Summary
Denne protokollen demonstrerer sanntidsregistrering av full doseresponsrelasjoner for agonist-indusert GPCR-aktivering fra et enkeltcellelag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjelp av etikettfrie impedansmålinger. Den nye doseringsordningen øker gjennomstrømningen betydelig uten tap i tidsoppløsning.
Abstract
Etikettfrie impedansbaserte analyser brukes i økende grad til å ikke-invasivt studere ligandindusert GPCR-aktivering i cellekultureksperimenter. Tilnærmingen gir sanntidscelleovervåking med en enhetsavhengig tidsoppløsning ned til flere titalls millisekunder, og den er svært automatisert. Men når prøvetallene blir høye (f.eks. doseresponsstudier for ulike ligander), kan kostnaden for engangselektrodearrayene samt tilgjengelig tidsoppløsning for sekvensielle brønn-for-brønn-opptak bli begrensende. Derfor presenterer vi her en seriell agonist addisjonsprotokoll som har potensial til å øke produksjonen av etikettfrie GPCR-analyser betydelig. Ved hjelp av den seriell agonist additiv additusjonsprotokollen, legges en GPCR-agonist sekvensielt i økende konsentrasjoner til et enkelt cellelag mens du kontinuerlig overvåker prøvens impedans (agonistmodus). Med denne seriell tilnærmingen er det nå mulig å etablere en full doseresponskurve for en GPCR-agonist fra bare ett enkeltcellelag. Den serieagonist addisjonsprotokollen gjelder for ulike GPCR-koblingstyper, Gq Gi/0 eller Gs, og den er kompatibel med rekombinant- og endogene uttrykksnivåer av reseptoren under studien. Reseptorblokkering av GPCR-antagonister kan også vurderes (antagonistmodus).
Introduction
Denne rapporten presenterer en detaljert beskrivelse av en seriell addisjonsprotokoll utviklet for kvantifisering av ligand-indusert G protein-koblet reseptor (GPCR) aktivering i tett dyrkede celler ved etikettfrie impedansmålinger. G protein-koblet reseptorer (GPCRs) er involvert i en rekke fysiologiske funksjoner og menneskelige sykdommer1. På grunn av dette og deres gode tilgjengelighet på celleoverflaten, gpcrs er en av de viktigste narkotika mål. Denne vurderingen gjenspeiles i et estimert antall ~ 700 godkjente legemidler rettet mot GPCRs, tilsvarende en ~ 35% andel på alle markedsførte legemidler2.
Utviklingen av nye legemidler består av to sentrale prosesser: (i) identifisering og funksjonell karakterisering av biologiske målmolekyler, og (ii) oppdagelsen av nye blystoffer og deres utvikling til administrable narkotika. I begge prosessene er det nødvendig med effektive metoder for å kvantitativt evaluere interaksjoner mot legemiddelmål og den påfølgende biologiske nedstrømsresponsen. Ulike stadier av den prekliniske legemiddelutviklingsprosessen benytter seg av ulike analysemetoder som spenner fra biomolekylære interaksjonsstudier mellom legemiddel og mål, over funksjonelle studier på celler i kultur, til eksperimenter på utskåret organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet øker fra den tidligere til de siste3. Selv om det er det overordnede målet å minimere dyreforsøk, er farmakologiske studier ved hjelp av isolerte organer fra laboratoriedyr eller til og med hele dyr ansett uunngåelig for å fullstendig karakterisere nye legemiddelkandidater. Når det gjelder analytisk avlesning, gir organfarmakologistudier en distale, integrerende "helhetlig" funksjonell respons av høyeste fysiologiske relevans. En ulempe med slike eksperimenter er at de ikke er kompatible med høy gjennomstrømningsscreening av tekniske så vel som etiske grunner og har i stor grad blitt erstattet av studier basert på in vitro cellekultur4.
Metoder for å kvantifisere GPCR-aktivering i cellekulturer inkluderer forskjellige etikettbaserte kjemiske analyser, som spesifikt oppdager andre budbringere, fosforyleringstilstand av nedstrøms signalproteiner, transkripsjonsaktivering via visse transkripsjonsfaktorer eller ligandindusert intracellulær reseptorsmugling4,5. En ulempe med slike etikettbaserte analyser er nødvendigheten av å merke cellene med potensielt skadelige fargestoffer eller radioaktive markører. Dette krever ofte å kjøre analysen som et endepunktbestemmelse for en eksponeringstid som må angis som en priori. Ved hjelp av etikettbaserte endepunktanalyser lider av denne svært begrensede og partiske timingen av eksperimentet og risikoen for at kjemiske etiketter og sonder kan forstyrre den vanlige cellefysiologien – potensielt ubemerket av eksperimentereren.
I de senere årene har etikettfrie analyser for overvåking av GPCR-aktivering dukket opp, som impedansbaserte teknikker eller optiske metoder som bruker resonant bølgeguide rister5,6. Merking av cellene er eksperimentelt ikke nødvendig med disse tilnærmingene. Ettersom disse fysiske avlesningene opererer på lave amplitudesignaler, anses slike metoder som ikke-invasive, de tillater kontinuerlig celleovervåking potensielt i sanntid, og observasjonstiden er bare begrenset av cellekulturen som ikke er av lesningen. I likhet med avlesninger fra hele organer, label-free tilnærminger ofte rapportere om holistiske cellesvar, langt nedstrøms av reseptor aktivering når integrasjon langs hele signalnettverket fører til tidsavhengige, men heller uspesifikke endringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserte analyser måler dielektrisk signatur av endringer i celleform7,8, er målinger ved hjelp av resonant waveguide rister følsomme for endringer i brytningsindeks ved cellesubstratgrensesnittet som oppstår fra dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Det integrerende tegnet gjør etikettfrie metoder ekstremt følsomme for reseptormedierte hendelser uavhengig av type(er) av G-protein (Gq, Gi/0,Gs,G12/13)eller β-arrestin involvert i signalkaskade6 og godt egnet for endogene uttrykksnivåer av reseptoren.
