Summary
Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.
Abstract
Ensaios baseados em impedância sem rótulos são cada vez mais usados para estudar contraato sinuoso ativado rGP em experimentos de cultura celular. A abordagem fornece monitoramento celular em tempo real com uma resolução de tempo dependente do dispositivo até várias dezenas de milissegundos e é altamente automatizada. No entanto, quando os números de amostra ficam altos (por exemplo, estudos de dose-resposta para várias ligas diferentes), o custo para as matrizes de eletrodos descartáveis, bem como a resolução de tempo disponível para gravações sequenciais bem-por-bem podem se tornar limitadoras. Portanto, apresentamos aqui um protocolo de adição agonista em série que tem o potencial de aumentar significativamente a produção de ensaios GPCR sem rótulos. Usando o protocolo de adição agonista serial, um agonista gpcr é adicionado sequencialmente em aumentar as concentrações em uma única camada celular enquanto monitora continuamente a impedância da amostra (modo agonista). Com essa abordagem serial, agora é possível estabelecer uma curva completa de resposta de dose para um agonista GPCR de apenas uma camada de célula única. O protocolo de adição agonista serial é aplicável a diferentes tipos de acoplamento GPCR, Gq Gi/0 ou Gs e é compatível com níveis de expressão recombinantes e endógenos do receptor em estudo. O bloqueio de receptores por antagonistas gpcr também é avaliado (modo antagonista).
Introduction
Este relatório apresenta uma descrição detalhada de um protocolo de adição serial desenvolvido para a quantificação da ativação do receptor acoplado por proteínaG induzida por ligand (GPCR) em células cultivadas aderentamente por medições de impedância sem rótulo. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) estão envolvidos em uma infinidade de funções fisiológicas e doenças humanas1. Por causa disso e sua boa acessibilidade na superfície celular, os GPCRs são um dos alvos mais importantes de drogas. Esta avaliação se reflete em um número estimado de ~700 medicamentos aprovados visando GPCRs, equivalente a uma participação de ~35% em todas as drogas comercializadas2.
O desenvolvimento de novas drogas compreende dois processos centrais: (i) a identificação e caracterização funcional de moléculas-alvo biológicas, e (ii) a descoberta de novas substâncias de chumbo e seu desenvolvimento em drogas administradas. Em ambos os processos, métodos eficientes são necessários para avaliar quantitativamente as interações medicamentosas-alvo e a resposta biológica subsequente a jusante. Diferentes estágios do processo pré-clínico de desenvolvimento de medicamentos fazem uso de diferentes métodos de análise que vão desde estudos de interação biomolecular entre medicamentos e alvos, além de estudos funcionais sobre células na cultura, até experimentos sobre material de órgãos excizados ou animais inteiros. Tanto, a significância fisiológica quanto a complexidade biológica aumentam do primeiro para o último3. Embora seja o objetivo global de minimizar os experimentos com animais, estudos farmacológicos usando órgãos isolados de animais de laboratório ou mesmo animais inteiros são considerados inevitáveis para caracterizar de forma abrangente novos candidatos a medicamentos. Em termos de leitura analítica, estudos de farmacologia de órgãos fornecem uma resposta funcional distal e integrativa "holística" de maior relevância fisiológica. Uma desvantagem desses experimentos é que eles não são compatíveis com triagem de alto desempenho por razões técnicas e éticas e foram amplamente substituídos por estudos baseados na cultura celular in vitro4.
Métodos para quantificar a ativação do GPCR nas culturas celulares incluem diferentes ensaios químicos baseados em rótulos, que detectam especificamente segundo mensageiros, estado de fosforilação de proteínas de sinalização a jusante, ativação transcricional através de certos fatores de transcrição ou tráfico de receptor intracelular induzido por ligand4,5. Uma desvantagem desses ensaios baseados em rótulos é a necessidade de rotular as células com corantes potencialmente prejudiciais ou marcadores radioativos. Isso muitas vezes requer executar o ensaio como uma determinação de ponto final para um tempo de exposição que tem que ser especificado um priori. O uso de ensaios de ponto final baseados em rótulos sofre desse timing muito limitado e tendencioso do experimento e do risco de que rótulos químicos e sondas possam interferir na fisiologia celular regular – potencialmente despercebida pelo experimentador.
Nos últimos anos, ensaios sem rótulos para monitoramento da ativação do GPCR surgiram, como técnicas baseadas em impedância ou métodos ópticos que aplicam grades ressonantes de guia de onda5,6. A rotulagem das células não é experimentalmente necessária com essas abordagens. Como essas leituras físicas operam em sinais de baixa amplitude, tais métodos são considerados não invasivos, permitem o monitoramento contínuo celular potencialmente em tempo real e o tempo de observação é limitado apenas pela cultura celular não pela leitura. Semelhante às leituras de órgãos inteiros, abordagens sem rótulos comumente relatam respostas de células holísticas, muito a jusante da ativação do receptor quando a integração ao longo de toda a rede de sinalização leva a mudanças dependentes do tempo, mas sim inespecíficas na morfologia celular ou redistribuição em massa. Considerando que ensaios baseados em impeção medem a assinatura dielétrica de mudanças na forma celular7,8, as medidas usando grades ressonantes de guia de onda são sensíveis a alterações no índice refrativo na interface do substrato celular decorrentes da redistribuição dinâmica de massa (DMR)9. O caractere integrativo torna os métodos livres de rótulos extremamente sensíveis aos eventos mediados por receptores, independentemente do tipo(s) de proteína G (Gq , Gi/0, G12/13) ou β-arrestin envolvido na cascata de sinalização 6 e adequado para níveis endógenos de expressão do receptor.
Em um ensaio baseado em impedância sem rótulo padrão, as células são cultivadas em placas multi-bem com eletrodos de filme de ouro coplanar depositados na parte inferior de cada poço10. Essas matrizes de eletrodos estão conectadas a um analisador de impedância e as respostas das células a um estímulo experimental são registradas a partir de poços individuais por leituras de impedância resolvidas pelo tempo. Em um ensaio típico gpcr um ligand é adicionado em concentrações individualmente diferentes para cada bem individual. As alterações induzidas no curso de tempo de impedância são então analisadas em relação a características de curva característica, como mudança máxima de sinal, área a curva, mudança de sinal dentro de um determinado intervalo de tempo ou inclinação da curva em um ponto de tempo especificado, a fim de quantificar a potência e eficácia do ligand11.
O custo das matrizes de eletrodos pode limitar a aplicação dessa técnica em campanhas de triagem de alto nível (HTS). Além disso, com o aumento do número de amostras a serem seguidas em paralelo, o número de medições individuais aumenta e, assim, reduz a resolução de tempo disponível para cada poço gradualmente - mesmo para gravações multicanais de última geração. Nessas condições, respostas rápidas e transitórias das células podem escapar da medição. Além disso, o convencional bem – uma abordagem de concentração impõe um fator de tempo e custo significativo sem recursos perfundidos em desenvolvimentos de órgãos-on-chip ou body-on-chip em relação à sua adequação na análise de interação ligand-GPCR.
Por essa razão, desenvolvemos um protocolo de dosagem stepwise que permite a gravação de curvas completas de resposta de dose da ativação gpcr induzida por ligand em monocamadas de células cultivadas, monitorando continuamente a impeância de um único poço enquanto a concentração agonista é aumentada stepwise. O protocolo de adição agonista em série aumenta significativamente o throughput por poço de uma concentração para 10 ou mais concentrações, como mostrado no exemplo atual das células U-373 MG humanas, que expressam endógenamente o receptor histamina 1 (H1R). Assim, o método tem o potencial de melhorar significativamente o throughput em estudos de dose-resposta sem rótulos, enquanto a resolução de tempo é mantida no máximo instrumental.
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Protocol
1. Semeade celular em matrizes de eletrodos
NOTA: A seleção do layout do eletrodo é uma troca entre sensibilidade e número de células em estudo. Quanto menor o eletrodo, mais sensível é a medida, mas menor é o número de células em estudo. Para as células que mostram fortes flutuações de impedância ao longo do tempo em condições de linha de base, eletrodos maiores ou interdigitados são preferíveis.
- Pré-aqueça todas as soluções necessárias para a passagem e semeade padrão das células em um banho de água de 37 °C. Para ensaios com células U-373 MG humanas é preciso: salino tampão de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio, 0,05% (w/v) trypsin, cultura celular média (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) suplementada com 5% (v/v) soro de bezerro fetal (FCS), 2 mM L-glutamina e 100 μg/mL penicilina/estreptomicina).
- Enxágüe a camada celular da cultura do estoque cultivada na parte inferior da cultura celular convencional frascos ou pratos com PBS duas vezes.
- Remova o PBS, adicione a solução de trippsina (1 mL para 25 cm2) e deixe as células incubarem a 37 °C por 5 min (aplica-se às células U-373 MG).
- Controle para o distanciamento completo das células do fundo do substrato de crescimento por microscopia.
- Pare a reação da trippsina assim que as células estiverem completamente separadas adicionando 9 mL de cultura celular média por 1 mL de trippsina à suspensão celular. Enxágue cuidadosamente as células remanescentes do fundo do substrato da cultura celular, canalizando a suspensão sobre o substrato.
- Colete a suspensão celular com uma pipeta e transfira-a para um tubo de centrífuga (tubo de 15 mL ou 50 mL).
- Gire as células por centrífuga a 110 x g por 10 min à temperatura ambiente.
- Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda completamente a pelota celular em meio de cultura antes de contar as células (por exemplo, usando um hemacyômetro para microscópios de contraste de fase e contagem manual).
- Ajuste a suspensão celular à densidade celular desejada. Para experimentos com células U-373 MG, use 100 000 células/cm2 para cultivar uma camada celular de confluente dentro de 48 h. Isso se traduz em uma densidade celular de 200 000 células/mL para matrizes de eletrodos de 8 poços com uma área de crescimento de ~0,8 cm2 e um volume de poço de 400 μL.
NOTA: Para experimentos reprodutíveis de ativação gpcr, as células devem ser cultivadas em monocamadas confluentes nas matrizes de eletrodos. Para garantir a expressão adequada do receptor na superfície celular, as células devem ser semeadas pelo menos 36 h antes de realizar o experimento. Testar diferentes densidades celulares para semeadecelular é muitas vezes significativo para identificar as melhores condições experimentais. - Adicione a suspensão celular aos poços da matriz de eletrodos e deixe as vendas se acalmarem à temperatura ambiente por 10 a 15 min, a fim de garantir a distribuição homogênea das células na parte inferior dos poços.
- Cultivar células por pelo menos 36 h em uma incubadora padrão de cultura celular com 5% de CO2 (dependente do tipo médio) a 37 °C e atmosfera umidificada. Mude a cultura celular a 24 h antes do experimento.
- No dia do experimento, inspecione as camadas celulares nas matrizes de eletrodos por microscopia de eletrodos por (contraste de fase) microscopia para garantir a cobertura completa de eletrodos com células.
2. Equilíbrio de células em meio soro-livre
- Meio pré-quente sem soro, neste estudo: o meio L15 de Leibovitz.
- Remova o meio de cultura celular das células cultivadas em matrizes de eletrodos e substitua por meio pré-aquecido sem soro. Use 200 μL para matrizes de eletrodos de formato 8-well e 150 μL para matrizes de eletrodos de 96 poços.
- Deixe as células equilibrarem em meio soro livre de soro a 37 °C por pelo menos 2h. O tempo de equilíbrio depende fortemente do tipo celular. Por exemplo, as células U-373 MG precisam de 2h, as células CHO precisam de 4h, baec pode exigir equilíbrio noturno no meio L-15.
NOTA: O meio L-15 é independente de CO2 e requer uma atmosfera livre de CO2. Para o equilíbrio em L-15, a incubadora de 0 % de CO2. O equilíbrio pode ser monitorado por leituras de impedância, o que recomendamos fazer para os primeiros experimentos.
3. Monitoramento do equilíbrio celular com leituras de impedância
- Coloque a matriz de eletrodos no suporte de matriz de conexão do analisador de impedance.
- Certifique-se de um contato adequado de baixa impedância entre eletrodos e analisador de impedância. Esta verificação é individualmente diferente para diferentes instrumentos.
NOTA: Se o instrumento não fizer conexão com os eletrodos, abra o grampo de contato novamente, reajuste a matriz de eletrodos para o posicionamento adequado dentro do suporte e a reformulação. - Selecione o formato de eletrodo e/ou multi-poço sitonada na interface do usuário do software.
- Configure os parâmetros de medição. Diferentes opções estão disponíveis.
NOTA: Para selecionar a frequência CA mais sensível, referimos-nos aos manuais de literatura e instrumento, pois depende do layout do eletrodo e do tipo celular em estudo. Normalmente, a frequência de sensoriamento está na faixa de 4 kHz – 50 kHz. Aqui, as células U-373 MG foram cultivadas em eletrodos de trabalho circular de 250 μm de diâmetro e foram monitoradas em uma frequência CA de 12 kHz.- Se os modos de aquisição de dados de frequência única e múltipla estiverem disponíveis, selecione o modo de frequência única para garantir a resolução máxima do tempo. A medição será realizada nesta única frequência. Para os instrumentos mais difundidos, há uma série de frequências pré-definidas ao longo da janela de frequência disponível.
- Se o número de poços em estudo for baixo ou a resolução de tempo não for crítica, selecione gravações de várias frequências. As leituras de impedance em um número especificado de frequências serão registradas para todos os poços para análises posteriores em profundidade.
NOTA: A resolução de tempo diminui com o aumento do número de frequências registradas por poço e o aumento do número de poços. As opções de seleção do modo de frequência e aquisição de dados variam de acordo com o tipo de instrumento e a versão.
- Inicie a aquisição de dados do curso de tempo.
- Siga a impedância da camada celular (pelo menos 2 h) até que a impedância tenha estabilizado. Enquanto isso, prepare as soluções agonistas.
- Quando as camadas de células atingirem um nível estável de impedância, ou (i) proceder para a adição agonista em série dentro do mesmo experimento ou (ii) encerrar a aquisição de dados e iniciar um novo conjunto de dados para monitorar a ativação do receptor induzido por agonistas.
4. Preparação de soluções agonistas para experimentos em modo agonista
- Calcule a concentração de soluções agonistas conforme necessário para cada etapa da dosagem em série de acordo com a equação (1). n varia de 1 ao número total de adições em série i. x denota concentração e volume no poço na etapa n. y denota concentração e volume da "solução a ser adicionada" na etapa n.
NOTA: Considere o número de réplicas e calcule o volume total de "solução a ser adicionada" para cada etapa de concentração. Os resultados de um cálculo típico são dados nas tabelas 1-4. É preciso uma ideia geral sobre a faixa de concentração agonista para ser estudada, pois a faixa define as concentrações e o número de porções a serem administradas durante a adição serial. Usando o protocolo de adição agonista serial, a concentração agonista é aumentada stepwise. Portanto, a quantidade de agonista já está no poço quando a próxima dose é adicionada tem que ser levada em conta. Quando o número de moléculas agonistas já presentes no poço é de nx = cx =Vx (com a concentração atual cx e volume Vx) e o número de moléculas no poço após a próxima adição é nx+y, o número de moléculas a serem adicionadasn y é determinado pela concentração cy e volume Vy da solução a ser aplicada ao poço (ny =c y ◗ Vy). Depois de adicionar uma porção de agonista, a nova quantidade de moléculas agonistas no poço é: cx+y ◗ Vx+y = cx ◗ Vx + cy ◗ Vy. Este cálculo se aplica a cada etapa subsequente. Devido à interdependência da concentração agonista no poço e à quantidade de agonista nas porções a serem adicionadas a cada passo, é importante definir as concentrações finais após cada passo de antecedência.
Modo 1: O volume no poço aumentará a cada passo à medida que o líquido é continuamente adicionado.
Usando este modo e um formato de 8 poços, use Vx1 = 200 μL e Vy1 .... Vyi = 30 μL.
Modo 2: O volume no poço é constante, pois o volume adicionado a cada etapa é removido pouco antes da adição subsequente.
Usando este modo e um formato de 96 poços, use Vx1 = 150 μL e Vy1 .... Vyi = 75 μL.
- Imprima a folha de dados com o volume total por concentração e instruções detalhadas para pipetting.
- Prepare todas as soluções no valor necessário. Faça todas as soluções agonistas no mesmo meio sem soro que usado para o equilíbrio das células.
ATENÇÃO: O dihidrocloreto de histamina é considerado perigoso pelo Padrão de Comunicação de Risco OSHA de 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamina causa irritação da pele, irritação grave nos olhos, pode causar reação alérgica à pele, alergia, sintomas de asma ou dificuldades respiratórias se inalada e pode causar irritação respiratória. Por favor, considere a ficha de segurança.
NOTA: Faça soluções agonistas o mais frescas possível. A estabilidade dos agonistas na solução pode variar consideravelmente. Armazene soluções a 4 °C ou abaixo até o uso no experimento. Para algumas moléculas, aditivos estabilizadores adicionais, como a BSA, ao usar moléculas à base de peptídeos ou à base de lipídios, podem ser considerados para evitar adsorção às paredes de poços e tubos. - Se realizar o experimento em formato de 96 poços, transfira soluções para uma placa convencional de 96 poços (sem eletrodos) e use um tubo de canal de 8(ou 12-) para transferência rápida de líquido para a matriz de eletrodos.
5. Preparação de soluções agonistas para experimento em modo antagonista
NOTA: Prepare a solução antagonista com a concentração a ser aplicada durante todo o processo. O volume e a concentração da solução antagonista dependem do modo de adição agonista (1 ou 2). Exemplos para experimentos em formato de 8 poços ou 96 poços no modo de adição 2: (A) formato de 8 poços (Vx1 = 200 μL, VAntagonist = 200 μL); (B) formato de 96 poços (Vx1 = 150 μL, VAntagonist = 75 μL).
- Calcule a concentração de cada solução agonista necessária para cada etapa da dosagem em série, conforme descrito na etapa 4.1.
- Faça todas as soluções agonistas no mesmo meio sem soro usado para o equilíbrio das células e adicione o antagonista na mesma concentração final planejada para os respectivos poços no experimento.
NOTA: Neste caso, a solução de estoque de histamina (10 mM) é preparada em meio L-15. Quando os agonistas são dissolvidos em outros solventes (por exemplo, sulfoxide dimetil (DMSO), o etanol) deve ser incluído para explicar o aumento da carga de solventes a cada etapa de adição.
6. Realizar o protocolo de adição serial no modo agonista
- Inicie a aquisição de dados conforme descrito nas etapas 3.1 – 3.5.
- Pré-aqueça as soluções agonistas antes de usá-las colocando-as na incubadora cerca de 10 a 15 min antes da adição.
NOTA: Ao usar substâncias termolabile, as soluções não devem ser mantidas a 37 °C por muito tempo. Se o pré-aquecimento de 10 a 15 min for considerado crítico, traga soluções para 37 °C pouco antes de adição em um banho de água. - Execute a dosagem serial agonista dependente do modo de adição selecionado. Seguindo o modo 1 o volume total no poço aumenta a cada adição da próxima dose. No modo 2, o mesmo volume adicionado a cada passo também é removido novamente pouco antes de adicionar a próxima dose mais alta.
NOTA: O tempo necessário para o equilíbrio da camada celular entre duas doses agonistas subsequentes depende do tempo de resposta das células. Um experimento inicial no modo paralelo (um bem – uma concentração) revela (i) tempos de resposta celular para diferentes concentrações agonistas e (ii) o parâmetro de curva mais sensível (por exemplo, no máximo da impedância, impedância após o tempo x).
A: Formato modo 1 / 8-well
- Adicione 30 μL da primeira solução com a menor concentração de agonista às células que foram equilibradas em 200 μL de meio soro livre de soro.
- Deixe as células responderem e equilibrem o período pré-definido de tempo (por exemplo, 15 min).
- Adicione 30 μL da segunda solução com a próxima maior concentração.
- Repita as etapas 6.3.1-6.3.3 com a terceira, quarta, e assim por diante, solução agonista.
NOTA: Trabalhar com 10 etapas de concentração resultará em um volume total de 500 μL no final do experimento, que está um pouco abaixo do volume máximo aplicável desses poços de ~ 550 μL.
B: Formato modo 2 / 96-well
NOTA: Pausa a aquisição de dados durante cada etapa de manuseio líquido (adição/remoção) através do software do instrumento de impedância ao executar experimentos em formato de 96 poços. A movimentação líquida mais elaborada pode interferir na aquisição de dados. Use uma pipeta multicanal.
- Pausa na aquisição de dados.
- Adicione 75 μL da primeira solução com a menor concentração de agonista às células que foram equilibradas em 150 μL de meio soro livre de soro.
- Retome a aquisição de dados.
- Deixe as células responderem e equilibrem o período pré-definido de tempo (por exemplo, 15 min).
- Cerca de 1 a 2 min antes do tempo de equilíbrio regular terminar, pausar a medição e remover 75 μL de cada poço.
NOTA: O ponto de tempo em que a solução deve ser removida depende do número de poços monitorados em paralelo e da velocidade de tubulação. O tempo necessário para a remoção das soluções não deve exceder o tempo entre as etapas subsequentes. - Adicione 75 μL da segunda solução com a próxima maior concentração e retome a medição.
- Repita as etapas 6.3.8-6.3.10 com a terceira, quarta, e assim por diante, solução agonista.
7. Realizar o protocolo de adição serial no modo antagonista
- Inicie a medição conforme descrito nas etapas 3.1 – 3.5.
- Durante o equilíbrio das camadas celulares, prepare a solução antagonista (por exemplo, 200 μL de cloridrato de difenidágua de 1,5 μM no meio L15).
ATENÇÃO: Cloridrato de difenidágua tem potenciais efeitos agudos na saúde. É prejudicial se engolido ou inalado, pode causar irritação nos olhos e na pele. Pode causar irritação respiratória e do trato digestivo. Por favor, considere a ficha de segurança. - Pré-aqueça as soluções antagonistas e agonistas colocando-as na incubadora cerca de 10 a 15 min antes de se adição às culturas celulares (cf. 6.2). Se os poços sem antagonistas forem incluídos no ensaio também, também meio pré-quente sem soro.
- Adicione a solução antagonista aos poços designados. Deixe as células equilibrarem com o antagonista por 15 a 20 min. Se os poços sem antagonistas forem incluídos, adicione o mesmo volume de meio sem soro a esses poços.
- De acordo com a adição antagonista no modo 2,remova a solução dos poços
(A) formato 8-well (200 μL)
(B) formato de 96 poços (75 μL) - Execute a sequência de adição agonista como descrito na etapa 6.3.
8. Exportação e análise de dados
- Dados de exportação usando o software do instrumento de impedância, a fim de converter todos os dados registrados de proprietários em formatos de dados comuns (por exemplo, csv). Esta etapa permite a reorganização e apresentação de dados com outros pacotes de software.
- Carregue os dados formatados pelo CSV para software de análise de dados científicos.
- Normalize os valores de impedância subtraindo a impugenção do último ponto de dados antes da primeira adição da solução agonista e definindo o tempo de acréscimo para t = 0. Traçar o curso de tempo da impedância normalizada.
- Traçar os cursos de tempo individuais e identificar a máxima em impedância após cada etapa de acréscimo. Componha uma folha de dados com esses valores.
- Traçar os valores de alterações máximas (ou mínimas, se aplicável) de impedância em função da concentração agonista. Isso pode ser feito para poços individuais ou para as médias (média ± SD).
- Use uma rotina de montagem de dados para determinar concentrações eficazes semi-máximas (EC50)e resposta máxima (EMax)usando o modelo logístico de quatro parâmetros (equação 2):
NOTA: c indica a concentração agonista, A1 é o mínimo e A2 é o máximo assimptote da curva sigmoidal dose-resposta (A2 = EMax). EC50 é a concentração no ponto de inflexão da curva, e n corresponde à encosta da Colina.
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Representative Results
Um esquema típico para preparar as várias soluções agonistas é mostrado para um experimento usando matrizes de eletrodos de 8 poços com histamina como agonista nas tabelas 1-4. Tabela 1 e Tabela 2 apresentam volumes e concentrações para um experimento utilizando o modo de adição 1 (cf., Figura 1),enquanto a Tabela 3 e a Tabela 4 apresentam volumes e concentrações para um experimento seguindo o modo de adição 2 (cf., Figura 1). Os dados foram calculados utilizando-se equação (1).
Um experimento representativo é mostrado na Figura 2 para camadas de confluentes de células U-373 MG, que expressam endógenamente o receptor histamina 1, cultivado em uma matriz de eletrodos de 8 poços com um eletrodo funcionando de 250 μm de diâmetro usando histamina como agonista. A medição foi realizada em uma única frequência de 12 kHz. A adição da série de concentração agonista foi realizada seguindo o modo 1. No experimento selecionado 10 soluções com aumento da concentração de histamina (preparada de acordo com a etapa 4) foram adicionadas sequencialmente a cada 15 minutos (Figura 2A). O esquema de dosagem em série foi aplicado a sete dos oito poços. Em um meio bem agonista (L-15) foi adicionado sequencialmente como um controle negativo em nove de dez etapas. A última adição a este controle foi uma solução de histamina que proporciona uma concentração final de 100 μM histamina no poço. Os dados foram traçados com software de análise de dados e são mostrados como mudança de impedância Δ| Z| 12 kHz / kΩ ao longo do experimento, com a mudança de impedância e o ponto de tempo da primeira adição sendo definido para zero. O tempo inicial de equilíbrio no buffer experimental de 2h não é mostrado nesta trama. Os pontos de tempo da adição agonista são indicados por setas.
A mudança na impedância em relação à linha de base após cada etapa de concentração foi extraída das curvas usando um cursor de dados. Em etapas sem máxima clara, o último ponto de dados antes da próxima adição foi utilizado para análise. Mudanças de impeção Δ| Z| 12 kHz foram traçados em função da concentração de histamina (cx+y) (Figura 2B, símbolos). A função de transferência de um modelo logístico de quatro parâmetros (cf. etapa 8.6) foi montada nos pontos de dados experimentais de sete poços (Figura 2B, linhas). Os resultados do ajuste são mostrados na Tabela 5. Figura2C e Figura 2D mostram o resultado da média dos dados na Figura 2A e Figura 2B,apresentando média ± SD para sete poços. Os dados médios do curso de tempo são resumidos na Figura 2C,enquanto a curva média de dose-resposta é fornecida na Figura 2D.
Nas relações de dose-resposta, como mostrado na Figura 2B,D,o procedimento de montagem foi aplicado a toda a faixa de concentração retornando EC50 = (0,86 ± 0,13) μM. A resposta à impedância aumenta monotonicamente com o aumento da concentração de histamina, exceto pelas duas últimas etapas de concentração (30 μM, concentração final de 100 μM). Essa resposta é presumivelmente explicada pela redução da regulação do receptor de histamina, dessensibilização ou superestimulação das células (ver discussão). Para explicar esse efeito, a faixa de dados para análise foi reduzida, como mostra um único experimento de dosagem em série (Figura 3; bem 1) selecionado a partir dos dados mostrados na Figura 2. Além disso, definir o assímptote inferior (A1) a zero durante a otimização menos quadrada assumindo que nenhuma mudança de impedância em resposta a 0 μM histamina é bem justificada. A aplicação desta otimização de três parâmetros fornece um EC50 de (0,75 ± 0,12) μM (cf., Figura 3B). Os valores eC50 foram considerados insensíveis para qualquer um dos modos de análise de dados e não foram significativamente diferentes.
Os resultados típicos para um experimento de placa de 96 poços são resumidos na Figura 4. As células U-373 MG foram cultivadas em matrizes de eletrodos de 96 poços como descrito acima. 32 poços foram incluídos na medição. 8 poços servidos como controles livres de agonistas, expostos apenas a meio. 24 poços foram submetidos a uma série de concentrações crescentes de histamina calculadas e preparadas para o modo de adição 2. O curso de tempo da mudança de impedância é mostrado para todos os 32 poços individuais na Figura 4A. Uma das curvas (destacada em vermelho) mostra um curso de tempo incomum e foi excluída de análises posteriores. Assim, os dados de 23 poços foram medianos e traçados como curso de tempo de mudança média de impedância (média ± SD) na Figura 4B. Cada curva individual foi analisada como descrito acima para a relação dose-resposta. Os pontos de dados foram mediados e traçados em função da concentração final de histamina(Figura 4C). Os dados de dose-resposta foram analisados por meio do modelo logístico de quatro parâmetros, que devolveu um valor médio de EC50 de (1,0 ± 0,3) μM.
Um resultado típico para o protocolo de adição agonista em série no modo antagonista é mostrado na Figura 5. Aqui, um poço foi pré-tratado com 0,75 μM do receptor de histamina antagonista difenidínico (curva vermelha) 20 min antes da primeira histamina ser adicionada(Figura 5A). O controle recebeu meio sem antagonistas (curva azul). O antagonista foi adicionado seguindo o modo 2,o que significa que 200 μL dos finalmente 400 μL foram removidos antes da série agonista ser aplicada. O agonista (histamina) foi adicionado após a dosagem serial modo 1 como descrito nos exemplos acima. É importante para experimentos no modo antagonista que a concentração de antagonistas seja mantida constante durante todo o tempo do experimento. Assim, todas as soluções agonistas adicionadas ao poço também devem conter a concentração de antagonistas pré-definida (neste caso, 0,75 μM), enquanto o controle permanece livre de antagonistas. Um efeito antagônico torna-se evidente por um aumento "atrasado" da impedância dentro do esquema de dosagem em série correspondente a concentrações agonistas mais elevadas necessárias para induzir uma resposta celular. Na relação dose-resposta o efeito do antagonista é expresso como uma mudança para a direita das curvas, que corresponde a um aumento na EC50, desde que o antagonista seja um ligand competitivo em relação ao agonista (Figura 5B). O EC50 foi determinado a (0,92 ± 0,05) μM na ausência do antagonista e (14,7 ± 0,6) μM em sua presença.
Figura 1: Modos de adição agonista em série. (A)Cálculos de concentração esquemáticas. Adicionando solução agonista de concentração cy e volume Vy a um poço com volume Vx e concentração agonista cx,o volume aumenta para Vx+y e a concentração aumenta para cx+y. (B)Dois modos diferentes para adição agonista em série. Modo 1: O volume total no poço Vx+y aumenta a cada adição. Modo 2: O volume adicionado em cada etapa de concentração é removido novamente antes da próxima dose ser adicionada, o que mantém o volume total no poço constante. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Resultados de um experimento típico em formato 8-well. (A) O curso de mudança de tempo de impedância a 12 kHz para camadas de células sub-373 MG cultivadas em eletrodos de trabalho circular de 250 μm de diâmetro. Em sete dos oito poços de adição serial de histamina foi aplicada. Um poço (curva cinza) foi seqüentemente carregado com buffer livre de histamina em cada etapa (modo 1), exceto pela última etapa em que a histamina de 100 μM foi adicionada como um controle positivo. (B)As relações de resposta de dose geradas a partir da mudança máxima de impedância em relação à linha de base para sete poços individuais após cada etapa de concentração. (C) Curso médio de mudança de impedância (média ± SD) gerada a partir de sete poços individuais como mostrado em (A). (D) Relações médias de dose-resposta geradas a partir de conjuntos de dados individuais como mostrado em (B). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Adaptação dos modos de análise de dados. (A) Curso de tempo típico de mudança de impedância a 12 kHz para uma única camada celular Sub-373 MG de confluente cultivada em eletrodos de trabalho circular de 250 μm de diâmetro. (B)Relação experimental de dose-resposta (símbolos preenchidos) gerada a partir da mudança máxima de impedância em relação à linha de base após cada aumento de concentração. Ou o conjunto completo de dados foi submetido ao procedimento de montagem (curva preta e cinza) ou o último ponto de dados - indicando o início da dessensibilização receptora e/ou internalização - foi omitido a partir de análise quantitativa (curva vermelha e magenta). Todos os quatro parâmetros foram ajustados durante a otimização menos quadrada (curva preta e vermelha) ou o parâmetro A1, representando o assímptote inferior, foi definido e fixado a zero (curva cinza e magenta). Os valores de EC50 não foram significativamente diferentes para os dois modos de análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Experimento típico em formato de 96 poços. (A) Curso de tempo de mudança de impedância medido em 12 kHz para confluentes U-373 MG camadas celulares cultivadas em uma matriz de eletrodos de 96 poços. Os dados são mostrados para 32 poços. 24 poços foram submetidos a uma série de concentrações crescentes de histamina adicionadas com um tempo de equilíbrio de 15 min entre cada etapa. A curva destacada em vermelho foi excluída da média. Oito poços (controle) foram tratados com meio livre de histamina em cada ponto de adição. (B) Curso de tempo de mudança média de impedância para 23 poços individuais em resposta à adição em série de histamina e oito poços de controle, como mostrado em (A). (C)Relação média de dose-resposta gerada a partir da mudança máxima de impedância em relação à linha de base após cada aumento de concentração (média ± SD). Os dados foram equipados com uma função logística de quatro parâmetros. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Experiência típica no modo antagonista. (A) O curso de mudança de tempo de mudança de impedância a 12 kHz para camadas de células subfluentes U-373 MG cultivadas em eletrodos de trabalho circular de 250 μm de diâmetro após a adição de concentrações crescentes de histamina com ou sem presença de difenidímio antagonista do receptor de histamina. Difenidina (0,75 μM) ou meio sem antagonistas (L15) foram adicionadas 20 min antes do início da dosagem em série agonista. (B)As relações de resposta de dose geradas a partir da mudança máxima de impedância em relação à linha de base após cada aumento de concentração dos dados mostrados em (A). A presença de difenidina de 0,75 μM aumentou o EC50 de (0,92 ± 0,05) μM para (14,7 ± 0,6) μM. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Solução # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 230 | 30 | 0.08 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 230 | 260 | 30 | 0.79 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 260 | 290 | 30 | 2.03 |
| 4 | 1 | 0.3 | 290 | 320 | 30 | 7.77 |
| 5 | 3 | 1 | 320 | 350 | 30 | 24.33 |
| 6 | 10 | 3 | 350 | 380 | 30 | 91.67 |
| 7 | 30 | 10 | 380 | 410 | 30 | 283.33 |
| 8 | 100 | 30 | 410 | 440 | 30 | 1056.67 |
Tabela 1: Esquema de cálculo de concentração para experimentos usando matrizes de eletrodos de 8 poços seguindo o modo de adição 1.
| Solução # | cy (μM) | Vy (μL) | fazer de | c (μM) | fator de diluição | fazer V total (μl) | usar (μl) | adicionar V (μl) |
| 1 | 0.08 | 30 | 3 | 2.03 | 26.52 | 600 | 22.6 | 577.4 |
| 2 | 0.79 | 30 | 4 | 7.77 | 9.83 | 600 | 61 | 539 |
| 3 | 2.03 | 30 | 5 | 24.33 | 11.97 | 600 | 50.1 | 549.9 |
| 4 | 7.77 | 30 | 6 | 91.67 | 11.8 | 600 | 50.8 | 549.2 |
| 5 | 24.33 | 30 | 7 | 283.33 | 11.64 | 600 | 51.5 | 548.5 |
| 6 | 91.67 | 30 | 8 | 1056.67 | 11.53 | 600 | 52.1 | 547.9 |
| 7 | 283.33 | 30 | 8 | 1056.67 | 3.73 | 600 | 160.9 | 439.1 |
| 8 | 1056.67 | 30 | 10 mM Stock | 10000 | 9.46 | 800 | 84.5 | 715.5 |
Tabela 2: Esquema de pipetting para experimentos usando matrizes de eletrodos de 8 poços seguindo o modo de adição 1.
| Solução # | cx+y (μM) | cx (μM) | Vx (μL) | Vx+y (μL) | Vy (μL) | cy (μM) |
| 1 | 0.01 | 0 | 200 | 400 | 200 | 0.02 |
| 2 | 0.1 | 0.01 | 200 | 400 | 200 | 0.19 |
| 3 | 0.3 | 0.1 | 200 | 400 | 200 | 0.5 |
| 4 | 1 | 0.3 | 200 | 400 | 200 | 1.7 |
| 5 | 3 | 1 | 200 | 400 | 200 | 5 |
| 6 | 10 | 3 | 200 | 400 | 200 | 17 |
| 7 | 30 | 10 | 200 | 400 | 200 | 50 |
| 8 | 100 | 30 | 200 | 400 | 200 | 170 |
Tabela 3: Esquema de cálculo de concentração para experimentos usando matrizes de eletrodos de 8 poços seguindo o modo de adição 2.
| Solução # | cy (μM) | Vy (μL) | fazer de | c (μM) | fator de diluição | fazer V total (μl) | usar (μl) | adicionar V (μl) |
| 1 | 0.02 | 200 | 3 | 0.5 | 25 | 1000 | 40 | 960 |
| 2 | 0.19 | 200 | 4 | 1.7 | 8.95 | 1000 | 111.8 | 888.2 |
| 3 | 0.5 | 200 | 5 | 5 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 4 | 1.7 | 200 | 6 | 17 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 5 | 5 | 200 | 7 | 50 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 6 | 17 | 200 | 8 | 170 | 10 | 1000 | 100 | 900 |
| 7 | 50 | 200 | 8 | 170 | 3.4 | 1000 | 294.1 | 705.9 |
| 8 | 170 | 200 | Estoque de 200 μM | 200 | 1.18 | 1300 | 1105 | 195 |
Tabela 4: Esquema de pipetting para experimentos usando matrizes de eletrodos de 8 poços seguindo o modo de adição 2.
| Bem | EC50 | Emax (=A2) | A1 | N |
| (μM) | (kΩ) | (Ω) | ||
| 1 | 0,9 ± 0,1 | 1680 ± 70 | 150 ± 80 | 1,9 ± 0,5 |
| 2 | 0,7 ± 0,2 | 1770 ± 90 | 200 ±140 | 1,3 ± 0,4 |
| 3 | 0,6 ± 0,2 | 1700 ± 100 | 60 ± 250 | 1,1 ± 0,5 |
| 4 | 0,6 ± 0,2 | 2000 ± 100 | 140 ± 180 | 1,3 ± 0,4 |
| 5 | 0,9 ± 0,1 | 1810 ± 60 | 160 ± 80 | 1,4 ± 0,3 |
| 6 | 0,8 ± 0,1 | 1950 ± 70 | 200 ± 110 | 1,3 ± 0,3 |
| 7 | 0,6 ± 0,3 | 1700 ± 200 | 260 ± 250 | 1,6 ± 1,0 |
| 1 – 7 | 0,7 ± 0,2 | 1900 ± 100 | 100 ± 100 | 1,1 ± 0,2 |
Tabela 5: Resultados obtidos a partir de quatro ajustes logísticos de parâmetro aplicados a dados típicos de dose-resposta. Os dados de dose-resposta utilizados para análise são apresentados na Figura 2. A faixa de concentração completa foi aplicada à análise dos poços individuais de um a sete (Figura 2B) e para os dados médios obtidos dos poços de um a sete (Figura 2D). Nenhum dos parâmetros da função logística foi fixado durante a otimização menos quadrada. Os resultados foram arredondados para a década do erro, exceto se o valor era menor do que o erro.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para medições de impedância sem rótulos para determinar a relação de dose-resposta da ativação gpcr induzida por agonistas na ausência ou presença de antagonistas específicos para o mesmo receptor. A prova de conceito desse método foi apresentada em uma publicação recente12. Para nosso conhecimento, é o primeiro estudo descrevendo o estabelecimento de uma curva completa de resposta de dose da ativação GPCR mediada por agonistas usando uma única camada celular in vitro. A abordagem requer inevitavelmente o uso de abordagens de monitoramento de células livres de rótulos e não será aplicável a ensaios de ponto final.
O protocolo foi demonstrado no exemplo das células U-373 MG, que expressam endógenamente o receptor de histamina humana 1 (hHR1) que é estimulado com uma série de concentrações crescentes de sua histamina agonista endógena, enquanto a impegenização das células é continuamente registrada. Para demonstrar a aplicabilidade do protocolo aos estudos antagonistas, os experimentos foram repetidos na presença de uma concentração constante de difenidência, um antagonista competitivo ao hH1R. Gravações de impedance também foram usadas com sucesso para estudar outros agonistas H1R (por exemplo, UR-KUM53011, dosagem individual e stepwise) e antagonistas (por exemplo, Mepyramine)12, além dos exemplos mostrados aqui. Além disso, o protocolo também foi aplicado a outras linhas e receptores celulares, por exemplo, cho-D2R expressando o receptor D2 de dopamina D2 (D2R) ou BAEC expressando o receptor ß2-adrenergic (ß2AR)12 indicando que apresenta um esquema geral para geração muito eficiente de dados de resposta de dose. Enquanto as células U373-MG e BAEC expressam os respectivos receptores H1R e ß2AR em níveis endógenos, o CHO-D2R é um exemplo para um modelo de célula recombinante. Juntos, o protocolo serial é geralmente aplicável aos tipos de células com expressão GPCR endógeno ou ectópica, GPCRs com diferentes tipos de acoplamento Gq (por exemplo, H1R), Gs (por exemplo, ß2AR), Gi (por exemplo, D2R) bem como diferentes tipos de ligand (agonista/antagonista). Em todos esses tipos de células/receptores mencionados acima, a impedância aumenta com o aumento da concentração agonista. No entanto, algumas células respondem à ativação do GPCR por uma diminuição da impedância. Testamos o protocolo para um desses casos (HaCaT/histamina) e encontramos também uma diminuição de stepwise dependente da concentração, apoiando a noção de uma abordagem geralmente aplicável que também é compatível com mudanças inversas de impeonação. Foi proposto que o curso detalhado de tempo de dados de impedância indica o tipo de acoplamento g-proteína de um determinado receptor. Embora o conceito seja atraente, o pool de nossos dados não suporta uma regra geralmente aplicável que correlaciona o perfil de tempo de impetoda ao acoplamento de proteína G de um determinado GPCR6.
O protocolo de adição serial é adaptável a diferentes tipos de layouts de eletrodos e formatos multi-poços. É aplicável aos sistemas de perfusão no chip, o que é uma vantagem significativa sobre muitas abordagens baseadas em rótulos que muitas vezes requerem uma camada celular para que uma concentração seja testada. Assim, o esquema de dosagem em série pode abrir caminho para estudos de dose-resposta em modelos biológicos mais complexos, como organ-on-a chip ou até mesmo abordagens humanas em um chip. As medidas de impeção detectam uma resposta integrada e distal das células à ativação do receptor que, em última análise, induz mudanças de morfologia celular. Esta leitura bastante geral e não específica, mas também imparcial, é a base para sua ampla aplicabilidade que não se restringe aos GPCRs, mas também pode funcionar para outras classes de receptores de superfície celular, receptores citoplasmáticos ou mesmo proteínas intracelulares como alvos.
É fundamental que o protocolo de adição agonista stepwise trabalhe com camadas de células confluentes nos eletrodos, pois culturas esparsas interferirão na sensibilidade, reprodutibilidade e interpretação de dados. Um pré-requisito adicional para o monitoramento bem sucedido da ativação do receptor mesmo em monocamadas de células confluentes é uma mudança na forma celular ao longo da cascata de transdução de sinal. Se as células em estudo não mudarem sua morfologia ao longo do experimento, as leituras baseadas em impedância são cegas e não informarão sobre qualquer mudança na atividade do receptor. Para layout adequado do protocolo de adição serial, recomenda-se o pré-teste inicial no modo convencional de concentração de um poço-um para determinar a faixa de concentração do agonista aproximadamente e o intervalo de tempo entre as adições agonistas subsequentes. Intervalos de tempo entre doses sequenciais do agonista devem ser adaptados de tal forma que o sistema adote um novo equilíbrio antes da próxima dose mais alta é adicionada. Assim, o método pode ser menos útil para receptores que desencadeiam uma resposta muito rápida e apenas transitória das células ou uma resposta muito lenta que pode levar horas para ser concluída. Esta última situação aumentaria o tempo total do experimento e exigiria protocolos paralelos de adição para reduzir o tempo do laboratório. Nos exemplos apresentados acima, o tempo total de execução do experimento foi de 2,5 a 3,5 h, dependendo do número de concentrações (8 ou 10) e uma potencial pré-incubação com o antagonista. O mesmo experimento no modo convencional de adição agonista paralela levaria apenas ~ 1 h para o mesmo modelo de receptor celular, mas com throughput muito menor. Uma clara vantagem da abordagem serial é que o número de concentrações que precisam ser testadas para uma relação completa de dose-resposta não é limitado pelo número de poços disponíveis. Se forem necessárias concentrações agonistas mais altas, o experimento é facilmente estendido e concluído sem qualquer trabalho adicional de cultura celular. A adição agonista em si deve ser realizada cuidadosamente, pois algumas células são sensíveis ao estresse da cisalhamento e respondem com mudanças consideráveis de impegenção simplesmente devido à estimulação mecânica imposta pelo manuseio líquido. As células podem até sair do eletrodo. Esse problema, no entanto, não é exclusivo para o monitoramento de células baseadaem em impedância, mas também se aplica a outras técnicas. Para células sensíveis, recomenda-se que o modo de adição 1 seja recomendado devido à redução da carga mecânica nas células. No entanto, este modo opera com volumes líquidos mais baixos durante a adição, o que aumenta o risco de mistura incompleta, uma vez que a agitação intensiva não é recomendada para evitar respostas inespecíficas das células.
O modo de adição 1 acompanha um aumento stepwise do volume total no poço, enquanto o modo 2 mantém o volume total constante, uma vez que quantidades iguais de solução são sequenciais removidas. Estas são apenas as duas estratégias extremas e podem ser adaptadas para tipos especiais de células, formatos multi-poços ou layouts de eletrodos de qualquer forma intermediária. No caso do modelo U373-MG/H1R pequenas diferenças nos valores EC50 e EMax foram observadas para o modo de adição serial em comparação com o modo de adição paralelo convencional (serial, N = 30: EC50: (0,8 ± 0,3) μM, EMax: (1,9 ± 0,2) kΩ; paralelo, N = 15: EC50: (0,5 ± 0,2) μM, EMax: (1,3 ± 0,3) kΩ), enquanto outros modelos de célula/receptor não apresentaram diferenças. Mudanças nos valores eC50 e EMax podem ter origem na dessensibilização receptora que é mais provável que ocorra quando os receptores são expostos ao agonista por tempos mais longos. A influência da dessensibilização dependerá fortemente do receptor e da ligand em estudo. Resta elucidar se uma análise detalhada da adição agonista em série e paralela pode fornecer um novo meio de estudar a dessensibilização do receptor.
Recomendamos realizar um experimento de controle com adição agonista convencional do modo paralelo, a fim de testar possíveis mudanças nas curvas de resposta de dose. Outros controles devem incluir uma amostra tratada apenas com média/solvente em doses apropriadas para desvendar quaisquer efeitos devido à carga solvente ou estresse mecânico após a adição média. Isso se torna particularmente importante se a solução de estoque do ligand for preparada em outros solventes do que médio (por exemplo, DMSO, etanol). Ao investigar o efeito de diferentes ligantes, um agonista padrão deve ser incluído como referência.
As instruções futuras devem envolver unidades automáticas de manuseio de líquidos, o que pode permitir a dosagem ou titulação completamente automatizada. A aplicação do modo de adição serial em sistemas de perfusão tem grande potencial para abordagens de chip lab-on-a e organ-on a-chip, bem como para experimentos realizados estresse de cisalhamento líquido.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter pela ajuda com o culturing celular e a preparação de soluções experimentais. Os autores reconhecem com gratidão o apoio financeiro do Grupo de Treinamento de Pesquisa 1910 Química medicinal de ligas seletivas do GPCR financiadas pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) o número de subvenção 222125149. Jas é particularmente grato por uma bolsa de estudos concedida pelo Programa de Igualdade de Gênero bávaro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | \ | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | |
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | \ | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 - 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 - 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) | \ |
References
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