Summary
Live imaging av lysosomal exocytosis på micropatterned celler tillåter en rumslig kvantifiering av denna process. Morfologi normalisering med hjälp av mikromönster är ett enastående verktyg för att avslöja allmänna regler om den rumsliga fördelningen av cellulära processer.
Abstract
Live imaging av pHluorin taggade Löslig N-etylmaleimid-känslig-faktor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associerade membran protein 7 (VAMP7) av total inre reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM) är ett enkelt sätt att utforska utsöndring från lysosomalt fack. Dra nytta av cellodling på micropatterned ytor att normalisera cellform, en mängd statistiska verktyg var anställd för att utföra en rumslig analys av sekretoriska mönster. Använda Ripleys K-funktion och ett statistiskt test baserat på närmaste granne avstånd (NND), bekräftade vi att sekretion från lysosomes är inte en slumpmässig process men visar betydande klustring. Att notera, vår analys visade att exocytosis händelser är också klustrade i nonadhesion områden, vilket tyder på att vidhäftning molekyler är inte de enda strukturer som kan inducera sekretoriska hotspots vid plasmamembranet. Ändå fann vi att celladhesion förbättrar klustring. Förutom exakt definierade självhäftande och nonadhesiva områden, tillåter den cirkulära geometrin hos dessa mikromönster användningen av polära koordinater, vilket förenklar analyser. Vi använde KDE (Kernel Density Estimation) och den kumulativa fördelningsfunktionen på polära koordinater för exocytoshändelser för att identifiera berikade områden av exocytos. I ringformade mikromönsterceller inträffade klustring vid gränsen mellan de självhäftande och icke-vidhäftande områdena. Vår analys illustrerar hur statistiska verktyg kan användas för att undersöka rumsliga fördelningar av olika biologiska processer.
Introduction
Exocytos är en universell cellulär process där en vesikel säkringar med plasmamembranet och släpper dess innehåll. Vesikel kan antingen smälta samman helt med plasmamembranet (full fusion) eller skapa en fusion por som håller öppet under en begränsad tid (kiss-and-run)1. Till exempel frigörs nyligen syntetiserade proteiner i det extracellulära mediet från vesiklar som kommer från Golgi-komplexet. Denna biosyntetiska, anterograde väg är primordial, särskilt i flercelliga organismer, att utsöndra signalering peptider (t.ex., hormoner, signalsubstanser) och extracellulära matriskomponenter (t.ex., kollagen), samt att trafficmembrane proteiner till plasmamembranet. Dessutom kan sekret uppstå från olika endosomes: 1) återvinning endosomes för att återanvända transmembrane proteiner; 2) multivesikulära kroppar (MVBs) att släppa exosomer; och 3) lysosomer för frisättning av proteolytiska enzymer. Endosomal sekretion har visat sig vara viktigt för neurit utväxt, pseudopodia bildning, plasma membran reparation, och ATP-beroende signalering2.
För att studera exocytos på singelcellsnivå har flera tekniker använts. Patch-clamp möjliggör detektering av enstaka exocytos händelser med en hög tidsmässig upplösning i en mängd olika levande celler3. Denna metod ger dock inte information om lokalisering av exocytos händelser, inte heller från vilket fack det sker. Elektronmikroskopi tillåter direkt visualisering av exocytic händelser med hög rumslig upplösning, och i kombination med immunolabeling ger information om specificiteten i de inblandade avdelningar och molekyler. En nackdel med detta tillvägagångssätt är bristen på information om dynamiken i processen, liksom dess oförmåga att utföra studier med hög genomströmning. Lätta mikroskopi metoder såsom total inre reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM), som utnyttjar evanescent fältet för att belysa fluoroforer i närheten av täcken (100 nm), ger god tidsmässiga och rumsliga upplösning för att studera exocytosis händelser. Denna metod är dock endast kompatibel med anhängare celler och kan endast appliceras på den ventrala / sämre delen av celler.
Notera, plasmamembranet avslöjar betydande heterogenitet baserat på självhäftande komplex som endast finns i begränsade områden. Denna heterogenitet begränsar till exempel utnyttjandet av olika ligander4. På samma sätt har det nyligen rapporterats att utsöndring från Golgi-komplexet koncentreras till "hot spots" i plasmamembranet5. Dessutom är det känt att vissa laster utsöndras genom fokal-vidhäftning-associerade exocytos6. Således bör särskild uppmärksamhet ägnas åt frågan om exocytos händelser är slumpmässigt fördelade i rymden, eller om de är koncentrerade till specifika områden av plasmamembranet. Flera statistiska verktyg baserade på Ripleys K funktion har föreslagits att utforska dessa frågor7,8,9. Vårt tillvägagångssätt kombinerar dessa verktyg med mikromönster för att styra cellform och plasmamembran heterogenitet. Förutom att ge ett sätt att skilja mellan självhäftande och nonadhesiva områden, möjliggör denna teknik också jämförelse över olika celler och förhållanden och ökar kraften i statistiska analyser.
