Laser Capture Microdissection av Glioma Subregions for romlig og molekylær karakterisering av intratumoral heterogenitet, oncostreams, og invasjon

Summary

Lasermikrodisseksjon (LMD) er en følsom og svært reproduserbar teknikk som kan brukes til å avdekke veier som medierer glioma heterogenitet og invasjon. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for å isolere diskrete områder fra gliomavev ved hjelp av laser LMD etterfulgt av transkripsjonsanalyse.

Abstract

Gliomer er primære hjernesvulster preget av deres invasivitet og heterogenitet. Spesifikke histologiske mønstre som pseudopalisader, mikrovaskulær spredning, mesenchymal transformasjon og nekrose karakteriserer histologisk heterogenitet av høyverdige gliomer. Vårt laboratorium har vist at tilstedeværelsen av høye tettheter av mesenchymale celler, kalt oncostreams, korrelerer med tumor malignitet. Vi har utviklet en unik tilnærming for å forstå mekanismene som ligger til grunn for gliomas vekst og invasjon. Her beskriver vi en omfattende protokoll som benytter laserfangstmikrodisseksjon (LMD) og RNA-sekvensering for å analysere differensial mRNA-uttrykk for intra-tumoral heterogene multicellulære multicellulære strukturer (dvs. mesenchymal områder eller områder av tumorinvasjon). Denne metoden opprettholder god vevshistologi og RNA-integritet. Perfusjon, frysing, innebygging, snitting og farging ble optimalisert for å bevare morfologi og få høykvalitets lasermikrodisseksjonsprøver. Resultatene indikerer at perfusjon av gliomabærende mus som bruker 30% sukrose gir god morfologi og RNA-kvalitet. I tillegg resulterer flekker av tumorseksjoner med 4% Cresyl fiolett og 0,5% eosin i god kjernefysisk og cellulær farging, samtidig som RNA-integritet bevares. Metoden som er beskrevet er følsom og svært reproduserbar, og den kan brukes til å studere tumormorfologi i ulike tumormodeller. Oppsummert beskriver vi en komplett metode for å utføre LMD som bevarer morfologi og RNA-kvalitet for sekvensering for å studere de molekylære egenskapene til heterogene flercellede strukturer i faste svulster.

Introduction

Gliomas er de mest aggressive primære svulstene i sentralnervesystemet. De er svært invasive og heterogene¹. Analyse av cellulære og molekylære komponenter i svulsten vil avsløre nye terapeutiske mål.

Blant ulike metoder som er tilgjengelige, laser fangst mikrodisseksjon (LMD) av frosne hjernen tumor vev er en kostnadseffektiv, pålitelig teknikk som gjør det mulig å isolere diskrete anatomiske områder eller spesifikke cellepopulasjoner fra tumorvev for å studere deres molekylære profil^2,3. LMD tillater analyse av mRNA genuttrykkprofiler av utvalgte enkeltceller eller flercellulære strukturer^4,5. LMD kan brukes til å få inngående mekanistisk kunnskap om molekylære hendelser som finner sted under tumorprogresjon. Forbedring i behandling av tumorvev er nødvendig for å oppnå optimal optisk oppløsning av vevmorfologi og RNA-kvalitet⁶. Selv om paraformaldehydfiksering er det beste alternativet for morfologisk analyse, påvirkes RNA-kvaliteten og forringes under disse forholdene, noe som resulterer i dårlig RNA-kvalitet for RNA-seqanalyse. Bruken av frosne vevseksjoner unngår iskrystalldannelse, som kan bryte cellemembraner og produsere hull i celler, og er fortsatt det beste alternativet for RNA-Seq analyse⁷.