I en standard etikettfri impedansbasert analyse dyrkes cellene tett i multi-brønnplater med coplanar gullfilmelektroder avsatt på bunnen av hver brønn10. Disse elektrodearrayene er koblet til en impedansanalysator, og celleresponsen på en eksperimentell stimulans registreres fra individuelle brønner ved tidsløstimpedansmålinger. I en typisk GPCR analyse en ligand er lagt i individuelt forskjellige konsentrasjoner til hver enkelt brønn. De ligand-induserte endringene i impedanstidskurset analyseres deretter med hensyn til karakteristiske kurvefunksjoner som maksimal signalendring, område under kurven, signalendring innen et gitt tidsintervall eller helling av kurven på et bestemt tidspunkt, for å kvantifisere ligandens styrke og effekt11.
Kostnaden for elektrodearrayene kan begrense anvendelsen av denne teknikken i høy gjennomstrømningsscreening (HTS)-kampanjer. Videre, med økende antall prøver som skal følges parallelt, øker antall individuelle målinger og reduserer dermed tilgjengelig tidsoppløsning for hver brønn gradvis - selv for toppmoderne flerkanalsopptak. Under slike forhold kan raske og forbigående celleresponser unnslippe målingen. I tillegg pålegger den konvensjonelle en brønn – en konsentrasjonstilnærming en betydelig tid og kostnadsfaktor på perfundert organ-on-chip- eller body-on-chip-utvikling med hensyn til deres egnethet i ligand-GPCR interaksjonsanalyse.
Av denne grunn utviklet vi en trinnvis doseringsprotokoll som muliggjør registrering av full doseresponskurver av ligand-indusert GPCR-aktivering i kultiverte cellemonolag ved kontinuerlig å overvåke impedansen til en enkelt brønn mens den pinefulle konsentrasjonen økes trinnvis. Den serieagonist addisjonsprotokollen øker gjennomstrømningen betydelig per brønn fra en konsentrasjon til 10 eller flere konsentrasjoner, som vist på det nåværende eksempelet på humane U-373 MG-celler, som endogene uttrykker histamin 1 reseptoren (H1R). Dermed har metoden potensial til å forbedre gjennomstrømningen betydelig i etikettfrie doseresponsstudier, mens tidsoppløsningen beholdes på det instrumentelle maksimumet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellesåing på elektrodearrayer
MERK: Valg av elektrodelayout er en avveining mellom følsomhet og antall celler under studier. Jo mindre elektroden er, desto mer følsom er målingen, men jo mindre er antall celler under studier. For celler som viser sterke impedanssvingninger over tid under baselineforhold, er større eller interdigitalerte elektroder å foretrekke.
- Forhåndsvarm alle løsninger som trengs for standard cellepassering og såing i et 37 ° C vannbad. For analyser med humane U-373 MG celler tar det: fosfat bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium, 0,05% (w / v) trypsin, cellekultur medium (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) supplert med 5% (v / v) fosterkalv serum (FCS), 2 mM L-glutamin og 100 μg / mL penicillin / streptomycin).
- Skyll cellelaget av lagerkulturen dyrket på bunnen av konvensjonelle cellekulturflasker eller retter med PBS to ganger.
- Fjern PBS, tilsett trypsinoppløsningen (1 ml i 25 cm2)og la cellene inkubere ved 37 °C i 5 min (gjelder U-373 MG-celler).
- Kontroll for fullstendig løsrivelse av cellene fra bunnen av vekstsubstratet med mikroskopi.
- Stopp trypsinreaksjonen så snart cellene er helt løsrevet ved å legge til 9 ml cellekulturmedium per 1 ml trypsin til cellesuspensjonen. Skyll forsiktig gjenværende celler fra bunnen av cellekultursubstratet ved å pipettere suspensjonen over substratet.
- Samle cellesuspensjonen med pipett og overfør den til et sentrifugeringsrør (15 ml eller 50 ml rør).
- Spinn ned cellene ved sentrifugering ved 110 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig supernatanten og re-suspendere cellepellet en kulturmedium før du teller cellene (f.eks. ved hjelp av et hemacytometer for fasekontrastmikroskoper og manuell telling).
- Juster cellesuspensjonen til ønsket celletetthet. For eksperimenter med U-373 MG celler, bruk 100 000 celler / cm2 for å vokse et konfluent cellelag innen 48 timer. Dette betyr en celletetthet på 200 000 celler/ml for 8-brønns elektrodearrayer med et vekstareal på ~ 0,8 cm2 og et brønnvolum på 400 μL.
MERK: For reproduserbare GPCR-aktiveringseksperimenter bør celler dyrkes til konfluent monolayers på elektrodematrisene. For å sikre riktig reseptoruttrykk på celleoverflaten, bør cellene seedes minst 36 timer før du utfører eksperimentet. Testing av forskjellige celletettheter for cellesåing er ofte meningsfylt for å identifisere de beste eksperimentelle forholdene. - Tilsett cellesuspensjonen til brønnene i elektrodematrisen og la selgerne slå seg ned ved romtemperatur i 10 – 15 min for å sikre homogen fordeling av celler på bunnen av brønnene.
- Dyrke celler i minst 36 timer i en standard cellekulturinkubator med 5% CO2 (avhengig av middels type) ved 37 °C og fuktet atmosfære. Endre cellekultur medium 24 h før eksperimentet.
- På dagen for eksperimentet, inspiser cellelagene på elektrodearrayene etter (fasekontrast) mikroskopi for å sikre fullstendig dekning av elektroder med celler.
2. Equilibration av celler i serumfritt medium
- Pre-varm serum-frimedium, i denne studien: Leibovitz L15 medium.
- Fjern cellekulturmedium fra celler dyrket på elektrodearrayer og erstatt av forhåndsoppvarmet serumfritt medium. Bruk 200 μL for elektrodearrayer i 8-brønnsformat og 150 μL for 96-brønns elektrodearrayer.