Här använder vi en mängd statistiska verktyg för att studera den rumsliga fördelningen av exocytos händelser från lysosomalt fack övervakas av TIRFM levande cell imaging av VAMP7-pHluorin i ringformade micropattern-normaliserade hTert-RPE1 celler. Det bekräftades att utsöndring från lysosomes är inte en slumpmässig process8,9 och att exocytosis händelser uppvisar klustring. Att notera fann vi att exocytosis händelser är också klustrade i nonadhesive områden, vilket tyder på att vidhäftning molekyler är inte de enda strukturer som kan framkalla sekretoriska hotspots vid plasmamembranet. Ändå gjorde celladhesion förbättra klustring. Konsekvent, vår analys identifierat berikade områden av exocytosis som var belägna vid gränsen mellan de självhäftande och nonadhesive områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av mikromönsterceller
- Transfektion av celler
- En dag före transfektion, utsäde 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brunn av en 12 brunnsplatta (2 x 2 cm) i 1 mL medium.
- På dagen för transfektion, förbereda transfektionsblandningen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffert, 0,8 μg DNA, 3 μL transfection blandning). Inkubera i 10 min.
OBS: VAMP7 är en lysosomal v-SNARE, smält med en luminal pHluorin tagg. pHluorinsonden släcks av lågt pH, men under exocytos protoner frigörs och pHluorin börjar avge en signal10,11. - Lägg till transfektionsmixen i cellerna i deras medium.
- Ändra medium 4 h efter att ha lagt till transfektionsblandningen på cellerna.
- Använd cellerna för experiment under nästa 24–48 h.
- Mikromönsterberedning (fotolitografimetod)
- Tvätta täcken (25 mm diameter) i etanol och låt dem torka i 5 min.
- Aktivera coverslips genom belysning under djup UV i 5 min.
- Skapa en fuktig kammare genom att grundligt befukta en pappershandduk på vilken en paraffinfilm placeras. Tillsätt droppar (30 μL för 22 mm täckkol) av Poly-L-Lysin-graft-Polyetylenglykol (PLL-g-PEG) lösning (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7,4) och placera täckkol med den aktiverade ytan på dem. Stäng den fuktiga kammaren med en topp och inkubera täckslips i 1 h.
- Tvätta täcken 2x i PBS och 1x i destillerat vatten och låt dem torka.
- Tvätta kvartsfotomasken med destillerat vatten och sedan med etanol eller propanol. Torka fotomasken med filtrerat luftflöde.
OBS: Kvartsfotomasken är belagd på ena sidan med antireflekterande krom som innehåller hål i form av mikromönster. En fotomask innehållande ringformade mikromönster på 37 μm används i detta protokoll. När djup UV är skinen på fotomasken, ljuset kan bara passera genom dessa hål12. - Exponera fotomasken (krombelagd sida) för djup UV i 5 min för att rengöra ytan.
- Tillsätt små vattendroppar (10 μL för en 20 mm täckbild) på fotomaskens krombelagda sida. Placera täckskydd med deras PLL-g-PEG-behandlade sida på droppen och torka det extra vattnet. Se till att inga luftbubblor bildas mellan masken och täcken.
OBS: Vattnets kapillärkraft kommer att immobilisera täcken. - Exponera fotomasken till djup UV i 5 min med den icke-krombelagda sidan uppåt (täcksliparna är fästa på den undre ytan).
OBS: Ljuset kan bara passera genom hålen och modifiera PLL-g-PEG-behandlad yta på coverslips under fotomasken. - Ta bort täcken från fotomasken genom att tillsätta överflödigt vatten.
OBS: Coverslips bör snabbt flyta av. - Inkubera täcksliparna i en lösning av extracellulära matrisproteiner (50 μg/mL fibronectin, 5 μg/mL fluorescent fibrinogen utspädd i vatten) på paraffinfilm i en fuktig kammare (som i steg 1.2.3) i 1 h under en laminär flödeshuva för att undvika förorening.
OBS: Försöket kan pausas på denna punkt genom att förvara täcken i PBS vid 4 °C.
- Cellsådd på mikromönsterytor
- Använd en magnetisk täckpappershållare som passar storleken på de mikromönster som täcks för att montera täcklinerna. På förvärvsdagen värmer du täckskyddshållaren till 37 °C för att undvika termisk chock för cellerna under efterföljande steg.
- Förbered mönstermediet genom att komplettera DMEM/F12-medium med 20 mM HEPES och 2% av penicillin/streptomycin.
