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Neuroscience

इंटेरामोरल विषमता, ओंकोस्ट्रीम और आक्रमण के स्थानिक और आणविक लक्षण वर्णन के लिए ग्लियोमा उपक्षेत्रों का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

Published: April 12, 2020 doi: 10.3791/60939
Automatic Translation
1,2,4, 1,2,4, 1,3, 1,2,4, 3, 1,2,4, 1,2,4
1Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 2Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 3Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

Summary

लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य तकनीक है जिसका उपयोग ग्लियोमा विषमता और आक्रमण में मध्यस्थता करने वाले रास्तों को उजागर करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम ट्रांसपोमिक विश्लेषण के बाद लेजर एलएमडी का उपयोग करके ग्लियोमा ऊतक से असतत क्षेत्रों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

ग्लियोमास प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर हैं जो उनकी आक्रामकता और विषमता की विशेषता है। विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल पैटर्न जैसे छद्मपालीसेड्स, माइक्रोवैस्कुलर प्रसार, मेसेंचिमल परिवर्तन और परिगलन उच्च ग्रेड ग्लियोमा की हिस्टोलॉजिकल विषमता की विशेषता है। हमारी प्रयोगशाला ने दिखा दिया है कि ऑनकोस्ट्रीम नाम की मेसेनचिमल कोशिकाओं के उच्च घनत्व की उपस्थिति ट्यूमर द्रोह से सहसंबंधित है। हमने ग्लियोमा के विकास और आक्रमण को रेखांकित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण विकसित किया है । यहां, हम एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) और आरएनए अनुक्रमण का उपयोग अंतर-ट्यूमर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं (यानी, मेसेंचिमल क्षेत्रों या ट्यूमर आक्रमण के क्षेत्रों) की अंतर mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए करता है। यह विधि अच्छे ऊतक हिटोलॉजी और आरएनए अखंडता को बनाए रखता है। परफ्यूजन, ठंड, एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और धुंधला को आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और उच्च गुणवत्ता वाले लेजर माइक्रोडिसेक्शन नमूने प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। परिणामों से संकेत मिलता है कि 30% सुक्रोज का उपयोग करके ग्लियोमा असर चूहों का परफ्यूजन अच्छी आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता प्रदान करता है। इसके अलावा, आरएनए अखंडता को संरक्षित करते समय, 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin के साथ ट्यूमर वर्गों को धुंधला करना अच्छा परमाणु और सेलुलर धुंधला होता है। वर्णित विधि संवेदनशील और अत्यधिक प्रजनन योग्य है और इसका उपयोग विभिन्न ट्यूमर मॉडलों में ट्यूमर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, हम एलएमडी करने के लिए एक पूर्ण विधि का वर्णन करते हैं जो ठोस ट्यूमर के भीतर विषम बहुकोशिकीय संरचनाओं की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अनुक्रमण के लिए आकृति विज्ञान और आरएनए गुणवत्ता को बरकरार रखता है।

Introduction

ग्लियोमास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के सबसे आक्रामक प्राथमिक ट्यूमर हैं। वे अत्यधिक आक्रामक और विषम1हैं । ट्यूमर के सेलुलर और आणविक घटकों का विश्लेषण उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट करेगा।

वर्तमान में उपलब्ध विभिन्न तरीकों में, जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतक के लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय तकनीक है जो ट्यूमर ऊतकों से असतत शारीरिक क्षेत्रों या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव को उनके आणविक प्रोफ़ाइल2,,3का अध्ययन करने की अनुमति देती है। एलएमडी चयनित एकल कोशिकाओं या बहुकोशिकीय संरचनाओं4,5के एमआरएनए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के विश्लेषण की अनुमति देता है । एलएमडी का उपयोग ट्यूमर प्रगति के दौरान होने वाली आणविक घटनाओं के बारे में गहराई से यंत्रवादी ज्ञान प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए-गुणवत्ता6के इष्टतम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए ट्यूमर ऊतकों के प्रसंस्करण में सुधार आवश्यक है। यद्यपि पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण रूपात्मक विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा विकल्प है, इन शर्तों के तहत आरएनए गुणवत्ता प्रभावित और अपमानित होती है, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के लिए खराब आरएनए गुणवत्ता होती है। जमे हुए ऊतक वर्गों का उपयोग बर्फ क्रिस्टल गठन से बचा जाता है, जो कोशिका झिल्ली को तोड़ सकता है और कोशिकाओं के भीतर छेद का उत्पादन कर सकता है, और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण7के लिए सबसे अच्छा विकल्प बना हुआ है।

यहां, हम एलएमडी के लिए जमे हुए माउस ब्रेन ट्यूमर ऊतकों को संसाधित करने के लिए एक अनुकूलित अनुभाग निर्धारण और धुंधला विधि का वर्णन करते हैं। ऊतक में बनाने से बर्फ क्रिस्टल को रोकने के लिए, हम 30% सुक्रोज के समाधान के साथ चूहों को व्याप्त करते हैं। यह समाधान ध्रुवीय पानी के अणुओं के बीच बातचीत को बाधित करता है और ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए बर्फ क्रिस्टल के गठन को रोकता है। ट्यूमर के भीतर कोशिकाओं या शारीरिक रूप से विशिष्ट क्षेत्रों की विशिष्ट आबादी को अलग करने और प्राप्त करने के लिए ऊतक धुंधला करना आवश्यक है। आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए ऊतक को अहानिकर रंगों से ठीक करना और दाग देना आवश्यक है। यह पहले दिखाया गया है कि हेमेटक्सीलिन/eosin (एच & ई) के साथ धुंधला ऊतक आरएनए अखंडता8बिगड़ती है । हमने इथेनॉल, क्रेसिल वायलेट 4% और eosin Y 0.5% समाधानों के साथ ब्याज के ऊतकों को ठीक और दाग दिया। क्रेसिल वायलेट एक एसिडोफिलिक डाई है जो कोशिका नाभिक को गहरे नीले रंग से दाग देता है। Eosin Y एक basophilic रंग है जो कोशिकाओं के बुनियादी घटकों को दाग देता है, जो साइटोप्लाज्म और अन्य सेलुलर संरचनाओं8के बीच अंतर प्रदान करता है। दोनों रंग इथेनॉल में घुलनशील हैं और आरएनए गुणवत्ता को खराब नहीं करते हैं। ऊतक क्षति से बचने और सेलुलर संरचनाओं के उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखने के लिए, हमने एलएमडी9से पहले ऊतक वर्गों पर मुहिम शुरू की।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों कि प्रयोगात्मक जानवरों का उपयोग मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

नोट: जेम या स्थिर लाइनों से उत्पन्न ग्लियोमा न्यूरोस्फीयर का उपयोग चूहों10 में इंट्राक्रैनियल ट्यूमर एनग्राफमेंट के लिए किया जा सकता है और एलएमडी और आरएनए अनुक्रमण के लिए संसाधित किया जा सकता है। ये कोशिकाएं संविलियन रूप से जुगनू लूसिफ़ेरेज़ और जीएफपी प्रोटीन व्यक्त करती हैं, जिसका ट्यूमर विकास विश्लेषण और स्थानीयकरण के लिए आगे उपयोग किया जाएगा।

1. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ग्लियोमा मॉडल से प्राप्त न्यूरोस्फीयर से इंट्राक्रैनियल माउस ग्लियोमा मॉडल की पीढ़ी