- La cellene likevektiere i serumfritt medium ved 37 °C i minst 2 timer. Likevektstiden avhenger sterkt av celletypen. For eksempel trenger U-373 MG-celler 2 timer, CHO-celler trenger 4 timer, BAEC kan kreve over natten likevekt i L-15 medium.
MERK: L-15 medium er CO2 uavhengig og krever en CO2-friatmosfære. For likevekt i L-15 sett inkubatoren til 0 % CO2. Equilibration kan overvåkes av impedansavlesninger, som vi anbefaler å gjøre for de første eksperimentene.
3. Overvåking av cellelikevekt med impedansavlesninger
- Plasser elektrodematrisen i tilkoblingsarrayholderen til impedansanalysatoren.
- Sørg for riktig lav impedanskontakt mellom elektroder og impedansanalysator. Denne kontrollen er individuelt forskjellig for ulike instrumenter.
MERK: Hvis instrumentet ikke klarer å koble til elektrodene, åpner du kontaktklemmen igjen, juster elektrodearrayet for riktig posisjonering inne i holderen og prøv på nytt. - Velg elektrodetype og/eller multibrønnformat fra brukergrensesnittet til programvaren.
- Definer måleparameterne. Ulike alternativer er tilgjengelige.
MERK: For å velge den mest følsomme AC-frekvensen, refererer vi til litteratur- og instrumenthåndbøkene, da det avhenger av elektrodeoppsett og celletype under studier. Vanligvis er sensingfrekvensen i området 4 kHz - 50 kHz. Her ble U-373 MG-celler dyrket på sirkulære arbeidselektroder med 250 μm diameter, og de ble overvåket med en ac frekvens på 12 kHz.- Hvis enkelt- og flere frekvensdatainnsamlingsmoduser er tilgjengelige, velger du enkeltfrekvensmodus for å sikre maksimal tidsoppløsning. Målingen vil bli utført med denne enkeltfrekvensen. For de mest utbredte instrumentene er det en rekke forhåndsinnstilte frekvenser langs det tilgjengelige frekvensvinduet.
- Hvis antall brønner under studien er lavt eller tidsoppløsning ikke er kritisk, velger du flere frekvensopptak i stedet. Impedansavlesninger ved et angitt antall frekvenser vil bli registrert for hver brønn for senere grundig analyse.
MERK: Tidsoppløsningen avtar med økende antall frekvenser registrert per brønn og økende antall brønner. Alternativene for valg av frekvens- og datainnsamlingsmodus varierer med instrumenttype og versjon.
- Start innhenting av tidskursdata.
- Følg cellelagimpedansen (minst 2 timer) til impedansen har stabilisert seg. I mellomtiden, forberede de pineformede løsningene.
- Når cellelagene har nådd et stabilt impedansnivå, går enten (i) videre til det serielt agonisttillegget i samme eksperiment eller (ii) avslutter datainnsamling og starter et nytt datasett for overvåking av agonist-indusert reseptoraktivering.
4. Utarbeidelse av agonist løsninger for eksperimenter i agonist modus
- Beregn konsentrasjonen av agonist løsninger etter behov for hvert trinn av seriell dosering i henhold til ligningen (1). n varierer fra 1 til det totale antallet serietillegg i. x betegner konsentrasjon og volum i brønnen på trinn n. y betegner konsentrasjon og volum av "løsning-til-legges" i trinn n.
MERK: Vurder antall replikeringer og beregn det totale volumet av "løsning-til-legges" for hvert konsentrasjonstrinn. Resultatene av en typisk beregning er gitt i tabell 1-4. Det tar en generell idé om det pineløse konsentrasjonsområdet som skal studeres da området definerer konsentrasjonene og antall porsjoner som skal administreres under serielt tillegg. Ved hjelp av serieagonist addisjonsprotokollen økes den agonistkonsentrasjonen trinnvis. Derfor må mengden agonist allerede i brønnen når neste dose legges til, tas i betraktning. Når antall agonist molekyler som allerede finnes i brønnen er nx = cx ∙Vx (med dagens konsentrasjon cx og volum Vx) og antall molekyler i brønnen etter neste tillegg er nx + y, bestemmes antall molekyler som skal legges ny ). Etter å ha lagt til en del av agonist, er den nye mengden agonist molekyler i brønnen: cx + y ∙ V x +y = cx ∙ Vx + cy ∙ Vy. Denne beregningen gjelder for hvert etterfølgende trinn. På grunn av gjensidig avhengighet av agonist konsentrasjon i brønnen og mengden av agonist i delene som skal legges til hvert trinn, er det viktig å definere endelige konsentrasjoner etter hvert trinn på forhånd.
Modus 1: Volumet i brønnen vil øke med hvert trinn som væske er kontinuerlig lagt.
Bruk Vx1 = 200 μL og Vy1 .... Vyi = 30 μL ved hjelp av denne modusen og et 8-brønnsformat.
Modus 2: Volumet i brønnen er konstant da volumet som legges til hvert trinn, fjernes like før det påfølgende tillegget.
Bruk Vx1 = 150 μL og Vy1 .... Vyi = 75 μL ved hjelp av denne modusen og et 96-brønnsformat.
- Skriv ut databladet med det totale volumet per konsentrasjon og detaljerte instruksjoner for pipettering.
- Forbered alle løsninger i det nødvendige beløpet. Lag alle agonistløsninger i samme serumfrie medium som brukes til likevekt av cellene.
FORSIKTIG: Histaminhydroklorid anses som farlig av OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamin forårsaker hudirritasjon, alvorlig øyeirritasjon, kan forårsake allergisk hudreaksjon, allergi, astmasymptomer eller pustevansker ved innånding og kan forårsake irritasjon av luftveiene. Vennligst vurder sikkerhetsdatabladet.