Her beskriver vi en optimalisert seksjonsfikserings- og fargingsmetode for å behandle frosne mushjernetumorvev for LMD. For å forhindre at iskrystaller dannes i vevet, gjennomsyret vi mus med en løsning på 30% sukrose. Denne løsningen forstyrrer interaksjoner mellom polare vannmolekyler og forhindrer dannelse av iskrystaller, og bevarer vevmorfologien. Vevfarging er nødvendig for å skille og oppnå spesifikk populasjon av celler eller anatomisk forskjellige områder i svulsten. Det er viktig å fikse og flekke vevet med uskyldige fargestoffer for å opprettholde RNA integritet. Det har tidligere vist seg at farging vev med hematoksylin/eosin (H&E) forverrer RNA integritet⁸. Vi fikset og farget vevet av interesse med etanol, Cresyl fiolett 4% og eosin Y 0,5% løsninger. Cresyl violet er en surfargestoff farge som flekker cellekjernen med en mørk blå farge. Eosin Y er en basofile farge som flekker grunnleggende komponenter i cellene, noe som gir et skille mellom cytoplasma og andre cellulære strukturer⁸. Begge fargestoffer er løselig i etanol og forverres ikke RNA-kvalitet. For å unngå vevsskader og opprettholde høy optisk oppløsning av cellulære strukturer, monterte vi vevsseksjonene før LMD⁹.

Protocol

Alle metoder beskrevet her som bruker eksperimentelle dyr har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Michigan.

MERK: Glioma-nevrosfærer generert fra en GEMM eller stabile linjer kan brukes til intrakraniell tumorengraftment hos mus¹⁰ og behandlet for LMD- og RNA-sekvensering. Disse cellene uttrykker samtidig firefly luciferase og GFP-proteiner, som vil bli ytterligere utnyttet til tumorvekstanalyse og lokalisering.