  1. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जेईएम) मॉडल से न्यूरोस्फीयर कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति उत्पन्न करने के लिए, पहले10,,11वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
  2. वर्णित न्यूरोस्फीयर कल्चर मीडियम तैयार करें: डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम एफ-12 (डीएमईएम/एफ12) के 500 मिलीएल को 50x बी-27 के 10 मिलील और 100x एन-2 न्यूरोनल कल्चर सप्लीमेंट के 5 मिलील, 100x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक का 5 एमएल और नॉर्मोसिन का 1 एमएल के साथ पूरक किया गया। न्यूरोस्फीयर चढ़ाना से पहले, संस्कृति माध्यम के लिए 20 एनजी/mL मानव recombinant EGF और FGF जोड़ें ।
  3. इंट्राक्रैनियल ट्यूमर एनग्राफमेंट से पहले 2-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृति ग्लियोमा न्यूरोस्फीयर।
  4. सर्जरी के दिन, ग्लियोमा न्यूरोस्फीयर इकट्ठा करें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए उन्हें 550 x ग्राम पर स्पिन करें। सेल पैलेट को परेशान किए बिना अधिनायक को सावधानी से हटा दें।
  5. न्यूरोस्फीयर को अलग करने के लिए, सेल टुकड़ी समाधान के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और 2-4 मिन के लिए 5% सीओ2। ऊष्मायन अवधि के बाद, एक ही सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए 1 एमएल माइक्रोपाइप्ट के साथ न्यूरोस्फीयर को पाइप करें।
  6. संयुक्त राष्ट्र के 10 मिलील के साथ न्यूरोस्फीयर निलंबन को कमजोर करके सेल टुकड़ी समाधान को निष्क्रिय करें-पूरक DMEM/F12 मीडिया । कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 550 x ग्राम पर न्यूरोस्फीयर स्पिन करें। ध्यान से अधिशाद को हटा दें।
  7. कोई पूरक के साथ DMEM/F12 मीडिया के १०० μL में सेल गोली फिर से निलंबित । सेल निलंबन का 1:50 कमजोर पड़ना बनाएं, और फिर व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के 50 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
    कोशिकाएं/mL = [(प्रति वर्ग गिना कोशिकाओं)/# वर्गों की गिनती की) x ५० x १०,००० कोशिकाओं/mL]
  8. सेल गिनती का निर्धारण करने के बाद, १०० μL मात्रा में ३०,००० कोशिकाओं/μL के एक लक्ष्य एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, न्यूरोस्फीयर नीचे स्पिन और उंहें DMEM की उचित मात्रा में फिर से निलंबित/
  9. बर्फ पर प्री-लेबल ०.६ मिलीएल ट्यूब में न्यूरोस्फीयर रखें ।
  10. संज्ञाहरण के काम समाधान तैयार करें, प्रत्यारोपण से पहले एनाल्जेसिक, और एनेस्थीसिया उलट: केटामाइन/डेक्समेडेटोमिडीन एनेस्थीसिया के लिए, 0.6 एमएल 100 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और 0.8 एमएल 0.5 मिलीग्राम/एमएल डेक्समेडेटोमाइड हाइड्रोक्लोराइड के 0.6 एमएल में 0.9% नेक्लेराइड शामिल हैं। बुप्रेनोर्फिन एनाल्जेसिक के लिए, 0.9% नैल युक्त एनसीएल के 9 मिलील में 0.3 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोर्फिन का 1 मिलील जोड़ें। एटिपामेजोल एनेस्थीसिया रिवर्सल के लिए, शीशी युक्त एनसीएल के 9 मिलीग्राम में 5 मिलीग्राम/एमएल एटिपामेजोल का 1 मिलील जोड़ें।
  11. इंट्राक्रैनियल ट्यूमर एनग्राफमेंट के लिए 6-8 सप्ताह पुराने C57BL/6J महिला चूहों का उपयोग करें ।
  12. कृंतक अस्तित्व सर्जरी के लिए अनुमोदित कमरे में, इंट्राक्रैनियल ट्यूमर एनग्राफमेंट के लिए बाँझ आपूर्ति की स्थापना की। एक कृंतक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर सर्जरी करें जो एक निष्फल 10 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज से लैस है। सर्जरी के बीच उपकरणों की नसबंदी करने के लिए एक बीड स्टरलाइजर का उपयोग करें।
  13. चरण 1.11 (केटामाइन: 75.0 मिलीग्राम/किलोग्राम और डेक्समेडेटोमिडीन: 0.5 मिलीग्राम/किलो) में तैयार एनेस्थेटिक समाधान के एक इंट्रापेरिटोनियल (यानी) इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटिज़ करें। लगभग, संवेदनाकार समाधान की 250 माइक्रोन मात्रा 20 ग्राम वजनी माउस को वितरित की जाएगी। यह सुनिश्चित करें कि माउस आगे बढ़ने से पहले पैडल पलटा के लिए अनुत्तरदायी है।
  14. एक बार माउस एक गहरी एनेस्थेटाइज्ड स्थिति में है, सूखने को रोकने के लिए आंखों पर बाँझ पेट्रोलटम नेत्र स्नेहक लुब्रिकेंट लागू करें। माउस कपाल पर फर शेव करें। कीटाणुरहित करने के लिए मुंडा क्षेत्र में 10% पोविडोन-आयोडीन सामयिक समाधान लागू करें।
  15. एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस की खोपड़ी सुरक्षित करें। सबसे पहले, ध्यान से संदंश के साथ मुंह खोलें और धीरे-धीरे जीभ को खींचें और घुट-घुटकर रोकने के लिए इसे मुंह के एक तरफ ले जाएं। मुंह को संदंश के साथ खुला रखें और शीर्ष छेदक को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर टूथ बार के कीहोल में रखें।
  16. कान ों से माउस सिर पकड़े हुए, कान की सलाखों को पोस्टऑर्बिटल हड्डियों के खिलाफ रखें और उन्हें सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि माउस का कपाल सर्जिकल टेबलटॉप के साथ स्तर है। खोपड़ी के खिलाफ दबाव लागू नहीं करने वाले कान की सलाखों को सावधानी से सुरक्षित करें। इसके बाद, नाक बार को ध्यान से सुरक्षित करें।
  17. आकार 15 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, कपाल को उजागर करते हुए माउस सिर के साथ एक चीरा बनाएं। कोलिबरी रिट्रैक्टर का उपयोग करचीर साइट पर त्वचा को वापस लेना। सभी पेरिक्रैनियल ऊतक को हटाने के लिए बाँझ एप्लीकेटर का उपयोग करें।
  18. ब्रेग्मा की पहचान करें और हैमिल्टन सिरिंज की सुई को सीधे उस पर कम करें। फ्रेम का उपयोग करके, ब्रीग्मा के सुई 1 मिमी पूर्वकाल और 1.5 मिमी पार्श्व की स्थिति। एक 26G सुई का उपयोग करना, कपाल स्कोरिंग द्वारा इस जगह को चिह्नित करें ।
  19. लक्ष्य स्थल पर एक burr छेद बनाने के लिए 0.45 मिमी ड्रिल बिट से लैस कॉर्डलेस पावर ड्रिल का उपयोग करें। अंतर्निहित ड्यूरा मेटर तक पहुंचने तक ड्रिल करें। ध्यान से एक 26G सुई के साथ burr छेद में शेष हड्डी निकालें ।
  20. एक पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को अच्छी तरह से समरूप करें और सिरिंज में न्यूरोस्फीयर निलंबन के 7 माइक्रोन को आकर्षित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिरिंज ठीक से काम कर रहा है, 70% अल्कोहल से लथपथ पैड पर निलंबन के 1 μL को वितरित करें।
  21. सुई को ड्यूरा मेटर की सतह पर कम करें। सिरिंज 3.5 मिमी वेंट्रल को कम करें और 0.5 मिमी वापस लें। इससे इंजेक्शन लगने पर न्यूरोस्फीयर जमा करने के लिए मस्तिष्क में 0.5 एमएम की जगह बन जाएगी।
  22. दबाव संतुलन के लिए सुई को 2 मिन के लिए जगह में छोड़ दें। धीरे-धीरे और आसानी से 1 मिन के दौरान कोशिकाओं के 1 μL वितरित करें। कोशिकाओं को 6 मिन के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। 2 मिन के दौरान सिरिंज को धीरे-धीरे और आसानी से मस्तिष्क से निकालें।
  23. बाँझ खारा समाधान का उपयोग करके, कपाल की सतह को तीन बार धोएं। सिरिंज में अतिरिक्त कोशिकाओं को 70% अल्कोहल पैड पर वितरित करें, और सुई को एक और 70% अल्कोहल पैड के साथ साफ करें। सुई के क्लोजिंग से बचने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ सिरिंज कुल्ला।
  24. रिट्रैक्टर्स को हटा दें और सावधानी से माउस को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से बाहर निकालें। चीरा बंद 3-0 नायलॉन टांके, संदंश, और एक सुई चालक का उपयोग कर।
  25. 20 ग्राम माउस के लिए एटिपामेजोल (1.0 मिलीग्राम/किलो), लगभग 100 माइक्रोन का प्रबंध करें। 20 ग्राम माउस के लिए लगभग 70 माइक्रोनयुक्त, बुप्रेनोरफिन (0.1 मिलीग्राम/किलोग्राम चमड़े के नीचे) को नीचे रखें। सर्जिकल के बाद चूहों को एक साफ वसूली पिंजरे में रखें और सतर्क और सक्रिय होने तक उनकी निगरानी करें।