- Placera täckskop i hållaren med den mikromönster sidan uppåt och lägg till mönstermedium så snart täckslipen är på hållarbasen. Tillsätt tätningen och immobilisera med den magnetiska enheten. Fyll på täckpappershållaren med mönstermediet och stäng den med glaslocket.
OBS: Var snabb, för att inte låta täckskydd torka. Tvätta inte täckpapper innehavaren med etanol mellan experiment, eftersom tätningen kan behålla en del etanol, som kan reagera med PLL-g-PEG och resultera i cellstress. Tvätta täckskyddshållaren endast med tvålvatten. Fogen kan dessutom inkuberas i mönstermediet vid 37 °C i 1 h för att späda ut restprodukten. - Samla transfected hTERT-RPE1 celler genom trypsinization (0,5 mL för en 12 väl platta) och lägg till 1 mL av 10% FBS DMEM/F12 medium.
- Lägg 0,5 x 106 transfected hTERT-RPE1 celler till coverslip innehavaren och återklossa den. Inkubera i 10 min i inkubatorn.
- Tvätta täckskyddshållaren 5x med mönstermedium för att avlägsna nonattached celler och kvarvarande FBS genom att lägga till mönstermediet med en pipett och aspirera mediet med en annan pipett för att skapa ett tvättflöde. Alltid hålla en liten volym av mönster medium i coverslip innehavaren för att undvika torkning av cellerna på mikromönster täckpapper, vilket kommer att leda till celldöd.
- Inkubera i inkubatorn i 3 h för att tillåta full cellspridning.
2. Förvärv av exocytosdata
- Avbildning av exocytoshändelser
- Placera täckpapper hållare under en TIRM. Signalen måste identifieras av en känslig kamera som inrättats med det bästa avbildningsformatet som finns.
OBS: I detta experiment, en 100x objektiv objektiv och en EMCCD kamera med 512 x 512 pixel upptäckt region användes ger upphov till en pixel storlek 160 nm. - Sök efter en cell som uttrycker VAMP7-pHluorin som är fullt spridd (Bild 1A).
OBS: Celler som uttrycker VAMP7 är tydligt identifierbara, eftersom de uppvisar en grön signal. - Ändra vinkeln på lasern tills en TIRF vinkel som gör att visualiseringen av VAMP7-pHluorin exocytosis händelser nås. Utför en 5 min förvärv med en frekvens som är kompatibel med exocytos hastighet och tidsskalan (typiskt 3 Hz, Figur 1D) med hjälp av mikroskopet programvara.
OBS: hTERT-RPE1 celler har en lysosomal sekretorisk hastighet på runt 0,3 Hz på mikromönster. Lysosomal exocytos har en typisk varaktighet på 1 s. Det kännetecknas av en topp intensitet följt av en exponentiell förfall. Sondens diffusion bör vara tydlig vid denna tidpunkt (Bild 1B, C). - För varje cell, utför också ett förvärv av mikromönster med hjälp av mikroskop mjukvaran (Figur 1A).
- Placera täckpapper hållare under en TIRM. Signalen måste identifieras av en känslig kamera som inrättats med det bästa avbildningsformatet som finns.
- Förvärv av exocytoskoordinater
- Öppna den förvärvade filmen med ImageJ/FIJI. Använd Fil | Importera | Bildsekvens. Hitta exocytos händelser genom ögat. En exocytoshändelse kännetecknas av att en ljus signal som sprids utåt (Figur 1).
- Använd punktverktyget för att markera mitten av den exocytiska händelsen. Använd Analysera | Mät för att mäta X- och Y-koordinater, samt den temporala koordinaten (segmentnummer). Utför dessa mätningar för alla exocytos händelser av filmen.
- Spara resultaten (Resultat | Fil | Spara som). Förbered en textfil för varje analyserad cell med namnet "Resultat(cell_name).txt" som innehåller koordinaterna segment, X-koordinater och Y för alla exocytoshändelser i den ordningen.
Textfilen är tänkt att se ut så här:
ID X Y Ferets diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
OBS: Var noga med att byta ut alla kommatecken med punkter. - Mät mitten och diametern på varje cell med hjälp av "Oval Tool". Montera en perfekt cirkel (använd inte en oval) och använd "Mät" för att erhålla X- och Y-koordinaterna och Ferets diameter. Spara varje cells identitet (ID), X- och Y-koordinater, Ferets diameter och radie (diameter/2) i en textfil med namnet "Sfärisk parameter.txt".
Textfilen är tänkt att se ut så här:
ID X Y Ferets diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
OBS: Var noga med att byta ut alla kommatecken med punkter. - Mät tjockleken på mikromönsterringen (vidhäftningslängd) med det raka verktyget och spara cell-ID, cellradie (från filen: "Sfärisk parameter.txt"), och vidhäftningslängd i en textfil med namnet "Pattern parameter.txt". Beräkna den normaliserade vidhäftningslängden genom att dividera vidhäftningslängden med cellradie.