MERK: Lag pinlige løsninger så ferske som mulig. Stabiliteten til agonister i løsning kan variere betydelig. Oppbevar løsninger ved 4 °C eller under til bruk i forsøket. For noen molekyler kan ytterligere stabiliserende tilsetningsstoffer, som BSA når du bruker peptidbaserte eller lipidbaserte molekyler, vurderes for å forhindre adsorpsjon til veggene i brønner og rør. - Hvis du utfører eksperimentet i 96-brønnformat, overfører du løsninger til en konvensjonell 96-brønnplate (ingen elektroder) og bruker en 8- (eller 12-) kanalpipt for rask væskeoverføring til elektrodematrisen.
5. Utarbeidelse av agonist løsninger for eksperiment i antagonistmodus
MERK: Klargjør antagonistløsningen(e) med konsentrasjonen som skal påføres hele tiden. Volum og konsentrasjon av antagonistoppløsning avhenger av modusen for agonist addisjon (1 eller 2). Eksempler for eksperimenter i 8-brønn eller 96-brønnsformat i tilleggsmodus 2: (A) 8-brønnsformat (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); (B) 96-brønnformat (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- Beregn konsentrasjonen av hver agonistløsning som trengs for hvert trinn av seriell dosering som beskrevet i trinn 4.1.
- Lag alle agonistløsninger i samme serumfrie medium som brukes til likevekt av cellene og legg til antagonisten ved samme endelige konsentrasjon som planlagt for de respektive brønnene i forsøket.
MERK: I dette tilfellet er histaminlagerløsningen (10 mM) utarbeidet i L-15 medium. Når agonister oppløses i andre løsemidler (f.eks. dimetylsulfoxid (DMSO), bør en løsningsmiddelkontroll inkluderes for å ta hensyn til den økende løsemiddelbelastningen med hvert trinn i tillegg.
6. Utføre seriell addisjonsprotokoll i agonistmodus
- Start datainnsamling som beskrevet i trinn 3.1 – 3.5.
- Varm opp de pinefulle løsningene før bruk ved å plassere dem i inkubatoren ca. 10 – 15 min før itillegg.
MERK: Ved bruk av termolabilestoffer bør ikke løsningene holdes ved 37 °C for lenge. Hvis pre-oppvarming for 10 - 15 min anses kritisk, bringe løsninger til 37 ° C kort tid før tilsetning i et vannbad. - Kjør den agonist seriell doseringavhengig av valgt addisjonsmodus. Følgende modus 1 det totale volumet i brønnen øker med hvert tillegg av neste dose. I modus 2 fjernes det samme volumet som legges til med hvert trinn, også igjen like før du legger til neste høyere dose.
MERK: Tiden som trengs for likevekt av cellelaget mellom to påfølgende agonistdoser, avhenger av cellenes responstid. Et første eksperiment i parallell modus (en brønn – en konsentrasjon) avslører (i) celleresponstider for forskjellige agonistkonsentrasjoner og (ii) den mest følsomme kurveparameteren (f.eks. impedansmaksimum, impedans etter gang x).
A: Modus 1 / 8-brønnformat
- Tilsett 30 μL av den første løsningen med lavest konsentrasjon av agonist til cellene som ble quilibrated i 200 μL serumfritt medium.
- La cellene reagere og likevektfor den forhåndsdefinerte tidsperioden (f.eks. 15 min).
- Tilsett 30 μL av den andre oppløsningen med neste høyere konsentrasjon.
- Gjenta trinn 6.3.1-6.3.3 med den tredje, fjerde og så videre, agonist løsning.
MERK: Arbeid med 10 konsentrasjonstrinn vil resultere i et totalt volum på 500 μL i slutten av eksperimentet, som er like under det maksimale aktuelle volumet av disse brønnene på ~ 550 μL.
B: Modus 2 / 96-brønnformat
MERK: Sett datainnhenting en pause under hvert væskehåndteringstrinn (tillegg/fjerning) via impedansinstrumentets programvare når du kjører eksperimenter i 96-brønnformat. Den mer forseggjorte væskehåndteringen kan forstyrre datainnsamlingen. Bruk en flerkanals pipette.
- Sett datainnhenting på pause.
- Tilsett 75 μL av den første løsningen med lavest konsentrasjon av agonist til cellene som ble quilibrated i 150 μL serumfritt medium.
- Gjenoppta datainnsamling.
- La cellene reagere og likevektfor den forhåndsdefinerte tidsperioden (f.eks. 15 min).
- Omtrent 1 – 2 min før vanlig likevektstid avsluttes, sett målingen på pause og fjern 75 μL fra hver brønn.
MERK: Tidspunktet der løsningen skal fjernes, avhenger av antall brønner som overvåkes parallelt og rørhastigheten. Tiden som trengs for fjerning av løsningene bør ikke overstige tiden mellom påfølgende trinn. - Tilsett 75 μL av den andre oppløsningen med neste høyere konsentrasjon og gjenoppta målingen.
- Gjenta trinn 6.3.8-6.3.10 med den tredje, fjerde og så videre, agonist løsning.
7. Utføre seriell addisjonsprotokoll i antagonistmodus
- Start målingen som beskrevet i trinn 3.1 – 3.5.
- Under ekvivalens av cellelagene, klargjør antagonistoppløsning (f.eks. 200 μL av 1,5 μM difenhydraminhydroklorid i L15 medium).
FORSIKTIG: Difenhydraminhydroklorid har potensielle akutte helseeffekter. Det er skadelig ved svelging eller inhalert, kan forårsake øye- og hudirritasjon. Det kan forårsake irritasjon av luftveiene og fordøyelseskanalen. Vennligst vurder sikkerhetsdatabladet. - Varm antagonisten og agonistløsningene ved å plassere dem i inkubatoren ca. 10 – 15 min før de i tillegg til cellekulturene (jf. 6.2). Hvis antagonistfrie brønner også er inkludert i analysen, også pre-varm serumfritt medium.
- Tilsett antagonistløsningen til de angitte brønnene. La cellene likevektes med antagonist i 15 – 20 min. Hvis antagonistfrie brønner er inkludert, legg til samme volum av serumfritt medium til disse brønnene.