2. पशु परफ्यूजन और मस्तिष्क संरक्षण

  1. ट्यूमर प्रगति की निगरानी के लिए, वीवो इमेजिंग सिस्टम में एक का उपयोग कर के वीवो बायोल्यूमिनेसेंस में निर्धारित करें जब तक कि जानवर ट्यूमर के बोझ के लक्षण नहीं दिखाते। इच्छामृत्यु चूहों जब वे १०६ से १०७ फोटॉन/एस के बीच एक संकेत तक पहुंचने ।
  2. एनेस्थेटाइज चूहों इंट्रापेरिटोनियल (यानी) केटामाइन (75.0 मिलीग्राम/किलो) और डेक्समेडेटोमिडीन (0.5 मिलीग्राम/किलो) समाधान के इंजेक्शन के साथ ट्यूमर बोझ के लक्षण प्रदर्शित करते हैं। 20 ग्राम वजनी माउस को लगभग 250 माइक्रोन वितरित करें। फिर, सुनिश्चित करें कि पेडल पलटा के लिए अनुत्तरदायी में माउस।
  3. संदंश का उपयोग करके, त्वचा को पेरिटोनियल गुहा के ऊपर पकड़ें, और विच्छेदन कैंची की एक बड़ी जोड़ी का उपयोग करके पेरिटोनियल दीवार को भेदने, डायाफ्राम को पंचर करके "वाई" चीरा बनाते हैं, और फिर रिब पिंजरे को काट देते हैं।
  4. माउस के दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक कुंद 20G कैनुला डालें। फिर पागलपन के लिए अनुमति देने के लिए दिल के सही एट्रियम स्निप।
  5. ऑक्सीजनयुक्त टाइरोड के समाधान (0.8% एनसीएल, 0.0264% सीएसीएल2,0.005% NaH2पीओ4,0.1% ग्लूकोज, 0.1% NaHCO3,0.02% KCl) को माउस परिसंचरण प्रणाली के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति दें जब तक कि जिगर और फेफड़ों को रक्त (~ 5 मिन) को हटाने के कारण पूरी तरह से मंजूरी नहीं दी जाती है।
  6. एक अतिरिक्त 15 मिन के लिए टायरोड के समाधान में भंग 30% सुक्रोज समाधान के साथ जानवर को छिद्रित करना जारी रखें। परफ्यूजन की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए, पुष्टि करें कि गर्दन, पूंछ और पैर 30% सुक्रोज परिसंचरण के बाद कठोर हैं।
  7. विच्छेदन कैंची की एक छोटी जोड़ी का उपयोग करना, मिडलाइन पर खोपड़ी काट। ऑक्सीपिटल हड्डी से शुरू करना और स्नाउट की दिशा में आगे काम करना। इससे कपाल बेनकाब हो जाएगा।
  8. rongeurs की एक जोड़ी का उपयोग करना, ऑक्सीपिटल हड्डी पर शुरू कपाल के माध्यम से तोड़और पूरी तरह से मस्तिष्क की सतहों का पर्दाफाश करने के लिए आगे जारी है । फिर सिर की ओर मुड़ें और मस्तिष्क के आधार पर नसों को कपाल से मुक्त करने के लिए विच्छेदन करें।
  9. RNase मुक्त पानी के साथ 30% सुक्रोज समाधान तैयार करें और आरएनए क्षरण को कम करने के लिए 40 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से इसे फ़िल्टर करें।
  10. सुक्रोज समाधान घुसपैठ को अधिकतम करने के लिए, विच्छेदित दिमाग को 30% सुक्रोज समाधान में रखें और उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आगे की प्रक्रिया से पहले यह सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क सुक्रोज समाधान युक्त ट्यूबों के नीचे तक पहुंचता है।

3. ग्लियोमा ट्यूमर को शरण देने वाले दिमाग का क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. दिमाग को क्रायोसंरक्षित करने से पहले, ठंड े इस्नोपेन/2-मिथाइलब्यूटेन से भरा जार तैयार करें और जार को तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में रखें। सॉल्वेंट को ठंडा होने दें।
  2. मस्तिष्क को 30% सुक्रोज समाधान से निकालें और इसे फिल्टर पेपर पर सूखा दागें।
  3. क्रायोमोल्ड को स्थायी मार्कर के साथ लेबल करते हैं। ध्यान से, हवा के बुलबुले से बचने वाले क्रायोमोल्ड के केंद्र में OCT (इष्टतम काटने वाले तापमान यौगिक) का लगभग 5 मिलील जोड़ें।
  4. मस्तिष्क को वांछित अभिविन्यास में OCT युक्त क्रायोमोल्ड में रखें। मोल्ड को OCT से तब तक भरें जब तक कि दिमाग पूरी तरह से जलमग्न न हो जाए। स्वच्छ संदंश का उपयोग करके, जल्दी से अक्टूबर और मस्तिष्क के साथ क्रायोमोल्ड को ठंडे आइसोपेन/2-मिथाइलब्यूटेन में रखें।
  5. एक बार जब अक्टूबर जम जाता है (~ 30-40 एस), मस्तिष्क के साथ क्रायोमोल्ड को हटा दें और इसे सूखी बर्फ में रखें। 2-मिथाइलब्यूटेन पिछले 2 मिन में मस्तिष्क युक्त मोल्ड न छोड़ें क्योंकि इससे ठोस अक्टूबर में दरारें पड़ सकती हैं। एल्यूमीनियम पन्नी में मस्तिष्क के साथ क्रायोमोल्ड को लपेटें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. जमे हुए ब्रेन ट्यूमर ऊतकों को अनुभागित करना

  1. नमूना जानकारी के साथ लेबल 2 माइक्रोन पॉलीथीन नेफ्थालेट (पेन) स्लाइड। इन स्लाइड्स पर सीधे टिश्यू सेक्शन रखे जाएंगे सेक्शनके बाद।
  2. क्रायोस्टेट चैंबर का तापमान -20 से -24 डिग्री सेल्सियस के बीच सेट करें। सेक्शनिंग से पहले, नमूना ब्लॉक को क्रायोस्टेट कक्ष में रखें और इसे 30-60 न्यूनतम के लिए कक्ष में तापमान तक समान करें।
  3. क्रायोस्टैट चैंबर और चाकू धारक को 100% इथेनॉल के साथ साफ करें और ब्रश को RNase सफाई समाधान के साथ उपयोग करने के लिए स्प्रे करें। क्रायोस्टेट चैंबर के अंदर काम करना, मोल्ड को हटा दें और अक्टूबर के साथ क्रायोस्टेट नमूना डिस्क में मस्तिष्क युक्त OCT ब्लॉक संलग्न करें। डिस्क धारक में ब्लॉक रखें और चाकू ब्लेड के साथ ब्लॉक को संरेखित करें।
  4. सेक्शनिंग धारक में एक डिस्पोजेबल ब्लेड स्थापित करें।
  5. मस्तिष्क को 10 माइक्रोन मोटाई पर अनुभाग करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक में कोई धारियाँ या खरोंच लाइनें नहीं हैं। एक तूलिका का उपयोग करना, सावधानी से समतल और काटने की सतह पर ऊतक को अनकर्ल करें।
  6. ध्यान से RNase मुक्त कलम ग्लास स्लाइड पर मस्तिष्क वर्गों युक्त ऊतक माउंट। ऊतक की दिशा में उंगलियों के साथ सकारात्मक आवेशित ग्लास स्लाइड फ्लिप करें और ग्लास को ऊतक अनुभाग की ओर आसानी से दबाएं।
    नोट: हाथों का तापमान ऊतक को ग्लास से संलग्न करने में मदद करेगा।
  7. स्लाइड्स पर दिमाग के सेक्शन बढ़ने के बाद क्रायोस्टेट चैंबर के अंदर एक बॉक्स में स्लाइड रखें और फिर उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। स्लाइड्स में कभी भी कमरे के तापमान पर न रखें।
    नोट: ऊतक की तह, और फाड़ आम हैं। सटीक पीछे विश्लेषण के लिए, इन कलाकृतियों को कम करना महत्वपूर्ण है।

5. रिओपआरक्षित मस्तिष्क ऊतक वर्गों का निर्धारण और धुंधला होना

  1. आरएनए अखंडता को संरक्षित करने के लिए, आरएनए सफाई समाधान के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को साफ करें। एक धूम हुड के अंदर निर्धारण और धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
  2. स्वच्छ RNase मुक्त 50 मीटर ट्यूबों में वर्णित फिक्सिव समाधान तैयार करें। धुंधला के दिन RNase मुक्त पानी के साथ सभी समाधान करें।
  3. उसी दिन लेजर माइक्रोडिसेक्शन किया जाएगा, 100%, 95%, 70% और 50% इथेनॉल समाधान तैयार करेंगे। कमरे के तापमान पर कसकर बंद ट्यूबों में समाधान रखें।
  4. 75% इथेनॉल समाधान में 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin Y तैयार करें। भंवर 1 मिन के लिए सख्ती से समाधान और उन्हें एक 0.45 μm नायलॉन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करने के लिए अभंग पाउडर के निशान को खत्म करने के लिए।
  5. ऊतक स्लाइड को 30 एस के लिए 95% इथेनॉल के साथ एक कंटेनर में रखें। 75% इथेनॉल वाली ट्यूब पर स्लाइड स्थानांतरित करें; 30 एस के लिए वहां स्लाइड छोड़ दें ।
  6. स्लाइड को 50% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और उन्हें 25 एस के लिए वहां छोड़ दें। इस बिंदु पर, अक्टूबर भंग हो जाएगा । स्लाइड को 20 एस के लिए 4% क्रेसिल वायलेट समाधान में स्थानांतरित करें, और फिर 5 एस के लिए 0.5% eosin Y समाधान पर स्थानांतरित करें।
  7. स्लाइड को साये के घोल से बाहर निकालें और स्लाइड को फिल्टर पेपर से ड्राई दाग दें। फिर, 25 एस के लिए 50% इथेनॉल में स्लाइड ्स रखें 25 एस के लिए 75% इथेनॉल में ट्रांसफर करें स्लाइड्स 30 एस के लिए 95% इथेनॉल में ट्रांसफर करें स्लाइड्स को 60 एस के लिए 100% इथेनॉल में ट्रांसफर करें।
  8. जाइलीन के साथ स्लाइड कुल्ला। उन्हें जाइलीन के साथ एक कंटेनर में स्थानांतरित करें और 3 मिन का इंतजार करें।
  9. RNase मुक्त पानी में बढ़ते माध्यम (जैसे, तुच्छ गम) तैयार करें। माउस मस्तिष्क वर्गों माउंट करने के लिए, 1:10 के अनुपात में RNase मुक्त पानी में बढ़ते माध्यम पतला ।
  10. स्लाइड्स में रखें 10 एस के लिए कमरे के तापमान पर एक RNase मुक्त सतह पर। जाइलीन सूखने से पहले, ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड बढ़ते करने के लिए आगे बढ़ें।
  11. एक बाँझ और RNase मुक्त पतली तूलिका के साथ स्लाइड पर ऊतक के शीर्ष पर बढ़ते समाधान धीरे तितर-बितर । 10-20 एस रुको, और फिर तुरंत ऊतक स्लाइड माइक्रोस्कोप माइक्रोस्कोप मंच पर स्थानांतरित करें।
    नोट: बढ़ते माध्यम से RNase मुक्त पानी के लिए उपयोग किया जाने वाला अनुपात ब्याज के ऊतकों के आधार पर भिन्न होता है। बढ़ते माध्यम/जल अनुपात आरएनए अखंडता को प्रभावित किए बिना लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए ग्लियोमा ऊतक आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है ।

6. लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन

नोट: एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप को ट्यूमर ऊतक के भीतर ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों लेजर माइक्रोडिसेक के लिए उपयोग करने की आवश्यकता है। टिश्यू लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए समय को कम करने के लिए, फिक्सेशन और धुंधला से पहले एलएमडी माइक्रोस्कोप तैयार किया है।

  1. सिस्टम शुरू करने के लिए, पहले पावर स्ट्रिप चालू करें, इसके बाद लेजर चालू करें। इसके बाद माइक्रोस्कोप कंट्रोलर और कंप्यूटर चालू कर दें। एलएमडी सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  2. माइक्रोस्कोप नियंत्रणके तहत, 10x आवर्धन का चयन करें। लेजर नियंत्रणके तहत, ऊतक विच्छेदन के लिए लेजर मापदंडों सेट। सर्वश्रेष्ठ काटने के परिणामों के लिए 120 हर्ट्ज की लेजर फ्रीक्वेंसी सेट करें। हमेशा 100% तक लेजर वर्तमान सेट करें।
  3. सटीक लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए, गति को 10 और एपर्चर सेटिंग 2.0-10.0 माइक्रोन पर सेट करें। 53 तक बिजली सेट करें। एक उच्च सेटिंग में लेजर शक्ति होने ग्लास नक़्क़ाशी का कारण बन सकता है।
  4. ऊतक कलेक्टर लोड करें जो विच्छेदन के बाद ऊतक को कैप्चर करेगा। दूसरा अनलोड बटन पर क्लिक करें। खाली कलेक्टर को हटाएं और डीएसई/आरएनईई फ्री 0.5 मिलीपीसीआर फ्लैट हेड ट्यूब रखें जिसमें लिसिस बफर की 30 माइक्रोन युक्त लाइनें कलेक्टोरेट में रखें। कलेक्टर को वापस मशीन में रखें और आगे बढ़ने के लिए सॉफ्टवेयर पर जारी रखें।
  5. माइक्रोस्कोप पर प्रसंस्कृत (निश्चित और दाग) नमूना लोड करें। सबसे पहले एलएमडी सॉफ्टवेयर पर अनलोड करें। आगे स्लाइड होल्डर पर सैंपल को माउंट करें और स्लाइड होल्डर को स्टेज पर रखें। आगे बढ़ने के लिए सॉफ्टवेयर पर जारी रखें।
  6. कट आकार खिड़कियों के तहत, ड्रा + कटका चयन करें । ब्याज के क्षेत्र को खोजने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण का उपयोग करें। रुचि के क्षेत्र (आरओआई) ड्रा और एक गंतव्य कलेक्टर ट्यूब का चयन करें। एक ही समय में एक स्लाइड से विभिन्न क्षेत्रों को माइक्रो विच्छेदन करने के लिए कई आरओआई आकर्षित करना संभव है।
  7. ऊतक माइक्रो विच्छेदन के लिए आगे बढ़ने के लिए शुरू कट पर क्लिक करें। ब्याज के क्षेत्रों को अनुभागित करने के बाद धारक से कलेक्टर ट्यूब ों को हटा दें और ट्यूबों को सूखी बर्फ पर रखें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस तक एकत्र किए गए आरएनए ऊतक नमूनों को स्थानांतरित करें।

7. माइक्रो-विच्छेदित ग्लियोमा ऊतक का आरएनए अलगाव

  1. एलएमडी से आरएनए निष्कर्षण के लिए छोटे नमूनों और कम आरएनए उपज (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए अनुकूलित आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करें। निर्माण निर्देशों का पालन करें। कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर सभी अलगाव चरणों को पूरा करें। आरएनए गुणवत्ता बनाए रखने के लिए, तेजी से काम करें। निर्माता द्वारा इंगित सभी समाधान तैयार करें।
  2. 1% के साथ लाइसिस बफर के साथ नमूना मात्रा को 350 माइक्रोन में समायोजित करें। नमूना चिपचिपाहट को कम करने और आरएनए एल्यूटियन स्पिन कॉलम दक्षता बढ़ाने के लिए 40 एस के लिए नमूना भंवर।
  3. नमूना की संपूर्णता को 2 एलएल संग्रह ट्यूब में रखे गए जीडीएनए एलिमिनेटर स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें। 8,000 x ग्रामपर 30 एस के लिए ट्यूब अपकेंद्रित। प्रवाह के माध्यम से सहेजें और सुनिश्चित करें कि केंद्रीकरण के बाद कॉलम पर कोई तरल नहीं बचा है।
  4. प्रवाह के माध्यम से 70% इथेनॉल के 350 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण। नमूना, एक आरएनए elution स्पिन कॉलम एक 2 mL संग्रह ट्यूब में रखा करने के लिए स्थानांतरित करें । ढक्कन को धीरे से बंद करें, और 8,000 x ग्रामपर 15 एस के लिए अपकेंद्री। प्रवाह के माध्यम से त्यागें, कॉलम की बचत।
  5. आरएनए एल्यूशन स्पिन कॉलम में आरएनए वाशिंग बफर 1 (20% इथेनॉल, 900 एमएम जीआईटीसी, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5) के 700 माइक्रोन जोड़ें। धीरे से ढक्कन बंद करें, और स्पिन कॉलम झिल्ली को धोने के लिए 8,000 x ग्राम पर 15 एस के लिए अपकेंद्री। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  6. केंद्रीकरण के बाद, संग्रह ट्यूब से आरएनए एल्यूशन स्पिन कॉलम को सावधानीसे हटा दें ताकि कॉलम फ्लो-थ्रू से संपर्क न करे।
  7. स्पिन कॉलम में दूसरे आरएनए वाशिंग बफर (इथेनॉल 80%, नैल 100 एमएम, ट्रिस-एचसीएल 10 एमएम पीएच 7.5) के 500 माइक्रोन जोड़ें। कॉलम के ढक्कन को बंद करें और कॉलम झिल्ली को धोने के लिए 20 एस के लिए 8,000 x ग्राम स्पिन करें। प्रवाह के माध्यम से निपटाएं।
  8. आरएनए एलुशन कॉलम को धोने के लिए, 80% इथेनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें, कॉलम के ढक्कन को बंद करें और 2 मिन के लिए 8000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें। एल्यूशन सॉल्यूशन के साथ ट्यूब ों को फेंक दें।
  9. एक नए संग्रह ट्यूब का उपयोग करें, स्पिन कॉलम के ढक्कन खोलें और कॉलम को सुखाने के लिए 5 मिन के लिए 8000 x ग्राम पर अपकेंद्री। एल्यूटियन ट्यूब को त्यागें।
  10. आरएनए एल्यूशन स्पिन कॉलम को एक नए 1.5 mL संग्रह ट्यूब में रखें। स्पिन कॉलम झिल्ली के केंद्र में सीधे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म होने वाले RNase-मुक्त पानी के 12 माइक्रोन जोड़ें। आरएनए को एलिट करने के लिए पूरी गति से 1 मिन के लिए 4 मिन और अपकेंद्री के लिए प्रतीक्षा करें।

8. आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण, पुस्तकालय तैयार करने और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण

  1. आरएनए निष्कर्षण और शुद्धिकरण के बाद, आरएनए को बढ़ाना और निर्माता निर्देशों के बाद पिको-मोलर सांद्रता में आरएनए अलगाव के लिए उपयुक्त एक विशेष किट का उपयोग करके एक सीडीएनए लाइब्रेरी बनाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। निर्माता के निर्देशों का पालन करें। अन्य पीसीआर उत्पादों के साथ संदूषण से बचने और नमूनों के न्यूकलीज क्षरण से बचने के लिए स्वच्छ वर्कस्टेशन।
  2. यदि आरएनए का 4 से अधिक आरआईआर मूल्य है, जिसका अर्थ है कि आरएनए अच्छी गुणवत्ता का है या केवल आंशिक रूप से अपमानित है, तो विखंडन चरण के साथ आगे बढ़ें। बर्फ पर सभी वस्तुओं को तैयार करें।
  3. संकेत के रूप में एक मास्टर मिश्रण बनाएं(तालिका 1)। एक न्यूलीज-फ्री पतली दीवार 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण बनाएं। ट्यूबों को गर्म ढक्कन वाले थर्मल साइकिलर में 94 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। विखंडन ऊष्मायन समय आरएनए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। रिन ♫ 7: 4 मिन, रिन 5-6: 3 मिन, रिन 4-5: 2 मिन।
  4. ऊष्मायन के बाद, ट्यूबों को पीसीआर चिलर रैक पर रखें जो पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा था और इसे 2 मिन के लिए बैठने दें।
  5. आरएनए नमूने की प्रत्येक ट्यूब के लिए, पहले स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण(तालिका 2)तैयार करें। तालिका 3में वर्णित शर्तों के तहत एक गर्म ढक्कन थर्मल साइकिलर में ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले दो सप्ताह तक सीडीएनए उत्पादों को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है।
  6. टेबल 4में बताए गए पीसीआर मास्टर मिक्स बनाएं . ट्यूबों को गर्म ढक्कन थर्मल साइकिलर में रखें और टेबल 5में इंगित सेटिंग्स के तहत पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।
  7. मोतियों की अनुमति दें, जिसका उपयोग डीएनए को शुद्ध करने के लिए किया जाएगा, कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए। एक बार गर्म होने के बाद, प्रत्येक नमूने में मोतियों के 40 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में मिश्रण और स्पिन करने के लिए ट्यूबों भंवर। ट्यूबों को 8 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने दें ताकि डीएनए को मोतियों से बांधने की अनुमति दी जा सके।
  8. ट्यूबों को चुंबकीय पृथक्करण उपकरण पर रखें और लगभग 5 मिन के लिए बैठने दें, या जब तक समाधान पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए। सेपरेशन डिवाइस पर ट्यूब रखते हुए, मोतियों को परेशान किए बिना सुपरनेट को ध्यान से हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  9. सेपरेशन डिवाइस पर ट्यूबरखते हुए, मोतियों को परेशान किए बिना धोने के लिए ताजा निर्मित 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। 80% इथेनॉल को हटाने से पहले 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें। इस कदम को दोहराएं।
  10. संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और ट्यूबों को वापस जुदाई डिवाइस पर रखें। मोतियों को परेशान किए बिना किसी भी अवशिष्ट 80% इथेनॉल को हटा दें।
  11. 5 मिन के लिए खुली टोपियों के साथ ट्यूबों को हवा सूखने दें। इसे लंबे समय तक न बैठने दें क्योंकि मोती सूखे पर होंगे।
  12. ट्यूबों को सेपरेशन डिवाइस पर रखते हुए, मोतियों को कवर करने के लिए न्यूलीज-फ्री वॉटर के 52 माइक्रोन जोड़ें। सेपरेशन डिवाइस से ट्यूब निकालें और जब तक सभी मोतियों को फिर से निलंबित न कर दिया जाए तब तक ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम पर इनक्यूबेट।
  13. ट्यूबों को वापस जुदाई डिवाइस पर रखें जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है, लगभग 1 मिन। 8-अच्छी पट्टी के कुओं में परिणामी सुपरनेट के 50 माइक्रोन स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने में नए मोतियों के 40 माइक्रोन जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। मोतियों को 8 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करके डीएनए से बांधने की अनुमति दें।
  14. इस ऊष्मायन अवधि के दौरान, नमूनों में मौजूद किसी भी rRNA के लिए उपयोग किए जाने वाले घटकों को विगलन करना शुरू करें। एक बार गल जाने के बाद उन्हें बर्फ पर रखें। इसके अलावा, एक थर्मल साइकिलर को 72 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व गर्मी।
  15. नमूने चुंबकीय पृथक्करण डिवाइस पर तब तक रखें जब तक कि समाधान साफ न हो जाए (लगभग 5 मिन)। अलीकोट प्रति सैंपल जांच के 1.5 माइक्रोन एक ठंडा पीसीआर ट्यूब के लिए। ट्यूब को 2 मिन और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस की सेटिंग के तहत प्रीहीटेड थर्मल साइकिलर में रखें।
  16. चुंबकीय सेपरेशन डिवाइस में नमूना ट्यूब रखते हुए, मोतियों को परेशान किए बिना एक पाइप्ट के साथ सुपरनेटेंट को हटा दें। फिर मोतियों को परेशान किए बिना धोने के लिए ताजा मेड 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। 80% इथेनॉल को हटाने से पहले 30 एस रुको। इस कदम को दोहराएं।
  17. संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और ट्यूबों को वापस जुदाई डिवाइस पर रखें। मोतियों को परेशान किए बिना किसी भी अवशिष्ट 80% इथेनॉल को हटा दें। 2 मिन के लिए खुली टोपियों के साथ ट्यूबों को हवा सूखने दें। ज्यादा देर तक बैठने न दें क्योंकि मोतियों पर सूखी हो जाएगी।
  18. प्रस्तुत क्रम में निम्नलिखित घटकों के संयोजन से सभी नमूनों के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें(तालिका 6)।
  19. भंवर द्वारा मास्टर मिश्रण मिलाएं और प्रत्येक नमूने के सूखे मोतियों में मिश्रण के 22 माइक्रोन जोड़ें और फिर से निलंबित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। इसे 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  20. ट्यूबों को नीचे स्पिन करें और उन्हें चुंबकीय पृथक्करण डिवाइस पर 1 मिनट के लिए या जब तक नमूने स्पष्ट न हो जाएं। नई पीसीआर ट्यूबों के लिए मोतियों को परेशान किए बिना, सुपरनेटेंट के 20 माइक्रोन स्थानांतरित करें। ट्यूबोंको टेबल 7 में सेटिंग्स के तहत एक पूर्व-गर्म थर्मल साइकिलर में रखें।
  21. प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त के लिए एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। संकेत तालिका 8में मास्टर मिश्रण करने के लिए निम्नलिखित घटकजोड़ें। चरण 8.20 से प्रत्येक नमूना ट्यूब में पीसीआर मास्टर मिक्स के 80 माइक्रोन जोड़ें और निम्नलिखित सेटिंग्स(टेबल 9)पर थर्मल साइकल रहो।
  22. मोतियों की अनुमति दें, जिनका उपयोग डीएनए को शुद्ध करने के लिए किया जाएगा, कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए। एक बार गर्म होने के बाद, प्रत्येक नमूने में मोतियों के 100 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूबों को 8 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने दें ताकि डीएनए को मोतियों से बांधने की अनुमति दी जा सके।
  23. ट्यूबों को चुंबकीय पृथक्करण उपकरण पर रखें और लगभग 5 मिन के लिए बैठने दें, या जब तक समाधान पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए।
  24. सेपरेशन डिवाइस पर ट्यूब रखते हुए, मोतियों को परेशान किए बिना सुपरनेट को ध्यान से हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  25. सेपरेशन डिवाइस पर ट्यूबरखते हुए, मोतियों को परेशान किए बिना धोने के लिए ताजा निर्मित 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। 80% इथेनॉल को हटाने से पहले 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें। इस कदम को दोहराएं।
  26. संक्षेप में, ट्यूबों को स्पिन करें और ट्यूबों को जुदाई डिवाइस पर वापस रखें। मोतियों को परेशान किए बिना किसी भी अवशिष्ट 80% इथेनॉल को हटा दें।
  27. 5 मिन के लिए खुली टोपियों के साथ ट्यूबों को हवा सूखने दें। ज्यादा देर तक बैठने न दें क्योंकि मोतियों में ज्यादा सूखी होगी। सूखे गोली के लिए ट्रिस बफर के पिपेट 20 μL। ट्यूब को सेपरेशन डिवाइस से निकालें और मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए एक पाइप के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। इसे 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  28. ट्यूबों को 2 मिन के लिए जुदाई डिवाइस पर रखें, या जब तक समाधान स्पष्ट न हो जाए। अधिनेता प्राप्त करें और इसे नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। इसके बाद एकत्रित समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  29. गुणवत्ता और मात्रा नियंत्रण के लिए अंतिम पुस्तकालयों की आवश्यकता की जांच करें। निर्माता के अनुशंसित प्रोटोकॉल के अनुसार, नमूनों को पूल करें, पर संकुल और अनुक्रम, जैसा कि जोड़ा-अंत 50 एनटी पढ़ता है।