OBS: Var noga med att byta ut alla kommatecken med punkter.
Filen ska se ut så här:
ID Cellradie vidhäftningslängd Normaliserad vidhäftningslängd
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Encellig rumsanalys
- R-paket och installation
OBS: R-paketet för denna analys drar fördel av Spatstat-paketet13 för att beräkna den tvådimensionella (2D) densiteten och Ripleys K-funktion. Koden är öppen källkod och använder textfiler som tidigare har beskrivits.- Ladda ner och installera R https://www.r-project.org/ (version 3.5.2 användes i den här analysen).
- Ladda ner paketet (och demodatauppsättningen) från: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installera paketet på R Studio med hjälp av "Verktyg" med hjälpav " Installera paket". Välj "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" för kategorin "Installera från:" och välj paketfilen. Tryck på "Installera".
- Ladda paketet med funktionen "bibliotek("ExocytosisSpatialAnalysis")" genom att skriva detta kommando i R studio och trycka på "Enter".
- Kör paketet med funktionen "ESA()" genom att skriva detta kommando i R studio och trycka på "Enter".
OBS: Ett användargränssnitt öppnas. - Välj katalog för datauppsättningen (.txt-filer) och en katalog för utdatayttor.
OBS: Parametrar för analysen (se text nedan) kan ändras genom ett användargränssnitt. - Det här skriptet kommer automatiskt att starta och utföra analysen. Det ger .pdf-filer av motsvarande tomter och .txt-filer som innehåller numeriska resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spatiotemporal egenskaperna hos exocytosis händelser analyserades från lysosomes visualiseras av VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1 celler är icke-transformerade celler som antar väl till micropatterning och har använts i stor utsträckning i tidigare mikromönster-baseradestudier 4,14. VAMP7 är en lysosomal v-SNARE15 som var märkta med super ekliptikan pHluorin vid sin N-ändstation och ligger i lumen av lysosome. Inuti cellen, pHluorin sonden var släckt av den låga pH lysosome, men under exocytosis pHluorin började avge en signal eftersom pH ökade på grund av proton release. VAMP7-pHluorin övervakades av TIRFM levande cell avbildning på ringformade mikromönster (figur 1A–B). pHluorin signalen uppvisade en topp under exocytos som representerade den snabba utgåvan av lysosomala protoner följt av exponentiellt förfall, som representerar 2D-diffusion av sonden vidplasmamembranet ( Figur 1C). hTERT-RPE1 celler presenterade en viktig lysosomal sekretion aktivitet med en genomsnittlig exocytosis hastighet av 0,28 Hz (Figur 1D). Hög heterogenitet observerades dock i exocytos hastighet över celler (standardavvikelse på 0,15 Hz), vilket tyder på att det fanns starka cell-till-cell variabilitet i utsöndring från lysosomerna.
Single cell spatial analys för att undersöka om exocytos av lysosomer är slumpmässigt
Det var möjligt att visualisera 2D-fördelningen av exocytos av KDE, som tidigare utförts för endomembranous fack14, som kunde avslöja skillnader i lokala tätheter (Figur 2B). Detta tillvägagångssätt är relevant för visualisering av den genomsnittliga fördelningen av en population av celler, men mindre informativ i enstaka celler på grund av det begränsade antalet händelser som upptäckts (tiotals jämfört med de flera tusen som erhållits genom populationsbaserad analys) och hög cell-till-cell variabilitet. Till exempel gjorde detta tillvägagångssätt inte tillåter oss att utvärdera om fördelningen av exocytosis händelser följde en komplett spatial slumpmässighet (CSR) beteende (dvs. motsvarade en enhetlig punkt distribution i en observerad region för en enda cell). Ett punkter mönster följer en CSR beteende när de två följande hypoteser är sanna: 1) varje punkt plats är oberoende av den av de andra punkterna; och 2) sannolikheten att hitta en punkt i en underregion är endast beroende av förhållandet mellan denna underregions areal och den totala areaalen. Det finns tre möjliga avvikelser från CSR: 1) klustring (dvs. aggregering); 2) spridning (dvs. beställning med konstant avstånd); eller 3) en blandning av klustring och spridning (figur 2C). Ripleys K-funktion användes för att besvara denna fråga som i tidigare analyser7,8,9 ( Figur2D). Ripleys K-funktion är nära πr² (med d är det normaliserade avståndet från en händelse) när det gäller CSR, men överlägsen (respiratorisk underlägsen) till πr² när det gäller klustring (respiratorisk spridning). Genom att subtrahera πr² från Ripleys K-funktion bör den teoretiska CSR-kurvan vara vid 0. Simuleringar av CSR fall utfördes med samma antal punkter som de observerade exocytosis händelser för att bedöma godhet-of-fit för CSR fallet (grå kuvert runt den teoretiska kurvan). Den transformerade Ripleys K-funktion som tillämpades på försöksdata uppvisade positiva värden utanför kuvertet, vilket indikerarklustring ( Figur 2D).
För att undersöka om klustring av exocytosis händelser berodde på celladhesion som tidigare rapporterats6, vi utfört en liknande analys på data från uteslutande nonadhesive cellområdet i centrum (Figur 2A, självhäftande området i grått, nonadhesive cell centrum område i vitt). Notera fann vi att exocytosis händelser i nonadhesive området var också klustrade (Figur 2E), som anger att vidhäftning molekyler var inte de enda strukturer som inducerade sekretoriska hot spots vid plasma membran.
Eftersom Ripleys K-funktion är en beskrivande statistik som inte ger ett P-värde, sattes ett statistiskt test upp där cellulära exocytoshändelser jämfördes med CSR-simuleringar. Närmaste grannavstånd NND(i) metod användes. NDD definieras som det minimala Euklidesiska avståndet mellan en punkt jag och alla andra punkter. Den genomsnittliga NND(i) från alla exocytic händelser av en cell beräknades och jämfört med CSR erhålls med ett högt antal Monte Carlo simuleringar (Figur 2F). Vi fann att den genomsnittliga NND av den enda cellen analyseras i figur 2F var lägre än genomsnittet av den simulerade fördelningen av CSR-fallet, vilket indikerar närmare grannar i genomsnitt och därmed klustring. Vid spridning förväntades ett högre värde för den genomsnittliga NND : (bild2C). Denna jämförelse möjlig gjorde det möjligt att beräkningen av ett P-värde för varje cell. P-värdet representerar andelen simuleringar som uppvisade en mer extrem NND (på ett dubbelsidigt sätt). För att vara exakt, det opartiska P-värdet beräknades som (k +1)/(N+1) med N är det totala antalet Monte-Carlo simuleringar (10.000), och k antalet dessa simuleringar som var mer extrema än den observerade measurent16. Histogrammet av alla P-värden ritades för den totala cellytan (Bild 2G) och nonadhesivcellområdet (Bild 2I). Om H0: "Exocytosis är en CSR-process" var sant, förväntades en enhetlig fördelning av P-värden. Om H0 var falskt förväntades en topp vid ett lågt P-värde. Utföra en Kolmogorov-Smirnov test på P-värdet histogram, erhölls ett P-värde sämre än 0,001, som visar en betydande avvikelse från CSR i båda fallen (Siffror 2G och 2I). Dessutom indikerade en klustringskoefficient på 0,955 för den totala cellen areaet och 1.000 för nonadhesive cellområdet att lysosomala exocytos var en klustrad process oberoende av celladhesion. Klustringskoefficienten representerar procentandelen celler som var närmare ett klusterbeteende än spridning. Detta resultat var förenligt med Ripleys K-funktion.
För att utvärdera rollen av celladhesion i klustring, jämförde vi den genomsnittliga NND i nonadhesive området med det i det totala området för varje enskild cell (Figur 2H). Eftersom den genomsnittliga NND var omvänt proportionell mot ytan densitet, normaliserade vi den genomsnittliga NND av nonadhesive området med hjälp av homothety. Den betydligt större genomsnittliga NND av exocytosis händelser i nonadhesive området anges mindre klustring (Figur 2H). Således, även om sekretion från lysosomer kluster i nonadhesive områden, verkade cell adhesion att förbättra klustring.