- I henhold til antagonisttillegg i modus 2, fjern oppløsningen fra brønnene
(A) 8-brønnsformat (200 μL)
(B) 96-brønnformat (75 μL) - Kjør den pineste addisjonssekvensen som beskrevet i trinn 6.3.
8. Dataeksport og analyse
- Eksporter data ved hjelp av impedansinstrumentets programvare for å konvertere alle registrerte data fra proprietære til vanlige dataformater (f.eks. csv). Dette trinnet gjør det mulig for dataomorganisering og presentasjon med andre programvarepakker.
- Last inn csv-formaterte data til vitenskapelig dataanalyseprogramvare.
- Normaliser impedansverdiene ved å trekke fra impedansen av det siste datapunktet før det første tilsetning av agonistoppløsning og ved å angi tidspunktet for tillegg til t = 0. Plott tidsforløpet av normalisert impedans.
- Plott de enkelte tidskursene og identifiser maksiklen i impedans etter hvert trinn i tillegg. Skriv et dataark med disse verdiene.
- Plott verdiene for maksimal (eller minimum, hvis aktuelt) impedans endres som en funksjon av agonist konsentrasjon. Dette kan gjøres for individuelle brønner eller for gjennomsnitt (gjennomsnittlig ± SD).
- Bruk en datatilpasningsrutine til å bestemme halvmaksimale effektive konsentrasjoner (EC50)og maksimal respons (EMax) ved hjelp av den fire parameterlogistiske modellen (ligning 2):
MERK: c indikerer den pinefull konsentrasjonen, A1 er minimum og A2 er maksimal asymptote i den sigmoidale doseresponskurven (A2 = EMax). EC50 er konsentrasjonen ved bøyningspunktet i kurven, og n tilsvarer Hill-skråningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ordning for å forberede de ulike agonist løsningene er vist for et eksperiment ved hjelp av 8-brønnelektrode arrays med histamin som agonist i tabeller 1-4. Tabell 1 og tabell 2 presenterer volumer og konsentrasjoner for et eksperiment ved hjelp av addisjonsmodus 1 (jf., figur 1),mens tabell 3 og tabell 4 presenterer volumer og konsentrasjoner for et eksperiment etter tilleggsmodus 2 (jf., figur 1). Data er beregnet ved hjelp av ligningen (1).
Et representativt eksperiment er vist i figur 2 for konfluent lag av U-373 MG celler, som endogenely uttrykke histamin 1 reseptoren, dyrket på en 8-brønnelektrode array med en fungerende elektrode på 250 μm diameter ved hjelp av histamin som agonist. Målingen ble utført med en enkelt frekvens på 12 kHz. Tillegg av den pinefull konsentrasjonsserien ble utført etter modus 1. I det valgte eksperimentet ble 10 løsninger med økende histaminkonsentrasjon (utarbeidet i henhold til trinn 4) lagt til sekvensielt hver 15 min (figur 2A). Den seriell doseringsordningen ble brukt på syv av åtte brønner. I et godt smertefritt medium (L-15) ble lagt sekvensielt som en negativ kontroll i ni av ti trinn. Det siste tillegget til denne kontrollen var en histaminløsning som ga en endelig konsentrasjon på 100 μM histamin i brønnen. Data er plottet med dataanalyseprogramvare og vises som impedansendring Δ| Z| 12 kHz / kΩ langs eksperimentet, med impedansendring og tidspunktet for det første tillegget som settes til null. Den første likevektstiden i den eksperimentelle bufferen på 2 timer vises ikke i dette plottet. Tidspunktene for agonist tillegg er angitt med piler.
Endringen i impedans i forhold til grunnlinjen etter hvert konsentrasjonstrinn ble hentet fra kurvene ved hjelp av en datamarkør. Ved trinn uten klart maksimum ble det siste datapunktet før neste tillegg brukt til analyse. Impedans endringer Δ| Z| 12 kHz ble plottet som en funksjon av histaminkonsentrasjon (cx+y) (Figur 2B, symboler). Overføringsfunksjonen til en fire parameter logistic modell (jf. trinn 8.6) ble montert på eksperimentelle datapunkter fra syv brønner (Figur 2B, linjer). Tilpasningsresultatene vises i tabell 5. Figur 2C og figur 2D viser resultatet av snittet av dataene i figur 2A og figur 2B, som presenterer gjennomsnitt ± SD for syv brønner. Gjennomsnittlig tidskursdata summeres i figur 2C, mens den gjennomsnittlige doseresponskurven er gitt i figur 2D.
I doseresponsforhold som vist i figur 2B,D,ble tilpasningsprosedyren påført hele konsentrasjonsområdet som returnerte EC50 = (0,86 ± 0,13) μM. Impedansresponsen øker monotont med økende histaminkonsentrasjon, med unntak av de to siste konsentrasjonstrinnene (30 μM, 100 μM endelig konsentrasjon). Dette svaret er antagelig forklart ved nedregulering av histaminreseptoren, desensialisering eller overstimulering av cellene (se diskusjon). For å ta hensyn til denne effekten er dataområdet for analyse redusert, som vist for ett enkelt seriell doseringseksperiment (figur 3; brønn 1) valgt fra dataene som vises i figur 2. Videre, sette lavere asymptote (A1) til null under minst kvadratoptimalisering forutsatt ingen impedans endring som svar på 0 μM histamin er godt begrunnet. Bruk av denne tre parameteroptimaliseringen gir en EC50 på (0,75 ± 0,12) μM (jf., figur 3B). EC50-verdier ble funnet å være ufølsomme for en av dataanalysemodusene og var ikke signifikant forskjellige.
Typiske resultater for et 96-brønnplateeksperiment summeres i figur 4. U-373 MG celler ble dyrket på 96-brønn elektrode arrays som beskrevet ovenfor. 32 brønner ble inkludert i målingen. 8 brønner fungerte som agonist-frie kontroller, kun utsatt for middels. 24 brønner ble utsatt for en rekke økende histaminkonsentrasjoner beregnet og forberedt for tilsetningsmodus 2. Tidsforløpet for impedansendring er vist for alle 32 individuelle brønner i figur 4A. En av kurvene (uthevet i rødt) viser et uvanlig tidskurs og ble ekskludert fra videre analyse. Følgelig ble data fra 23 brønner i gjennomsnitt og plottet som tidsforløp av gjennomsnittlig impedansendring (gjennomsnittlig ± SD) i figur 4B. Hver enkelt kurve ble analysert som beskrevet ovenfor for doseresponsforholdet. Datapunkter ble i gjennomsnitt og plottet som funksjon av den endelige histaminkonsentrasjonen (figur 4C). Doseresponsdata ble analysert ved hjelp av den fire parameterlogistiske modellen, som returnerte en gjennomsnittlig EC50-verdi på (1,0 ± 0,3) μM.
Et typisk resultat for den seriell agonist addisjonsprotokollen i antagonistmodus vises i figur 5. Her ble en brønn forhåndsbehandlet med 0,75 μM av histaminreseptorantagonisten difenhydramin (rød kurve) 20 min før den første histaminble lagt til (figur 5A). Kontrollen fikk antagonistfritt medium (blå kurve). Antagonisten ble lagt til følgende modus 2, noe som betyr at 200 μL av den endelige 400 μL ble fjernet før agonistserien ble brukt. Agonist (histamin) ble lagt til etter seriell doseringsmodus 1 som beskrevet i eksemplene ovenfor. Det er viktig for eksperimenter i antagonistmodus at antagonistkonsentrasjonen holdes konstant gjennom hele tiden løpet av eksperimentet. Følgelig må alle agonistløsninger som er lagt til brønnen, også inneholde den forhåndsdefinerte antagonistkonsentrasjonen (i dette tilfellet 0,75 μM), mens kontrollen forblir antagonisfri. En antagonistisk effekt blir tydelig av en "forsinket" økning av impedans i seriell doseringsordning som tilsvarer høyere agonistkonsentrasjoner som trengs for å indusere en cellerespons. I doseresponsforholdet uttrykkes effekten av antagonisten som et høyreskifte av kurvene, noe som tilsvarer en økning i EC50, forutsatt at antagonisten er en konkurransedyktig ligand i forhold til den pinefullt (Figur 5B). EC50 ble fastslått å (0,92 ± 0,05) μM i fravær av antagonisten og (14,7 ± 0,6) μM i sin tilstedeværelse.
Figur 1: Seriell agonist addisjonsmoduser. (A) Skjematisk illustrerer konsentrasjonsberegninger. Ved å legge til agonist løsning av konsentrasjon cy og volum Vy til en brønn med volum Vx og agonist konsentrasjon cx,volumet øker til Vx + y og konsentrasjonen øker til c x +y. (B) To forskjellige moduser for seriell agonist tillegg. Modus 1: Det totale volumet i brønnen Vx+y øker med hvert tillegg. Modus 2: Volumet som legges til ved hvert konsentrasjonstrinn, fjernes igjen før neste dose legges til, noe som holder det totale volumet i brønnkonstanten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Resultater av et typisk eksperiment i 8-brønnsformat. (A) Tidsforløp av impedansendring ved 12 kHz for konfluent U-373 MG cellelag dyrket på sirkulære arbeidselektroder på 250 μm diameter. I syv av åtte brønner ble serietillegg av histamin påført. En brønn (grå kurve) ble sekvensielt lastet med histaminfri buffer i hvert trinn (modus 1), med unntak av det siste trinnet da 100 μM histamin ble lagt til som en positiv kontroll. (B) Doseresponsrelasjoner generert fra maksimal impedansendring i forhold til grunnlinjen for syv individuelle brønner etter hvert konsentrasjonstrinn. (C) Gjennomsnittlig tidsforløp av impedansendring (gjennomsnittlig ± SD) generert fra syv individuelle brønner som vist i (A). (D) Gjennomsnittlig doseresponsrelasjoner generert fra individuelle datasett som vist i (B). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tilpasning av dataanalysemoduser. (A) Typisk tidsforløp av impedansendring ved 12 kHz for et enkelt konfluent U-373 MG cellelag dyrket på sirkulære arbeidselektroder med 250 μm diameter. (B) Eksperimentell doseresponsrelasjon (fylte symboler) generert fra maksimal impedansendring i forhold til baseline etter hver konsentrasjonsøkning. Enten ble hele datasettet utsatt for tilpasningsprosedyren (svart og grå kurve) eller det siste datapunktet - noe som indikerer utbruddet av reseptordesensisolering og / eller internalisering - ble utelatt fra kvantitativ analyse (rød og magenta kurve). Alle fire parametrene ble justert under minst kvadratoptimalisering (svart og rød kurve) eller parameteren A1, som representerer den nedre asymptoten, ble satt og festet til null (grå og magentakurve). EC50-verdiene var ikke signifikant forskjellige for de to dataanalysemodusene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Typisk eksperiment i 96-brønnformat. (A) Tidsforløp for impedansendring målt ved 12 kHz for konfluent U-373 MG cellelag dyrket på en 96-brønnelektrodematrise. Data er vist for 32 brønner. 24 brønner ble utsatt for en rekke økende histaminkonsentrasjoner tilsatt med en likevektstid på 15 min mellom hvert trinn. Kurven uthevet i rødt ble utelukket fra snitt. Åtte brønner (kontroll) ble behandlet med histaminfritt medium på hvert tidspunkt i tillegg. (B) Tidsforløp av gjennomsnittlig impedansendring for 23 individuelle brønner som svar på histamin serietillegg og åtte kontrollbrønner som vist i (A). (C) Gjennomsnittlig doseresponsrelasjon generert fra maksimal impedansendring i forhold til grunnlinjen etter hver konsentrasjonsøkning (gjennomsnittlig ± SD). Data ble utstyrt med en fire parameter logistikkfunksjon. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Typisk eksperiment i antagonistmodus. (A) Tidsforløp av impedansendring ved 12 kHz for konfluent U-373 MG cellelag dyrket på sirkulære arbeidselektroder på 250 μm diameter ved tillegg av økende konsentrasjoner av histamin med eller uten tilstedeværelse av histamin reseptor antagonist difenhydramin. Difenhydramin (0,75 μM) eller antagonisfritt medium (L15) ble lagt til 20 min før den agonist seriell doseringen startet. (B) Doseresponsrelasjoner generert fra maksimal impedansendring i forhold til grunnlinjen etter hver konsentrasjonsøkning fra data vist i (A). Tilstedeværelse på 0,75 μM Difenhydramin økte EC50 fra (0,92 ± 0,05) μM til (14,7 ± 0,6) μM. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Løsning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabell 1: Konsentrasjonsberegningsordning for eksperimenter ved hjelp av 8-brønns elektrodematriser etter tilsetningsmodus 1.
| Løsning # | cy (μM) | Vy (μL) | lage fra | c (μM) | fortynningsfaktor | gjøre total V (μl) | bruk (μl) | tilsett V (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Lager | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabell 2: Pipetteringsskjema for eksperimenter ved hjelp av 8-brønns elektrodearrayer etter tilsetningsmodus 1.
| Løsning # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabell 3: Konsentrasjonsberegningsordning for eksperimenter ved hjelp av 8-brønns elektrodematriser etter tilsetningsmodus 2.
| Løsning # | cy (μM) | Vy (μL) | lage fra | c (μM) | fortynningsfaktor | gjøre total V (μl) | bruk (μl) | tilsett V (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | 200 μM lager | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabell 4: Pipetteringsskjema for eksperimenter ved hjelp av 8-brønns elektrodearrayer etter tilsetningsmodus 2.
| Godt | Ec50 (andre) | Emaks (=A2) | En1 | N |
| (μM) | -Jeg har ikke noe å si. | -Jeg har ikke noe å si. | ||
| 1 | 0,9 ± 0,1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1,9 ± 0,5 |
| 2 | 0,7 ± 0,2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1,3 ± 0,4 |
| 3 | 0,6 ± 0,2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1,1 ± 0,5 |
| 4 | 0,6 ± 0,2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1,3 ± 0,4 |
| 5 | 0,9 ± 0,1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1,4 ± 0,3 |
| 6 | 0,8 ± 0,1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1,3 ± 0,3 |
| 7 | 0,6 ± 0,3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1,6 ± 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 ± 0,2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1,1 ± 0,2 |
Tabell 5: Resultater hentet fra fire parameterlogistiske anfall som brukes på typiske doseresponsdata. Doseresponsdataene som brukes til analyse, presenteres i figur 2. Hele konsentrasjonsområdet ble brukt på analyse for de enkelte brønnene en til syv (figur 2B) og for de gjennomsnittlige dataene hentet fra brønner en til syv (figur 2D). Ingen av parameterne for den logistiske funksjonen ble løst under minst kvadratoptimalisering. Tilpasningsresultatene ble avrundet til tiåret med feilen, bortsett fra hvis verdien var mindre enn feilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for etikettfrie impedansmålinger for å bestemme doseresponsforholdet mellom agonist-indusert GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse av spesifikke antagonister for samme reseptor. Bevis på begrepet denne metoden ble presentert i en nylig publikasjon12. Så vidt vi vet er det den første studien som beskriver etableringen av en full doseresponskurve av agonist-mediert GPCR-aktivering ved hjelp av et enkeltcellelag in vitro. Tilnærmingen krever uunngåelig bruk av etikettfrie celleovervåkingsmetoder og vil ikke være aktuelt for endepunktsanalyser.
Protokollen har blitt demonstrert på eksempel et U-373 MG celler, som endogenely uttrykke den menneskelige histamin 1 reseptoren (hHR1) som stimuleres med en rekke økende konsentrasjoner av sin endogene agonist histamin mens impedansen av cellene er kontinuerlig registrert. For å demonstrere anvendelsen av protokollen til antagoniststudier, ble eksperimentene gjentatt i nærvær av en konstant konsentrasjon av difenhydramin, en konkurransedyktig antagonist til hH1R. Impedansopptak har også blitt brukt til å studere andre H1R-agonister (f.eks. UR-KUM53011, individuell og trinnvis dosering) og antagonister (f.eks. Mepyramine)12 i tillegg til eksemplene som vises her. Videre har protokollen blitt brukt på andre cellelinjer og reseptorer også, for eksempel CHO-D2R som uttrykker dopamin D2 reseptoren (D2R) eller BAEC som uttrykkerß2-adrenerge reseptoren (ß2AR)12 som indikerer at den presenterer en generell ordning for svært effektiv generasjon av doseresponsdata. Mens U373-MG og BAEC-celler uttrykker de respektive reseptorene H1R og ß2AR på endogene nivåer, er CHO-D2R et eksempel for en rekombinant cellemodell. Samlet sett gjelder serieprotokollen generelt for celletyper med endogene eller ektopisk GPCR-uttrykk, GPCRs med forskjellige koblingstyper Gq (f.eks. H1R), Gs (f.eks. ß2AR), Gi (f.eks. D2R) samt forskjellige ligandtyper (agonist/antagonist). I alle disse celle/ reseptor typer nevnt ovenfor, impedansøker med økende agonist konsentrasjon. Noen celler reagerer imidlertid på GPCR-aktivering med en impedansreduksjon. Vi testet protokollen for et slikt tilfelle (HaCaT/histamin) og fant også en konsentrasjonsavhengig trinnvis reduksjon, som støtter forestillingen om en generelt anvendelig tilnærming som også er kompatibel med inverse impedansendringer. Det har blitt foreslått at den detaljerte tidsforløpet av impedansdata indikerer typen G-proteinkobling av en gitt reseptor. Selv om konseptet er attraktivt, støtter ikke utvalget av våre data en generelt gjeldende regel som korrelerer impedanstidsprofilen til G-proteinkobling av en gitt GPCR6.
Serial addisjonsprotokollen kan tilpasses ulike typer elektrodeoppsett og multibrønnformater. Det gjelder for on-chip perfusjonssystemer, noe som er en betydelig fordel over mange etikettbaserte tilnærminger som ofte krever ett cellelag for en konsentrasjon som skal testes. Følgelig kan seriedosingordningen bane vei for doseresponsstudier i mer komplekse biologiske modeller som organ-on-a chip eller til og med menneske-på-en-chip tilnærminger. Impedansmålinger oppdager en integrert, distale respons av cellene til reseptoraktivering som til slutt induserer cellemorfologiendringer. Denne ganske generelle og uspesifikke, men også objektive avlesningen er grunnlaget for sin brede anvendelighet som ikke er begrenset til GPCRs, men kan også fungere for andre klasser av celleoverflatereseptorer, cytoplasmatiske reseptorer eller til og med intracellulære proteiner som mål.
Det er avgjørende for den trinnvise agonist addisjonsprotokollen å arbeide med konfluent cellelag på elektrodene, da sparsomme kulturer vil forstyrre følsomhet, reproduserbarhet og datatolkning. En ekstra forutsetning for vellykket overvåking av reseptoraktivering selv i konfluent celle monolayers er en endring i celleform langs signaltransduksjonskaskade. Hvis cellene under studien ikke endrer sin morfologi langs eksperimentet, er impedansbaserte avlesninger blinde og vil ikke rapportere om noen endring i reseptoraktivitet. For å sette opp serieaddiseringsprotokollen på riktig måte, anbefales første pre-testing i konvensjonell en-brønn-en-konsentrasjonsmodus for å bestemme konsentrasjonsområdet til agonisten omtrent og tidsintervallet mellom påfølgende agonist tillegg. Tidsintervaller mellom sekvensielle doser av agonist bør skreddersys slik at systemet vedtar en ny likevekt før neste, tilsettes høyere dose. Følgelig kan metoden være mindre nyttig for reseptorer som utløser en svært rask og bare forbigående respons av cellene eller en svært langsom respons som kan ta timer å fullføre. Den sistnevnte situasjonen ville øke den totale tiden av eksperimentet og ringe for parallelle tillegg protokoller for å kutte kort på lab tid. I eksemplene som presenteres ovenfor var den totale kjøretiden for eksperimentet 2,5 – 3,5 timer, avhengig av antall konsentrasjoner (8 eller 10) og en potensiell preinkubasjon med antagonist. Det samme eksperimentet i konvensjonell parallell agonist addisjonsmodus ville bare ta ~ 1 t for samme cellereseptormodell, men med mye mindre gjennomstrømning. En klar fordel med den seriell tilnærmingen er at antall konsentrasjoner som må testes for et fullstendig doseresponsforhold, ikke er begrenset av antall tilgjengelige brønner. Hvis høyere agonist konsentrasjoner er nødvendig, er eksperimentet lett utvidet og fullført uten ekstra cellekulturarbeid. Agonist tillegg selv bør utføres nøye, som noen celler er følsomme for skjær stress og reagerer med betydelige impedansendringer bare på grunn av mekanisk stimulering pålagt av flytende håndtering. Cellene kan til og med komme av elektroden. Dette problemet er imidlertid ikke unikt for impedansbasert celleovervåking, men gjelder også for andre teknikker. For sensitive celler er addisjonsmodus 1 anbefales på grunn av redusert mekanisk belastning på cellene. Denne modusen opererer imidlertid med lavere væskevolumer under tillegg, noe som øker risikoen for ufullstendig blanding siden intensiv agitasjon ikke anbefales å unngå uspesifikke celleresponser.
Addisjonsmodus 1 går sammen med en trinnvis økning av det totale volumet i brønnen, mens modus 2 holder det totale volumet konstant siden like mengder løsning fjernes sekvensielt. Dette er bare de to ekstreme strategiene og kan tilpasses spesielle celletyper, multi-brønnformater eller elektrodeoppsett på en hvilken som helst mellomliggende måte. I tilfelle av U373-MG/H1R-modellen er det observert små forskjeller i EC50- og EMax-verdier for seriemodus sammenlignet med den konvensjonelle parallelle tilleggsmodusen (seriell, N = 30: EC50: (0,8 ± 0,3) μM, EMax: (1,9 ± 0,2) kΩ; parallell, N = 15: EC50: (0,5 ± 0,2) μM, EMax: (1,3 ± 0,3) kΩ), mens andre celle-/reseptormodeller ikke viste noen forskjeller. Endringer i EC50- og EMax-verdiene kan stamme fra reseptordesensiennisering som er mer sannsynlig å oppstå når reseptorene utsettes for agonist en lengre stund. Desensibiliseringspåvirkningen vil sterkt avhenge av reseptoren og ligandunder studien. Det gjenstår å belyse om en detaljert analyse av seriell og parallell agonist tillegg kan gi et nytt middel til å studere reseptor desensiering.
Vi anbefaler at du utfører et kontrolleksperiment med konvensjonell parallellmodus agonist tillegg for å teste for potensielle skift i dose-respons kurver. Ytterligere kontroller bør bare omfatte en prøve behandlet med middels/løsningsmiddel i passende doser for å avdekke eventuelle effekter på grunn av løsemiddelbelastning eller mekanisk stress ved medium tillegg. Dette blir spesielt viktig hvis lagerløsningen av liganden fremstilles i andre løsemidler enn medium (f.eks. DMSO, etanol). Når man undersøker effekten av forskjellige ligander, bør en standard agonist inkluderes som referanse.
Fremtidige retninger bør innebære automatiske væskehåndteringsenheter, noe som kan tillate fullstendig automatisert dosering eller titrering. Bruk av seriemodus i perfusjonssystemer har et stort potensial for lab-on-a chip- og organ-on a-chip tilnærminger, samt for eksperimenter utført under flytende skjærstress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjelp med cellekulturing og utarbeidelse av eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 "Medisinsk kjemi av selektive GPCR ligands" finansiert av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG) under tilskuddsnummer 222125149. JAS er spesielt takknemlig for et stipend gitt av det bayerske likestillingsprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