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Representative Results

हमारी प्रयोगशाला ने स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसेज सिस्टम(चित्रा 1ए)का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जेम्स) उत्पन्न किया है। इस प्रणाली नवजात चूहों में तंत्रिका जनक कोशिकाओं के जीनोम में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन शामिल हैं । ये परिवर्तित जनक कोशिकाएं एंडोजेनस ग्लियोमा ट्यूमर बनाती हैं। ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड दृश्य थे: (1) pT2C-LucPGK-SB100X स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन और एम्पोसन के लिए एनआरएएस अभिव्यक्ति के लिए ल्यूसिफ़ेरेज़ अभिव्यक्ति, (2) पीटी2-एनआरएएसवी12, (3) pT2-shp53-GFP4 p53 नॉक-डाउन और GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, और (4) एटीआरएक्स नॉक-डाउन के लिए pT2-shATRx-GFP4। प्लाज्मिड्स को 1 दिन पुराने नवजात पिल्ले के पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया गया था जैसा कि पहले11वर्णित था । प्लाज्मिड तेज और ट्यूमर गठन के माध्यम से वीवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम में निगरानी की गई थी। एक बार ट्यूमर असर चूहों ट्यूमर बोझ के लक्षण प्रदर्शित, वे बलिदान किया गया । ट्यूमर का उपयोग या तो न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता था या एलएमडी प्रसंस्करण(चित्रा 1ए)के लिए सीधे क्रायो-संरक्षित किया जाता था।

जेम से शुरू हुई सेल संस्कृतियों का उपयोग अनुवादित ग्लियोमा मॉडल(चित्रा 1बी)उत्पन्न करने के लिए किया गया था। जेम ट्यूमर से प्राप्त ग्लियोमा न्यूरोस्फीयर को सुसंस्कृत और प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों के स्ट्राटम में इंट्राक्रैनी रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। न्यूरोस्फीयर संस्कृति से प्राप्त एकल कोशिका निलंबन का उपयोग हमारी प्रयोगशाला10,11,12द्वारा वर्णित इंट्राक्रैनियल प्रत्यारोपण द्वारा ग्लियोमा ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए किया जाता था ।12 यह पद्धति कोशिकाओं की संख्या के सावधानीपूर्वक मात्राीकरण को प्रति माउस (30,000 कोशिकाओं/1 μL/माउस) के अनुसार प्रत्यारोपित करने की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण के बीच परिणामों की प्रजनन क्षमता की अनुमति देता है। हालांकि, न्यूरोस्फीयर का प्रत्यारोपण माउस ग्लियोमा ट्यूमर और बाद में एलएमडी और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए एक वैकल्पिक विकल्प हो सकता है। इसके बावजूद इस विधि को अधिक सटीक माना जाता है। ट्यूमर प्रगति वीवो बायोल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रम इमेजिंग सिस्टम में निगरानी की गई थी। ट्यूमर के बोझ के लक्षण प्रदर्शित चूहों ट्रांसकार्डियली बेफिक्र थे और मस्तिष्क को एलएमडी प्रसंस्करण(चित्रा 1सी)के लिए क्रायो-संरक्षित किया गया था।

ग्लिओमा के भीतर बहुकोशिकीय संरचनाओं के ट्रांसक्रिप्शन की विशेषता के लिए ऊतक वर्गों को लेजर माइक्रोडिसेक किया गया था। वर्णित परफ्यूजन, फ्रीजिंग और एम्बेडिंग प्रक्रियाओं को ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और लेजर माइक्रोडिसेक्शन के बाद अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। बेहतर आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता(तालिका 10)के साथ ऊतकों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न परफ्यूजन दृष्टिकोणों का मूल्यांकन किया गया था। ब्याज के क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए, आरएनए(चित्रा 2)के लिए अहानिकर रंगों के साथ ऊतक को दागना आवश्यक था। हमने देखा कि 5 मिन के लिए टाइरोड के समाधान के साथ ट्यूमर असर माउस, और फिर 15 min के लिए 30% सुक्रोज, 30% सुक्रोज में विच्छेदित मस्तिष्क के रातभर भंडारण के बाद ट्यूमर ऊतक की आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता को बरकरार रखता है(चित्रा 3डी)। 30% सुक्रोज समाधान के साथ Perfusion ऊतक के भीतर बर्फ क्रिस्टल गठन रोका । हालांकि, पैराफॉर्मलडिहाइड ऊतक निर्धारण के परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान, आरएनए अखंडता नकारात्मक रूप से प्रभावित हुई(चित्रा 3बी)। 15 मिन के लिए 5 मिन + 30% सुक्रोज समाधान के लिए 5 मिन के लिए टाइरोड का Cसमाधान या टाइरोड के समाधानजैसेA अन्य दृष्टिकोणों ने आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित नहीं किया। इन परिस्थितियों में, दिमाग को रातोंरात 30% सुक्रोज में संरक्षित नहीं किया गया था; हमने ऊतक आकृति विज्ञान में कम संकल्प देखा।

हमने आरएनए अखंडता गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के बाद विभिन्न धुंधला तकनीकों का प्रदर्शन किया। हमने देखा कि ग्लियोमा बहुकोशिकीय संरचनाओं की पहचान करने और आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin Y धुंधला पर्याप्त था। क्रेसिल वायलेट एक एसिडोफिलिक डाई है जो गहरे नीले रंग के साथ कोशिकाओं के नाभिक को दाग देता है। Eosin Y एक basophilic रंग है कि कोशिकाओं के बुनियादी घटकों दाग है ।

हमने देखा कि यदि ऊतक बढ़ते माध्यम के साथ घुड़सवार नहीं था, तो वर्ग निर्जलित हो गए और आकृति विज्ञान खराब हो गया(चित्र 4ए)। उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए, हमने बढ़ते माध्यम के साथ ऊतक पर चढ़कर। हमने देखा कि पानी में घुले 15% बढ़ते मध्यम (पानी के 200 माइक्रोन में 30 माइक्रोन) ने उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान(चित्र4बी)को बनाए रखा।

