjelp av et enkeltcellelag in vitro. Tilnærmingen krever uunn…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjelp med cellekulturing og utarbeidelse av eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 “Medisinsk kjemi av selektive GPCR ligands” finansiert av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG) under tilskuddsnummer 222125149. JAS er spesielt takknemlig for et stipend gitt av det bayerske likestillingsprogrammet.
Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |