Summary
Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.
Abstract
Une quantité excessive de tissu adipeux entourant les vaisseaux sanguins (tissu adipeux périvasculaire, également connu sous le nom de PVAT) est associée à un risque élevé de maladie cardio-vasculaire. Les ADSC dérivés de différents tissus adipeux présentent des caractéristiques distinctes, et ceux du PVAT n’ont pas été bien caractérisés. Dans une étude récente, nous avons rapporté que quelques ADSCs dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) descendent des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules migratrices provenant de l’ectoderm.
Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler les nCCs étiquetés par protéines fluorescentes rouges (PD) de la PAAT de Wnt-1Cre.-; Rosa26RFP / souris et induire leur différenciation adipogénique in vitro. En bref, la fraction vasculaire stromal (SVF) est enzymatiquement dissociée de l’APA, et la DP- crête neurale dérivée ADSCs (NCADSCs) sont isolés par le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Les NCADSC se différencient en adipocytes bruns et blancs, peuvent être cryoconservés et conservent leur potentiel adipogénique pour des passages de 3 à 5. Notre protocole peut générer des ADSC abondants à partir du PVAT pour la modélisation de l’adipogénèse PVAT ou de la lipogenèse in vitro. Ainsi, ces NCADSCs peuvent fournir un système précieux pour étudier les commutateurs moléculaires impliqués dans la différenciation PVAT.
Introduction
La prévalence de l’obésité augmente dans le monde entier, ce qui augmente le risque de maladies chroniques connexes, y compris les maladies cardiovasculaires et le diabète1. PVAT entoure les vaisseaux sanguins et est une source majeure de facteurs endocriniens et paracrines impliqués dans la fonction de la vascularisation. Les études cliniques montrent que la teneur élevée en PVAT est un facteur de risque indépendant de la maladie cardio-vasculaire2,3, et sa fonction pathologique dépend du phénotype des cellules souches dérivées de l’adipose constituante (ADSCs)4.
Bien que les lignées cellulaires DaDSC comme la murine 3T3-L1, 3T3-F442A, et OP9 soient des modèles cellulaires utiles pour étudier l’adipogenèse ou la lipogenèse5, les mécanismes de régulation de l’adipogenèse diffèrent entre les lignées cellulaires et les cellules primaires. Les ADSC dans la fraction de cellules vasculaires stromal (SVF) isolées directement des tissus adipeux et induites pour se différencier en adipocytes récapitulent probablement l’adipogenèse in vivo et la lipogenèse6. Cependant, la fragilité, la flottabilité et les variations de taille et d’immunophénotypes des ADSC rendent leur isolement direct difficile. En outre, les différentes procédures d’isolement peuvent également affecter de manière significative le phénotype et la capacité potentielle adipogénique de ces cellules7,soulignant ainsi la nécessité d’un protocole qui maintient l’intégrité d’ADSC.
Le tissu adipeux est typiquement classifié comme tissu d’adipeux blanc morphologiquement et fonctionnellement distinct (WAT), ou le tissu adipeux brun (BAT)8, qui abrite des ADSC distincts9. Tandis que les ADSC isolés des WATs sous-cutanés périgonadalets et inguinals ont été caractérisés dans les études précédentes9,10,11,12, moins est connu concernant les ADSC s’agit de PVAT qui est principalement composé de BAT13.
Dans une étude récente, nous avons constaté qu’une partie des ADSC résidents dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) sont dérivés des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules progénitrices migratoires qui proviennent de l’ectoderm14,15. Des souris transgéniques de Wnt1-Cre ont été employées pour tracer le développement neural de cellules de crête16,17. Nous avons traversé wnt1-Cre- souris avec Rosa26RFP / souris pour générer Wnt-1 Cre- ; Rosa26RFP / Souris, dans lequel les CNC et leurs descendants sont étiquetés avec des protéines fluorescentes rouges (DP) et sont facilement suivis in vivo et in vitro15. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler la crête neurale dérivée aDSCs (NC-dérivé ADSCs, ou NCADSCs) de la souris PAAT et induire les NCADSCs pour se différencier en adipocytes blancs ou adipocytes bruns.
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Protocol
Le protocole animal a été examiné et approuvé par le Comité des soins aux animaux de l’Université Jiao Tong de Shanghai.
1. Génération de Wnt-1 Cre-; Rosa26RFP / Souris
- Cross Wnt-1 Cre-/- souris16 avec Rosa26RFP/ souris 18 pour générer Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Maison des souris sous un cycle de lumière/obscurité de 12 h dans une installation exempte d’agents pathogènes à 25 oC et 45 % d’humidité jusqu’à l’âge de 4 à 8 semaines.
2. Dissection du PAAT
REMARQUE: Voir Figure 1.
- Stériliser tous les outils chirurgicaux (p. ex. ciseaux chirurgicaux, forceps standard et ciseaux et forceps microchirurgicaux) en autoclantant à 121 oC pendant 30 min.
- Préparer le milieu de digestion (High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium [HDMEM] contenant 2 mg/mL de collagène de type I). Préparer le milieu de culture (HDMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal [FBS] et 1% v/v pénicilline-streptomycine [PS]). Stériliser à l’aide d’un filtre à seringues de 0,22 m avant utilisation.
- Stérilisez les réactifs de culture cellulaire à l’aide d’UV, d’éthanol, de filtration ou de vapeur, le cas échéant.
- Préparer un plat Petri avec Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) et un tube conique de 15 ml avec 10 ml de HBSS complété avec 1% v/v de solution PS. Gardez les deux sur la glace.
- Anesthésier les souris15 avec l’isoflurane et le sacrifice par dislocation cervicale. Immerger les corps dans un bécher rempli de 75% d’alcool (200 ml) pendant 5 min pour stériliser la surface de la peau.
- Couper et séparer la peau sur l’abdomen et couper le long de la ligne médiane ventrale du bassin au cou. Ouvrez l’abdomen et déplacez le foie pour exposer le diaphragme19.
- Couper le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane et exposer le cœur et les poumons en épluchant les côtes.
- Retirer le poumon et le thymus et extraire le PAAT avec l’aorte et le cœur.
- Couper l’aorte à la racine aortique pour enlever le cœur. Faire une coupe entre l’arc aortique et l’aorte descendante et séparer soigneusement le tissu adipeux entourant les deux structures et les artères carotides communes gauches et droites de la paroi thoracique postérieure. Transférer le tissu dans le tampon HBSS glacé dans le plat Petri.
- À l’aide de forceps stériles, retirer autant de la vascularisation (p. ex., aorte, artères carotides courantes et autres petites vascularisations) et le fascia possible, et transférer le tissu adipeux dans les tubes d’Eppendorf de 2 ml contiennent un tampon HBSS de 0,5 ml de glace sur la glace.
3. Isolement de la SVF
Recueillir le PAAT de 5-6 souris dans un tube microcentrifuge de 2 ml contenant 1 ml de milieu de digestion fraîchement préparé et hacher le tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans un tube Eppendorf à température ambiante (RT).
- Transférer le mélange dans des tubes de 50 ml contenant 9 ml du milieu de digestion. Homogénéiser les tissus en faisant monter et descendre avec une pipette 10x de 1 ml.
- Incuber les tubes à 37 oC avec des secousses constantes à 100 tr/min pendant 30 à 45 min et vérifier toutes les 5 à 10 min pour éviter la surdigestion. Ceci est essentiel à l’amélioration de la viabilité et du rendement des cellules.
REMARQUE : Une bonne digestion des tissus se traduira par un tissu adipeux jaune clair homogène qui est visible à l’œil nu en tourbillonnant doucement le tube. - Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de HDMEM contenant 10% FBS et 1% v/v PS à RT et bien mélanger par pipetting.
- Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à RT. Le SVF sera visible sous forme de granule brunâtre. Aspirez soigneusement les adipocytes flottants et décants le reste du supernatant sans déranger le SVF. Dissoudre la pastille SVF dans 10 ml de milieu de culture et filtrer à travers une passoire à cellules de 70 m.
- Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirez le supernatant et suspendez doucement la pastille dans 5 mL de tampon de lyse érythrocyte dans un tube conique de 15 ml pendant 10 min à RT.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de 1x PBS contenant 1% FBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 oC, retirer le supernatant et resuspendre la pastille en 10 ml de 1x PBS contenant 1 % de FBS.
- Centrifuger à nouveau les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de milieu de culture dans un tube conique de 15 ml à 4 oC.
- Après un dernier tour de centrifugation (500 x g pour 5 min à 4 oC), resuspendre les cellules granulées en 5 ml de tampon FACS (PBS contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL d’ADN I et 1 % v/v PS) sur la glace, et compter les cellules avec un hémocytomètre.
4. Isolement des NCADSC par les FACS
- Configurez et optimisez le trieur cellulaire en suivant le manuel d’instructions. Sélectionnez la buse de 100 m, stérilisez les tubes de collecte, installez le dispositif de collecte requis et configurez les flux latéraux20.
- Un laser jaune/vert de 561 nm et un filtre optique 579/16 sont recommandés pour le tri descellules de la DP. Effectuer la compensation en utilisant le contrôle négatif et les contrôles positifs non tachés. Voir Figure 2A pour le schéma de gating.
- Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 m, centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min, et resuspendre les cellules dans 2 ml de tampon FACS à une densité de 0,5 x 1 x 107/mL. Transférer les cellules dans des tubes de polystyrène ronds de 5 ml clairement étiquetés et charger dans le trieur.
- Exécuter le tube d’échantillon expérimental à 4 oC, allumer les plaques de déviation et trier en un tube conique de 15 ml précouché avec RPMI contenant 1 % de FBS et 1 % de v/v PS.
REMARQUE : Protégez les échantillons de la lumière forte pour minimiser l’étanchéité de la DP.
5. Culture des NCADSC
- Plaquer les cellules triées à une densité de 5 000 cellules/cm2 dans une plaque de culture de 12 puits dans un milieu de culture complet et incuber à 37 oC dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pour 20 à 24 h.
- Enlever le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS préchauffé (37 oC) pour enlever les débris cellulaires et ajouter un milieu de culture frais.
- Une fois que les cellules sont confluentes à 80 à 90 %, digérez la monocouche à l’aide d’une solution EDTA de trypsine de 0,25 % à 37 oC dans un incubateur de 3 à 5 min, et neutralisez-la avec 2 ml de milieu de culture.
- Centrifuger les cellules récoltées pendant 15 min à 250 x g à RT, enlever le supernatant, et resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture. Comptez les cellules avec un hémocytomètre.
- Ensemencer les cellules dans une plaque de culture de 12 puits à la densité de 5 000 cellules/cm2.
- Resuspendre les cellules restantes dans le milieu de culture contenant 10% de DMSO, congeler et stocker dans l’azote liquide.
6. Induction adipogénique des NCADSC
- Induire la différenciation adipogénique des NCADSCs à 80-90% de confluence et conditions de culture standard21.
- Pour l’induction adipogénique brune, traitez d’abord les cellules cultivées avec le milieu d’induction adipogénique brun (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1M/L dexamethasone, 1 'M/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec pbS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 m/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline). Changez ce médium tous les 2 jours pour un total de 3 à 5x.
- Pour l’induction adipogénique blanche, traitez d’abord les cellules avec le milieu adipogenic blanc d’induction (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1 M/L dexamethasone, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec du PBS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, et 1'g/mL d’insuline). Changez ce milieu tous les 2 jours pour un total de 3-5x.
- Analyser les cellules adipogéniques le cas échéant.
REMARQUE : Soyez doux lorsque vous lavez les cellules avec du PBS. Les adipocytes différenciés peuvent facilement se laver.
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Representative Results
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons obtenu 0,5 à 1,0 x 106 ADSC de 5 à 6 Wnt-1Cre.-; Rosa26Souris De p. 100 (48 semaines, mâle ou femelle).
Le diagramme d’écoulement de la collection de PAAT des souris est présenté dans la figure 1. La morphologie des NCADSCs était semblable à l’ADSC d’autres tissus adipeux de souris. Les NCADSC cultivés ont atteint 80 à 90 % de confluence après 7 à 8 jours de culture, et les NCADSC ont eu une morphologie étendue de fibroblaste -like(figure 2B,C).
Pour confirmer davantage que les NCADSC s’étaient fait un potentiel adipogénique, la différenciation des NCADSC en adipocytes blancs ou bruns a été induite. La coloration rouge à l’huile a été utilisée pour détecter les adipocytes matures (figure 2). Les NCADSC ont montré le potentiel adipogenic fort pour les adipocytes blancs et bruns après induction. Des adipocytes mûrs ont été observés après 8 jours d’induction adipogénique blanche ou brune, avec plus de 60% des NCADSCs montrant la différenciation adipogénique (Figure 2D,F,H). Le prolongement du temps d’induction adipogénique a amélioré le taux de récolte des adipocytes matures (données non montrées). Les NCADSC avaient considérablement réduit le potentiel adipogénique après le passage(figure 2E,G,H).
Immunoblotting et PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) (voir Fichier supplémentaire 1 pour les amorces utilisés) ont prouvé que les niveaux d’expression des protéines et gènes relatifs spécifiques aux adipocytes (Perilipin, PPAR, Cebp/MD) dans les NCADSC différenciés adipogéniques ont considérablement augmenté après 8 jours d’induction adipogénique blanche(Figure 3A,B). Les résultats qRT-PCR ont montré que l’induction de gènes spécifiques à l’adipocyte (Perilipin, PPAR, Cebp/MD) et de gènes spécifiques à l’adipocyte brun (Pgc1MD, UCP-1, PPARMD, PRDM16) a augmenté de manière significative en 8 jours d’induction adipogénique brune des NCADSCs(figure 3B,C,D).
Figure 1 : Diagramme de flux de la collection de PAAT des souris. (A) Anesthésier et sacrifier le Wnt-1 Cre./ ; Rosa26RFP / souris et effectuer une dissection longitudinale de la souris pour exposer le cœur et les poumons; (B) Enlever les poumons et le thymus; (C) Exposer PAAT, arc d’aorte, et le coeur ; (D) Enlevez PVAT, aorte, et le coeur dans le tampon prérefroidi de HBSS ; (E) Récolte PAAT et transfert dans un tampon HBSS prérefroidi. H et coeur; Arc AA et Aorta; T et Thymus; L et poumon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Différenciation adipogénique des NCADSCs isolés du PAAT. (A) Régime général de gating pour caractériser et trier les populations de NCADSCs (DP). (B) Les images du microscope à fluorescence montrent que les NCADSC ont adhéré et se sont étendus après 96 h d’ensemencement sur une plaque de culture de 12 puits. (C-G) Images représentatives montrant que l’huile rouge O taché NCADSCs de PAAT après induction adipogénique. (C) Contrôle (pas d’induction). (D) NCADSCs primaires et (E) NCADSCs 3x-passaged après 10 jours d’induction adipogenic blanche. (F) NCADSCs primaires et (G) NCADSCs 3x-passaged après 10 jours d’induction adipogenic brune. (H) Résultats statistiques de la zone de coloration rouge d’huile des NCADSCs primaires et 3x passages de PAAT après 8 jours d’induction adipogenic. n 6. Les valeurs sont exprimées comme moyen d’écart type (SD). Barre d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Caractérisation de l’induction adipogénique blanche et brune des NCADSC. (A) Immunoblot montrant des niveaux d’expression des protéines spécifiques à l’adipocyte (Perilipin, PPARMD, Cebp/MD) dans les NCADSC séparois adipogéniquement différenciés blancs. (B) qRT-PCR résultats montrant l’induction de gènes spécifiques à l’adipocyte, Cebp / ', PPAR, Perilipin, Fabp4 dans le blanc et brun adipogéniquement différencié NCADSCs. (C) qRT-PCR résultats montrant l’induction de gènes bruns spécifiques à l’adipocyte, Pgc1, UCP-1, PPAR, PRDM16 dans les NCADSC santidations adipogéniques blanches et brunes. Les niveaux d’expression ont été normalisés par rapport à HPRT et mesurés par la méthode Ct ( Ct). Résultat représentatif de n '3 expériences indépendantes. Les valeurs sont exprimées comme étant moyennes : le test T-test étudiant à deux queues non apparié a été utilisé pour des comparaisons entre les deux groupes. P et lt; 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique des NCADSC extraits du PVAT de Wnt-1Cre. Rosa26RFP / souris transgéniques conçues pour produire des PDSA. Les rapports précédents montrent qu’il n’y a pas de différence significative dans l’expression des marqueurs mésenchymal sénogènes (MSC) généraux dans les NCADSCets et non NCADSCs22, et que les NCADSCont ont un fort potentiel de se différencier en adipocytes in vitro15,22,23. Ainsi, les NCADSC isolés avec ce protocole devraient convenir à la plupart des études d’ADSC.
L’avantage de la méthode actuelle est que le journaliste fluorescent inhérent dans les NCADSC transgéniques rend le processus d’isolement simple et économique sans avoir besoin d’anticorps ou de SONde à base de FACS, ou de tri des cellules activées magnétiques24. De plus, l’intensité de fluorescence de la DP est plus forte que celle du FITC, ce qui améliore encore l’efficacité du FACS.
La clé de ce protocole est l’utilisation de jeunes souris. Bien que les souris plus âgées et plus grandes puissent produire une plus grande quantité de tissu adipeux, la proportion d’adipocytes NC-dérivés dans le PAAT diminue avec l’âge parce que les CNT contribuent principalement au développement tôt de PAAT15. Ainsi, le potentiel adipogénique de ces cellules diminue avec l’âge. D’après nos expériences, la fenêtre de temps optimale pour l’isolement de NCADSC chez les souris est de 4 à 8 semaines.
Notre méthode est simple, pratique, et peut générer des ADSC abondantes pour l’étude de l’adipogénèse PVAT ou la lipogenèse in vitro, et pour tester de nouveaux médicaments contre l’obésité et les maladies cardiovasculaires. En outre, les NCADSC de Wnt-1 Cre. Les souris Rosa26RFP/MD peuvent également être un système in vitro efficace pour d’autres domaines de recherche. Cependant, plusieurs mises en garde demeurent : premièrement, ces cellules sont plus sensibles et plus fragiles que les lignées d’adipocytes immortalisées. Deuxièmement, leur taux élevé de prolifération et de différenciation adipogénique est contrecarré par le fait qu’ils ont tendance à perdre leur potentiel adipogénique après un maximum de cinq passages.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
National Key R-D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), et Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17411971000, 17140902402) ont fourni les fonds pour cette étude .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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