चित्रा 5एमें ग्लियोमा विषमता के क्षेत्र दिखाए गए हैं। छवियों को विच्छेदन से पहले लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहीत किया गया था। लाल रेखाएं प्रचुर मात्रा में मेसेनचिमल कोशिकाओं (लम्बी कोशिकाओं) वाले क्षेत्रों को दर्शाती हैं। नीली रेखाएं कोई मेसेंचिमल कोशिकाओं (गोल कोशिकाओं)(चित्रा 5ए,मध्य छवि) वाले क्षेत्रों को दर्शाती हैं। चित्रा 5बी लेजर माइक्रो-विच्छेदित ट्यूमर क्षेत्रों (लाल रेखाओं) और सामान्य मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों (नीली रेखाओं) की छवियों को दर्शाता है। आरओआई चयन ब्याज के क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए किया जाता है(चित्र 5ए और बी,कम छवियां)। हम इन छवियों में चयनित क्षेत्रों के विच्छेदन में सफलता का निरीक्षण कर सकते हैं ।

आरएनए निष्कर्षण एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर किया गया था । यह निर्धारित किया गया था कि 2.5 x 106 - 7 x 106 माइक्रोन2 के बीच विच्छेदित ऊतक का कुल क्षेत्रफल बाद में आरएनए अनुक्रमण के लिए एमआरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करने के लिए आवश्यक था। आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण लेजर माइक्रोडिसेक्शन के बाद ग्लियोमा ऊतक में 6 से 7 के बीच एक आरआईनए निर्धारित किया गया। 6 का एक आरआईआर सीडीएनए लाइब्रेरी तैयार करने के लिए उपयुक्त होना तय किया गया था। आरएनए निष्कर्षण के बाद, पिकोमोलर सांद्रता में आरएनए अलगाव के लिए एक किट का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए उपयुक्त सीडीएनए लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए किया गया था।

0.25 एनजी - आरएनए के 10 एनजी (1-8 माइक्रोन)
5x पहले स्ट्रैंड बफर के 4 μL
ओलिगोस मिक्स V2 के 1 μL
13 μL की अंतिम मात्रा के लिए Nuclease मुक्त पानी

तालिका 1: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयारी: चरण 8.3 के लिए मास्टर मिक्स तैयारी।

4.5 माइक्रोन मिक्स V2
0.5 μL RNase अवरोधक
2 μL रिवर्स ट्रांसक्रिप्टाज़
7 μL की अंतिम मात्रा
आरएनए नमूना ट्यूब में 7 माइक्रोन जोड़ें

तालिका 2: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयार ी: चरण 8.5 के लिए मास्टर मिक्स तैयारी।

90 मिन के लिए 42 डिग्री सेल्सियस
10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस
4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो

तालिका 3: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयार करना: चरण 8.5 के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

2 μL nuclease मुक्त पानी
25 माइक्रोन 2x पीसीआर बफर
प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 1 μL डीएनए पॉलीमरेज
धीरे-धीरे मिलाएं और संक्षेप में स्पिन करें
नमूना ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए मास्टर मिश्रण के 28 μL जोड़ें
प्रत्येक ट्यूब में प्रत्येक 5 ' और 3 ' प्राइमर में से 1 माइक्रोन जोड़ें
प्रतिक्रियाओं को धीरे से मिलाएं और संक्षेप में स्पिन करें

तालिका 4: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय की तैयारी: चरण 8.6 के लिए मास्टर मिक्स तैयारी।

1 चक्र
1 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
5 चक्र
15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
15 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
30 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस
1 चक्र
2 मिन के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो

तालिका 5: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयार करना: चरण 8.6 के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

16.8 μL nuclease मुक्त पानी
2.2 μL 10x आर बफर
1.5 μL आर v2
1.5 μL आर-जांच v2

तालिका 6: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय की तैयारी: चरण 8.18 के लिए मास्टर मिक्स तैयारी।

37 डिग्री सेल्सियस 60 मिन
72 डिग्री सेल्सियस 10 00
4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो

तालिका 7: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयार करना: चरण 8.20 के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

26 μL nuclease मुक्त पानी
50 माइक्रोन सीबी पीसीआर बफर
2 μL PCR2 प्राइमर v2
2 μL डीएनए पॉलीमरेज

तालिका 8: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय की तैयारी: चरण 8.21 के लिए मास्टर मिक्स तैयारी।

1 चक्र
1 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस
एक्स चक्र
15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
15 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस
30 एस के लिए 68 डिग्री सेल्सियस
1 चक्र
2 मिन के लिए 68 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो

तालिका 9: आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और पुस्तकालय तैयार करना: चरण 8.21 के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

चरण 1 चरण 2 चरण 3
विधि 1 टाइरोड के 15 ' -- --
विधि 2 टाइरोड 5 ' सुक्रोज 30% 15 ' --
विधि 3 टाइरोड 5 ' 4% पीएफए 10 ' --
विधि 4 टाइरोड 5 ' 30% सुक्रोज 15 ' मस्तिष्क में 30% सुक्रोज रातोंरात

तालिका 10: विभिन्न परफ्यूजन दृष्टिकोण ों के लिए विधियां।

Figure 1
चित्रा 1: माउस ग्लियोमा मॉडल लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है। (A)स्लीपिंग ब्यूटी जेम डी नोवो ग्लियोमा विकसित करने के लिए उपयोग किया जाता है। छवियां ट्यूमर प्रगति प्रदर्शित: (i) नवजात ों के पार्श्व वेंट्रिकल में प्लाज्मिड इंजेक्शन, (ii) ट्यूमर बोझ। (ख)ग्लियोमा सेल संस्कृतियों का उपयोग करके प्रत्यारोपण योग्य ग्लियोमा मॉडल की पीढ़ी। जेम से सुसंस्कृत न्यूरोस्फीयर कोशिकाओं को इंट्रामेटम में इंट्राक्रैनी रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है। (ग)परफ्यूजन के बाद कोरोनल ओरिएंटेशन में एम्बेडेड मस्तिष्क के क्रायो-सेक्शनिंग का चित्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: क्रेसिल वायलेट और इसिन के साथ क्रायो-संरक्षित ऊतक वर्गों को दाग देने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। धुंधला के लिए इस्तेमाल स्लाइड RNase मुक्त पानी के साथ साफ उपकरणों के साथ संभाला गया । धुंधला के दिन RNase/DNase मुक्त पानी के साथ सभी समाधान तैयार किए गए थे । क्रेसिल वायलेट दाग नाभिक वायलेट और eosin वाई दाग साइटोप्लाज्म गुलाबी। 70% इथेनॉल में रंगों को भंग कर दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता को संरक्षित करने के लिए विभिन्न परफ्यूजन दृष्टिकोणकी तुलना। एच एंड ई छवियां मस्तिष्क के ऊतकों की तुलनात्मक आकृति विज्ञान का प्रतिनिधित्व करती हैं जो विभिन्न तरीकों के तहत परफ्यूजन के अधीन थी:(ए)15 मिन के लिए टाइरोड का समाधान,(ख)5 मिन के लिए टाइरोड का समाधान, 10 मिन के लिए 4% पीएफए,(सी)5 मिन के लिए टाइरोड का समाधान, 15 मिन के लिए 30% सुक्रोज, और(डी)टाइरोड का समाधान 5 मिन के लिए, 30% सुक्रोज में रात भर विसर्जन के साथ 15 मिन के लिए 30% सुक्रोज । आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन प्रत्येक परफ्यूजन विधि के लिए प्रदर्शित किया जाता है। भूखंड 18s और 28s rRNA चोटियों और प्रारंभिक मार्कर चोटी को दर्शाती है । 18s और 28s rRNA के अनुपात आरएनए गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । आरएनए टुकड़ों की एक जेल छवि भूखंडों के दाईं ओर प्रदर्शित की जाती है। आरएनए गुणवत्ता का आकलन आरआईनए मानों का उपयोग करके किया गया था। आरएनए गुणवत्ता तरीकों में उच्च था ए, सी, और डी ऊतक आकृति विज्ञान तरीकों सी और डी में बेहतर था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: घुड़सवार और गैर घुड़सवार ग्लियोमा ऊतक की प्रतिनिधि छवियां। (A)एच एंड ई के साथ दाग ऊतक की प्रतिनिधि छवियां। इस ऊतक को अमाउंट छोड़ दिया गया था और ऊतक में ब्रेक के साथ खराब आकृति विज्ञान प्रदर्शित निर्जलित हो गया था। (ख)एच एंड ई के साथ दाग ऊतक की प्रतिनिधि छवियां और बढ़ते माध्यम के साथ घुड़सवार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लियोमा ऊतक की प्रतिनिधि छवियां। (ए-बी) एच एंड ई के साथ दाग ऊतक की प्रतिनिधि छवियां और एलएमडी के लिए चयनित बहुकोशिकीय संरचनाओं के क्षेत्र। (क)बाईं ओर, एलएमडी के लिए लम्बी कोशिकाओं (लाल) और नियंत्रण क्षेत्रों (नीले) के क्षेत्रों का चयन किया गया था। (ख)दाईं ओर, सामूहिक आक्रमण (लाल) और नियंत्रण क्षेत्रों (नीले) के क्षेत्रों को एलएमडी के लिए चुना गया था । (ग)लेजर माइक्रोडिसेकड क्षेत्रों के लिए प्रतिनिधि आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण। 6.5 x 106 माइक्रोन2 का कुल क्षेत्रफल माइक्रोडिसेक किया गया था। विश्लेषण २,३४६ स्नातकोत्तर/μL और आरएनए अखंडता संख्या (RIN): ६.८ की आरएनए एकाग्रता से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ग्लियोमा विषमता और आक्रमण अंतर्निहित आणविक तंत्रों को समझना उपन्यास चिकित्सीयलक्ष्यों कोउजागर करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व पूर्ण है । इस पांडुलिपि में, हम लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) का उपयोग करके ग्लियोमा विषमता और आक्रमण के आणविक परिदृश्य का विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं जिसके बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण किया जाता है।

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) का उपयोग ट्यूमर के भीतर विभिन्न क्षेत्रों या एकल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जो ट्यूमर14के स्थानिक संदर्भ को बनाए रखने वाले आणविक पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक विशिष्ट नमूना प्रदान करता है। यह तकनीक ठोस ट्यूमर15में स्थानिक प्रतिलेखन का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में विश्वसनीय और कम कीमत वाली है। हमने एलएमडी का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस ट्यूमर मॉडल या इंट्राक्रैनियल प्रत्यारोपण मॉडल में ग्लियोमा विषमता और आक्रमण का विश्लेषण किया। ये मॉडल मानव ग्लियोमा की मुख्य विशेषताओं को फिर से दोहराते हैं, जिससे ग्लियोमा विषमता और आक्रमण10,12के अध्ययन की अनुमति होती है।

उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर ऊतक आकृति विज्ञान और आरएनए अखंडता को बनाए रखना एलएमडी के लिए सीमाओं में से एक है। ऊतक आकृति विज्ञान में सुधार करने के लिए, हमने 5 मिनट के लिए टाइरोड के समाधान के साथ चूहों को छिद्रित किया, इसके बाद 30% सुक्रोज एक ही समाधान में भंग हो गए। एक बार मस्तिष्क विच्छेदित किया गया था, हम इसे 30% Sucrose में संरक्षित RNase/DNase मुक्त पानी में रात भर भंग या जब तक मस्तिष्क भंडारण कंटेनर के नीचे तक पहुंच गया । ये कदम ऊतक की आकृति विज्ञान में काफी सुधार करते हैं और क्रायो-संरक्षण के दौरान ऊतक में बर्फ-क्रिस्टल के गठन को कम करते हैं। हालांकि मानव ग्लियोमा ऊतक इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था, 30% सुक्रोज समाधान में मानव नमूनों का ऊष्मायन रातोंरात क्रायोसेक्शन आकृति विज्ञान में सुधार करने के लिए एक व्यवहार्य पद्धति हो सकती है। एलएमडी के लिए एक और संभावित सीमा आरएनए अखंडता के बाद धुंधला8का संरक्षण है । हालांकि अन्य अनुसंधान टीमों ने ग्लियोमा ऊतक पर लेजर माइक्रोडिसेक्शन का प्रदर्शन किया है, इसके बाद आरएनए-सीक्यू विश्लेषण वे किसी भी आरएनए और/या आकृति विज्ञान को स्पष्ट नहीं करते हैं और न ही वे ग्लियोमा जमे हुए वर्गों16के लिए रूपात्मक गुणवत्ता, या विशेष नियंत्रण पर टिप्पणी करते हैं। इस प्रोटोकॉल में ग्लियोमास के भीतर सटीक मैक्रोसेलुलर संरचनाओं को लेजर करने के लिए सटीक रूपात्मक पहचान आवश्यक थी। हमने देखा कि इथेनॉल समाधान के साथ ग्लियोमा ऊतक को ठीक करना और इसे इथेनॉल-बनाए गए आरएनए गुणवत्ता में भंग 4% क्रेसिल वायलेट और 0.5% eosin Y के साथ धुंधला करना और एकल कोशिकाओं और बहुकोशिकीय संरचनाओं की सूक्ष्म पहचान को सक्षम करता है। हमने दिखादिया कि बढ़ते समाधान के साथ बढ़ते ग्लियोमा वर्ग एक महत्वपूर्ण कदम है जो ऊतक में क्रैकिंग और दरार गठन को रोकता है। कृपया ध्यान दें कि बढ़ते माध्यम को पानी में तैयार करने की आवश्यकता है, क्योंकि इथेनॉल में भंग बढ़ते माध्यम का उपयोग करने से खराब ऊतक आकृति विज्ञान होगा। लेजर माइक्रोडिसेक्शन को एक RNase मुक्त वातावरण में जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन किया जाना है। हम आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण दोनों के लिए आरएनए की उचित मात्रा प्राप्त करने के लिए 2.5 x 106 माइक्रोन2 कुल ट्यूमर/ऊतक क्षेत्र तक अनुभाग करने की भी सलाह देते हैं।

एलएमडी आणविक सिग्नलिंग रास्तों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो ग्लियोमा विषमता और आक्रमण को विनियमित करते हैं। यह विश्लेषण प्रीक्लिनिकल ग्लियोमा मॉडल में निदान, पूर्वानुमान और भविष्य के अनुवादविकास के लिए उपन्यास संभावित लक्ष्यों को प्रकट कर सकता है।

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Disclosures

इस पत्र के सभी लेखकों के हितों के कोई संभावित संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों( NIH/NINDS) अनुदान: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 से M.G.C. द्वारा समर्थित किया गया था; (NIH/NINDs) अनुदान R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 को P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (एनआईएच/एनसीआई) U01CA224160; न्यूरोसर्जरी विभाग, मिशिगन विश्वविद्यालय में रोगेल कैंसर केंद्र, चैडकड़ा फाउंडेशन, और लिआ के हैप्पी हार्ट्स फाउंडेशन को एमजीसी और पी.आर.एल. आरएनए बायोमेडिसिन ग्रांट F046166 को एमजीसी नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, UL1 TR002240 मिशिगन इंस्टीट्यूट फॉर क्लीनिकल एंड हेल्थ रिसर्च (MICHR), पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, पोस्टडॉक्टोरल ट्रांसलेशनल स्कॉलर्स प्रोग्राम (पीटीएसपी) अनुदान, परियोजना F049768 मिशिगन फोर्ब्स कैंसर अनुसंधान संस्थान के ईसा पूर्व विश्वविद्यालय के लिए, एक चिकित्सक-अनुसंधान से वैज्ञानिक पुरस्कार अंधापन को रोकने के लिए, इंक (RPB), एनआईएच (एके) के NEI से अनुदान R01 EY022633, और आरपीबी से नेत्र विज्ञान और दृश्य विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान । इस शोध ने विजन रिसर्च कोर (P30 EY007003), और कैंसर सेंटर रिसर्च कोर (P30 CA046592) का उपयोग किया। एके को ए अल्फ्रेड तौबमैन मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट से मिसेज विलियम डेविडसन इमर्जिंग स्कॉलर अवॉर्ड का समर्थन प्राप्त है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Cell Detachment Solution Biolegend 423201
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
Buffer RLT Qiagen 79216
Corning PCR Tubes Sigma Aldrich CLS6530
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Gibco 11330057
Eosin Y Sigma Aldrich E4009
HiSeq 4000 Illumina N/A
Laser Microdissection (LMD) System Leica LMD7000
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent Invivogen ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds Electron Microscopy Sciences 70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm) Lieca 1150518
Pinpoint Solution Zymo Research D3001-1
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B-1MG
Research Cryostat Leica CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution Fisher Scientific AM9780
RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian Takara Bio 634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 158 ग्लियोमा लेजर माइक्रोडिसेक्शन ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण आरएनए अखंडता ट्यूमर विषमता आक्रमण आणविक लक्ष्य
इंटेरामोरल विषमता, ओंकोस्ट्रीम और आक्रमण के स्थानिक और आणविक लक्षण वर्णन के लिए ग्लियोमा उपक्षेत्रों का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन
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Comba, A., Dunn, P. J., Kish, P. E., … More

Comba, A., Dunn, P. J., Kish, P. E., Kadiyala, P., Kahana, A., Castro, M. G., Lowenstein, P. R. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion. J. Vis. Exp. (158), e60939, doi:10.3791/60939 (2020).

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