1. Generasjon av intrakranielle musegliomamodell fra nevrosfærer avledet fra genmodifiserte gliomamodeller

1. For å generere en primær kultur av nevrosfæreceller fra en genmodifisert mus (GEMM) modell, bruk protokollen beskrevet tidligere^10,11.
2. Forbered nevrosfærekulturmedium som beskrevet: 500 ml Dulbeccos Modifisert Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) supplert med 10 ml 50x B-27 og 5 ml 100x N-2 nevronale kulturkosttilskudd, 5 ml 100x antimykotisk og 1 ml Normocin. Før plating nevrosfærene, legge 20 ng / ml human rekombinant EGF og FGF til kulturmediet.
3. Kultur glioma nevrosfærer i en vev kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO₂ for 2-3 dager før intrakraniell tumor engraftment.
4. På operasjonsdagen, samle glioma nevrosfærer og spinne dem på 550 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
5. For å dissosiere nevrosfærene, resuspendercellepelleten i 1 ml celleavløsningsløsning og inkuber ved 37 °C og 5 % CO₂ i 2-4 min. Etter inkubasjonsperioden pipette nevrosfærene opp og ned med en 1 ml mikropipette for å sikre en enkelt celle suspensjon.
6. Inaktiver celleavløsningsløsningen ved å fortynne nevrosfæresuspensjonen med 10 ml usupplert DMEM/F12-medier. Snurr nevrosfærene på 550 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern nøye supernatanten.
7. Resuspender cellepelleten i 100 μL dmem/f12-medier uten tillegg. Lag en 1:50 fortynning av cellesuspensjonen, og tilsett deretter 50 μL Trypan Blue for å telle levedyktige celler. Bruk følgende formel til å bestemme konsentrasjonen av celler:
   celler/ml = [((,celler talt per kvadrat) / # av kvadrater talt) x 50 x 10.000 celler/ml]
8. Etter å ha bestemt celletallet, for å oppnå en målkonsentrasjon på 30 000 celler/μL i 100 μL-volum, snurrer nevrosfærene ned og suspenderer dem på nytt i riktig volum av DMEM/F12 som ikke inneholder kosttilskudd.
9. Plasser nevrosfærer i et forhåndsmerket 0,6 ml rør på is.
10. Forbered arbeidsløsninger av anestesi, analgetika, og anestesireversering før implantasjon: For ketamin/deksmedetomididinanestesi, tilsett 0,6 ml 100 mg/ml ketaminhydroklorid og 0,8 ml av 0,5 mg/ml deksmedetomidinhydroklorid til steril 8,6 ml 0,9 % NaCl som inneholder hetteglass. For buprenorfin smertestillende, tilsett 1 ml 0,3 mg/ml buprenorfin til 9 ml 0,9 % NaCl som inneholder hetteglass. For atipamezole anestesi reversering, tilsett 1 ml 5 mg / ml atipamezole til 9 ml av 0,9% NaCl som inneholder hetteglass.
11. Bruk 6-8 uker gamle C57BL/6J hunnmus til intrakraniell tumorinnpode.
12. I et rom godkjent for gnager overlevelse kirurgi, sette opp sterile forsyninger for intrakraniell tumor engraftment. Utfør operasjoner på en gnager stereotaxik ramme utstyrt med en sterilisert 10 μL Hamilton sprøyte med en avtagbar 33G nål. Bruk en perlesterilisator for å sterilisere verktøy mellom operasjoner.
13. Bedøvelse av mus med en enkelt intraperitoneal (dvs.) injeksjon av bedøvelsesmidlet fremstilles i trinn 1,11 (ketamin:75,0 mg/kg og dexmedetomidin:0,5 mg/kg). Omtrent, en 250 μL volum av bedøvelsesløsningen vil bli levert til en mus som veier 20 g. Sørg for at musen ikke svarer til pedalrefleks før du fortsetter.
14. Når musen er i en dypt bedøvet tilstand, bruk sterilt petrolatum oftalmisk smøremiddel for øynene for å hindre tørking. Barber pelsen på musen kraniet. Påfør 10% povidon-jod aktuell løsning på det barberte området for å desinfisere.
15. Fest musens hodeskalle i en stereotaktisk ramme. Først, åpne munnen forsiktig med tang og trekk forsiktig tungen og flytt den til den ene siden av munnen for å forhindre kvelning. Hold munnen åpen med pinsettog plasser de øverste fortennene i nøkkelhullet på tannstangen på stereotaktisk ramme.
16. Hold musehodet ved ørene, plasser ørestengene mot de postorbitale beinene og fest dem. Sørg for at musens kranie er på nivå med den kirurgiske bordplaten. Fest ørestengene forsiktig ikke påføre trykk mot skallen. Deretter må du forsiktig feste nesestangen.
17. Bruk en størrelse 15 skalpellblad, lag et snitt langs musehodet, og utsetter kraniet. Trekk inn huden på snittstedet ved hjelp av Colibri retractors. Bruk en steril applikator til å fjerne alt perikranielt vev.
18. Identifiser bregmaog senk nålen på Hamilton-sprøyten rett over den. Bruk rammen til å plassere nålen 1 mm fremre av bregmaen og 1,5 mm lateral. Bruk en 26G nål, markere dette stedet ved å score kraniet.
19. Bruk en trådløs strømdrill utstyrt med en borkrone på 0,45 mm for å lage et burrhull på målstedet. Bor til du når den underliggende dura mater. Trekk forsiktig ut det gjenværende benet i burrhullet med en 26G kanyle.
20. Ved hjelp av en pipette, homogenisercellene grundig og trekk opp 7 μL av nevrosfæresuspensjonen i sprøyten. For å sikre at sprøyten fungerer som den skal, dispenser1 μL av suspensjonen på en 70% alkoholgjennomvåt pute.
21. Senk nålen til overflaten av dura mater. Senk sprøyten 3,5 mm luftrør og trekk inn 0,5 mm. Dette vil skape en 0,5 mm plass i hjernen for nevrosfærene å deponere når injisert.
22. La nålen være på plass i 2 min for trykkkalibrering. Sakte og jevnt levere 1 μL av cellene i løpet av 1 min. La cellene bosette seg i 6 min. Fjern sprøyten sakte og jevnt fra hjernen i løpet av 2 min.
23. Bruk steril saltvannsløsning, vask overflaten av kraniet tre ganger. Dispenser overflødige celler i sprøyten på en 70% alkoholpute, og tørk nålen rent med en annen 70% alkoholpute. Skyll sprøyten med steril PBS for å unngå tilstopping av kanylen.
24. Fjern retraktorene og ta musen forsiktig ut av stereotaktisk ramme. Lukk snittet med 3-0 nylonsuturer, tang og en nåldriver.
25. Administrer atipamezole (1,0 mg/kg), ca. 100 μL for en 20 g mus. Administrer buprenorfin (0,1mg/kg subkutan) subkutant, ca. 70 μL for en 20 g mus. Plasser postkirurgiske mus i et rent gjenopprettingsbur og overvåk dem til de er på vakt og aktiv.