Rumslig analys av exocytoshändelser med hjälp av polära koordinater
Den cirkelformade mikroprets cirkulära geometri möjlig gjorde det möjligt att använda de gemensamma polära koordinaterna, som förenklade analyser, som tidigare hittats17. Varje exocytoshändelse kunde thus beskrivas av en modulus (distansera från beskärningen, här centrera av det lägre planet av cellen) och en meta (enligt en fixerad godtycklig axel). Dessutom kan modulus normaliseras genom att dividera den med cellens radie. Histogrammet av exocytosis händelser ritades enligt modulus för en representativ cell (Figur 3A). Detta visade en topp runt gränsen mellan de självhäftande/nonadhesive områdena. En stor variabilitet mellan celler observerades också. Därför poolade vi n = 22 celler för att få en genomsnittlig fördelning av exocytosis händelser. För att ge samma statistiska vikt till varje cell valdes dock samma antal händelser från varje cell slumpmässigt. Detta slumpmässiga urval ändrade inte de övergripande mönster som setts. För att få en kontinuerlig genomsnittlig fördelning av de enskilda distributionerna av enstaka celler användes en KDE (Figur 3B). Men eftersom den normaliserade modulus är mellan 0 och 1, måste kant villkor beaktas. En betakärna som ändrar form bredvid kanter användes18. Ett felband beräknades med en bootstrap-strategi. Den observerade genomsnittliga fördelningen jämfördes med en hypotetisk CSR-fördelning som visade fler händelser vid en högre modulus, eftersom området ökade med en högre modulus. Därför att integralen av en probabilitytäthet bör vara en, csr-fördelningen var 2r (med är den normaliserade radien, utan enheter). Ett förtroende band beräknades runt den teoretiska kurvan med hjälp av ett stort antal CSR Monte Carlo simuleringar (5.000 vardera). De 1st och 99th percentilerna av modulusfördelningen från dessa simuleringar ritades. Vi fann att den genomsnittliga fördelningen av exocytosis händelser avvikit från den hypotetiska en på 0.7rmax, vilket motsvarar början av limområdet i cellen.
Vi försökte testa om den observerade fördelningen av modulus var annorlunda än den teoretiska. Eftersom genomsnittliga fördelningar, som i detta fall, inte kan testas noggrant genom en godhet-of-fit test (t.ex. Kolmogorov-Smirnov) en alternativ metod som föreslagits av Pecot et al. var anställd. Denna metod mäter skillnaden mellan variationen över en population och variationen inuti en population, och möjliggör därmed oberoende testning för varje koordinat (dvs. modulus och vinkel)17. Detta test användes för att jämföra våra data med simulerade data som representerar CSR-exocytoshändelser (samma antal celler och exocytoshändelser som de observerade uppgifterna), och fann en statistiskt signifikant skillnad i variationerna (p < 0.001 med Wilcoxon-Mann-Whitney-testet, n = 22 celler), vilket indikerar att den observerade genomsnittliga exocytosfördelningen inte var CSR. Men när två CSR simuleringar (med 5.000 simuleringar vardera) jämfördes, fann vi att P-värdet histogram inte visade en enhetlig fördelning, men uppvisade en topp nära 1, vilket tyder på att detta test förmodligen saknade känslighet.
Eftersom KDE-skattningen bygger på ett icke-trivialt val av kärnans bandbredd och är känslig för kanteffekter, beräknades även den kumulativa distributionsfunktionen, vilket övervinner de problem som är inneboende i KDE-uppskattning (Figur 3D). Denna funktion definieras mellan 0 och 1 och innehåller inte några godtyckliga parametrar eller biaser (t.ex. kantbiskningar). Fel- och förtroendemusikband beräknades i samma långt som för modulusfördelningen. Den kumulativa fördelningsfunktionen bekräftade att exocytoshändelser inte följde en CSR-fördelning utan överkoncentreras vid moduli runt 0,7rmax. Denna analys tillät oss därmed att identifiera cellulära områden där klustring inträffade. En intressant fråga som detta resultat väcker är om överkoncentrationen vid 0.7rmax var på grund av närvaron av självhäftande/nonadhesiva områden i den ringformade mikromönster eller en effekt av perifera/centrala sekretionsområden av celler.
Som den genomsnittliga fördelningen av exocytosis händelser avvikit från CSR fallet i nonadhesive samt självhäftande områden, undrade vi också var den exocytosis densiteten var högst. Ytan tätheter av exocytosis i adhesion och nonadhesion områden var beräknas och jämfört. Vi fann att ytdensiteten var lägre i vidhäftningsområdet än i nonadhesion området genom en parad analys (Figur 3C). Detta skulle kunna förklaras av den kraftiga minskningen av exocytos i cellens periferi (0,85 – 1rmax, Bild 3B).
Bild 1. Exocytos från lysosomer i hTert-RPE1-celler: (A) Ringformat mikromönster (rött) och självhäftande hTert-RPE1-cell transfected med VAMP7-pHluorin (grön) avbildas av TIRFM. Pilen visar en exocytosishändelse. Skala barer = 10 μm. (B) Kymograph av exocytosis händelser. Pilar visar exocytos händelser. Skala bar = 2 μm, skala bar i tid = 5 s. (C) Normaliserade intensitet profil lysosomal exocytosis från 22 celler. Varje punkt är ett genomsnitt på minst 1.530 exocytosis händelser. Data presenteras ± SEM. (D) Exocytoshastighet av de 22 cellerna. Den genomsnittliga +/- standardavvikelsen ritas upp i rött. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2. Spatial analys av lysosomal exocytosis händelser. (A) Scatter plot av exocytosis händelser under 5 min förvärv. Varje punkt representerar en exocytos händelse. Självhäftande området visas i grått. (B) 2D-uppskattning av kärndensitet (KDE) av spridningsyttning av A. Färgen representerar den lokala tätheten av exocytos händelser. (C) Schematisk representation av möjliga punktmönster. De fyra fallen, Total spatial slumpmässighet (CSR), Klustring, Spridning och Blandat visas och flera närmaste granne avstånd (NND) ritas (streckade linjer) för att visa hur den genomsnittliga NND minskade i klustring och ökade med spridning. (D) Analys av en representativ cell med ripleys K-funktion. Den röda streckade linjen är lika med "Ripleys K-funktion - πr²" för CSR-händelser, det gråa kuvertet representerar det uppskattade godheten-of-fit från Monte Carlo-simuleringar med samma antal punkter som exocytosis-händelser(N-händelse = 81). Den svarta heldragna linjen är lika med "Ripleys K-funktion – πr²" för observerade exocytoshändelser(N-händelse = 81). Dess positiva avvikelse från den röda kurvan ut från den grå kuvertet indikerar klustring av exocytosis händelser. Ripleys K-funktion normaliserades för att ha ett maximalt värde på 1. (E) Analys av det nonadhesiva området i samma cell med hjälp av Ripleys K-funktion som i D. Den positiva avvikelsen från den röda kurvan utanför det gråa kuvertet indikerar en klustring av exocytoshändelser i det icke-vidhäftande området. (F) Jämförelse av den genomsnittliga NND-fördelningen från en representativ cell (röd linje) med KDE för den CSR som erhålls från Monte Carlo-simuleringar (blå kurva). P-värdet beräknades som den procentandel av simulerade värden som var mer extrema än det värde som observerades. (G) P värde histogram som erhållits från NND-testet som i F för n = 26 celler. Topp vid låga P-värden innebär att nollhypotesen "exocytosis följer CSR" avvisades med ett Kolmogorov-Smirnov-test, vilket indikerar att lysosomal exocytosis inte var CSR. (H) Box-plot av genomsnittliga NND från exocytosis händelser i nonadhesive områden (vit) och totala cellområden (grå). De två datapunkterna från samma cell förenas av en rad. Den genomsnittliga NND var större i nonadhesive området, p < 0,001 med ett parkopplat Wilcoxon test (n = 25 celler), vilket indikerar betydligt mindre klustring i nonadhesive området. (I) Samma som G för det nonadhesiva området för n = 26 celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3. Rumslig analys av poolade lysomosala exocytos händelser: (A) Histogram av de exocytosis händelserna i en representativ cell under en 5 min förvärv med n = 161 exocytosis händelser som en funktion av den normaliserade modulus; 0 representerar cellen centrum och 1 cellen periferi. Cellens självhäftande område visas i grått och motsvarar moduli från 0,65–1 för de celler som visas. Det finns en topp i början av limområdet runt moduli mellan 0,6 och 0,7. (B) KDE av händelserna exocyto som en funktion av den normaliserade modulus för n = 22 celler med 56 händelser i varje cell; 0 representerar cellen centrum och 1 cellen periferi. Det genomsnittliga självhäftande området visas i grått och motsvarar i genomsnitt moduli från 0,61–1. Den streckade blå kurvan är den teoretiska kurva som förväntas när det gäller CSR. Denna teoretiska kurva åtföljs av ett kuvert som representerar 1:a–99:e percentilerna av CSR som erhållits med hjälp av Monte Carlo-simuleringen. KDE-kurvan från de observerade uppgifterna är i rött och åtföljs av ett felband som genereras av bootstrapping. Självhäftande området är i grå +/- SEM. (C) Parat analys av yttätheterna i vidhäftning och nonadhesion områden. Den exocytosis ytan densitet beräknades som antalet händelser per normaliserade området och per sekund. Här, *p < 0,05 från ett parkopplat student t-test (n = 22 celler). Normalitet har tidigare testats av en Shapiro-Wilk test. (D) Kumulativ fördelningsfunktion av uppgifterna i B (röd linje) och från Monte Carlo CSR-simuleringar (prickad blå linje). Kuvert genererades som i B. Observera att den röda linjen avviker från den teoretiska CSR på runt 0.7rmax. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi övervakade exocytosis händelser från lysosomalt fack genom TIRFM levande cell imaging av VAMP7-pHluorin i ring-formad micropattern-normaliserade celler och utfört en rigorös statistisk analys av de rumsliga parametrarna för exocytosis händelser. Anställa den omvandlade Ripley's K funktion och ett statistiskt test baserat på närmaste granne avstånd, bekräftade vi att utsöndring från lysosomes är inte en slumpmässig process8,9. Båda statistiska analyser visade övertygande att exocytos händelser uppvisar klustring (Figurerna 2D och 2G). Tillämpa liknande verktyg till nonadhesive cellområdet, fann vi att exocytosis händelser är också klustrade i nonadhesive områden (Figurerna 2E och 2I). Således är vidhäftning molekyler som tidigare rapporterats för att tillåta klustring6 inte de enda strukturer som kan framkalla sekretoriska hot spots vid plasmamembranet. Emellertid, celladhesion förbättrad klustring: den genomsnittliga närmaste granne avstånd mellan exocytosis händelser var betydligt större i nonadhesive områden (Figur 2H). Konsekvent, vår analys baserad på kernel densitet uppskattning och kumulativa fördelning funktion identifierat berikade områden av exocytosis som var belägna vid gränsen mellan de självhäftande och nonadhesive områden i ring-formade micromönster celler. Mer arbete är nödvändigt för att fastställa de molekylära mekanismer som ligger bakom klustring, såsom vidhäftning eller en specifik inriktning av lysosome till denna region. Intressant nog observerade vi hög heterogenitet i exocytos hastighet över hTERT-RPE1 celler (standardavvikelse på 0,15 Hz för genomsnittlig exocytos hastighet av 0,28 Hz, figur 1D), vilket indikerar att utsöndring från lysosomer har hög intercellulär variation. Därför bör subpopulationsanalyser övervägas i det framtida arbetet. Det skulle vara särskilt intressant att undersöka om denna variation återspeglar mångfalden av lysosomala fack, skillnader i laster, eller beroende av exocytosis maskiner.
Dessa resultat illustrerar hur statistiska verktyg kan användas för att undersöka rumsliga parametrar för olika biologiska processer. Mikromönster underlättar dessutom studiet av effekten av celladhesion på ett förutsättningsbeskat sätt med hjälp av olika mikromönstergeometrier (t.ex. ringformade kontra diskshaped). Användningen av runda former underlättar särskilt analyser eftersom polära koordinater kan användas. Eftersom statistiska verktyg kräver en viss mängd data för att vara meningsfulla, användes celler med mer än 30 händelser för vår analys. Det finns dock en möjlighet att celler med 30 eller färre händelser är meningsfulla. Således kunde provtagningsceller med 30 eller färre händelser utföras för att få tillräckliga händelser för analys för att avgöra om så är fallet. På samma sätt är det svårt att uppskatta hur många celler som ska analyseras, särskilt om det finns stark intercellulär variation. Ett sätt att kringgå detta är att slumpmässigt välja samma antal händelser från varje cell för att ge samma statistiska vikt till varje cell när de sammanförs. Vi rekommenderar dock att analyser på färre än 15 celler görs med försiktighetsåtgärd. Som genomsnittliga fördelningar av poolade celler inte kan noggrant testas genom godhet-of-fit tester (t.ex. Kolmogorov-Smirnov) vi använde en teststatistik som föreslagits av Pecot et al. som mäter skillnaden i variationer avpopulationer 17. Även om detta test tillät oss att hitta en statistiskt signifikant skillnad i variationerna i de genomsnittliga fördelningarna, misstänker vi att detta test har låg känslighet eftersom P-värdet histogram inte var platt (dvs visade enhetlig fördelning) när man jämför olika CSR simuleringar för p värden nära 1. Därför kan detta statistiska förfarande behöva förbättras.
En nackdel med våra analyser är den manuella detekteringen av exocytoshändelser, vilket drastiskt minskar analysens hastighet. Begränsningar i automatisk detektering beror ofta på stark heterogenitet i den unika och enkla parameter som analyseras (t.ex. intensitet av exocytosis händelser). Neurala nätverk kan vara potentiellt kraftfull för automatisk upptäckt, eftersom de kan tränas att känna igen många funktioner.
Analysen som presenteras här kan tillämpas på andra dynamiska processer som observerats av TIRFM, såsom utsöndring från andra fack och fördelningen av membranet mikrodomän eller antigen presentation. Liknande analyser kan också tillämpas på fasta celler för att studera proteiners rumsliga fördelning. Vi hoppas att vårt arbete ska öka det ökande intresset för rumslig distributionsanalys inom cellbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner i högkly sätt Thierry Galli (Centrum för psykiatri och neurovetenskap, INSERM) för att tillhandahålla VAMP7-pHluorin plasmid. Vi tackar Tarn Duong för råd om statistisk analys och medlemmar av GOUD-laboratoriet för givande diskussioner. Författarna erkänner i hög utläggning av cell- och vävnadsavbildningsfaciliteten (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg och PICT-IBiSA @Pasteur) och Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem av den franska nationella forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. fick stöd av Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) och P.M. fick finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 666003. Detta arbete stöddes av bidrag från INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) och Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), samt Centre National de la Recherche Scientifique och Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