2. Dyr perfusjon og hjernebevaring

1. For å overvåke tumorprogresjon, bestem in vivo bioluminescens ved hjelp av et in vivo bildesystem til dyr viser tegn på tumorbyrde. Euthanize mus når de når et signal mellom 10⁶ til 10⁷ foton / s.
2. Bedøve mus som viser tegn på tumorbyrde med intraperitoneal (dvs. injeksjon av ketamin (75,0mg/kg) og oppløsning av dexmedetomidin (0,5 mg/kg). Lever ca. 250 μL til en mus som veier 20 g. Kontroller deretter at musen ikke svarer på pedalrefleks.
3. Ved hjelp av tang, hold huden over bukhulen, og ved hjelp av et stort par disseksjonsaks gjør en "Y" snitt ved å penetrere peritonealveggen, punktere membranen, og deretter kutte ribbeburet.
4. Sett inn en stump 20G kanyle i venstre ventrikkel av musens hjerte. Klipp deretter det rette atriumet i hjertet for å tillate forspenning.
5. Tillat oksygenert Tyrodes løsning (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl_2,0,005% NaH₂PO_4,0,1% glukose, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) for å strømme gjennom musesirkulasjonssystemet til leveren og lungene er helt ryddet på grunn av fjerning av blod (~ 5 min).
6. Fortsett å perfusing dyret med 30% sukrose oppløsning oppløst i Tyrode oppløsning i ytterligere 15 min. For å evaluere suksessen til perfusjonen, må du bekrefte at nakken, halen og bena er stive post 30% sukrosesirkulasjon.
7. Bruk et lite par disseksjonsaks, kutt hodebunnen på midtlinjen. Starter på occipital bein og arbeider fremover mot snuten. Dette vil avsløre kraniet.
8. Ved hjelp av et par rongeurs, bryte gjennom kraniet begynner på occipital bein og fortsette fremover for å helt utsette overflatene av hjernen. Snu deretter hodet opp og dissekere nervene ved foten av hjernen for å frigjøre den fra kraniet.
9. Forbered 30% sukroseløsning med RNase fritt vann og filtrer den gjennom et 40 μm nylonnettfilter for å redusere RNA-nedbrytning.
10. For å maksimere sukroseløsninginfiltrasjon, plasser dissekert hjerner i 30% sukrose løsning og lagre dem ved 4 °C over natten. Før videre behandling sikre at hjernen når bunnen av rørene som inneholder sukrose løsningen.

3. Kryopreservation av hjerner som huser glioma svulster

1. Før gråt av hjernen, forberede en krukke fylt med kald isopentane/2-metylbutan og legg krukken i en beholder fylt med flytende nitrogen. La løsningsmidlet avkjøles.
2. Fjern hjernen fra 30% sukroseoppløsningen og tørk den tørt på et filterpapir.
3. Merk kryomolden med en permanent markør. Legg forsiktig til ca 5 ml OK (optimal skjæretemperaturforbindelse) i midten av kryomolden unngå luftbobler.
4. Plasser hjernen i kryomold som inneholder OCT i ønsket retning. Fyll formen med OCT til hjernen er helt nedsenket. Ved hjelp av rene tang, raskt plassere kryomold med OCT og hjernen i kulde isopentane/2-metylbutan.
5. Når OCT stivner (~ 30-40 s), fjern kryomolden med hjernen og legg den i tørr is. Ikke la formen som inneholder hjernen i 2-metylbutan forbi 2 min, da dette kan føre til sprekker i solid OCT. Pakk kryomolden med hjernen i aluminiumsfolie og lagre den på -80 °C.

4. Snitting av frosne hjernesvulstvev

1. Merk 2 μm polyetylennaftamer (PEN) lysbilder med eksempelinformasjonen. Vevsseksjoner plasseres direkte på disse lysbildene etter snitting.
2. Still inn temperaturen på kryostatkammeret mellom -20 til -24 °C. Før snitting, plasser prøveblokken i kryostatkammeret og la den likevekt til temperaturen i kammeret i 30-60 min.
3. Rengjør kryostatkammeret og knivholderen med 100% etanol og spray børstene som skal brukes med RNase rengjøringsløsning. Arbeide inne i kryostat kammeret, fjerne formen og feste OCT-blokken som inneholder hjernen til kryostat prøvedisken med OCT. Plasser blokken i diskholderen og juster blokken med knivbladet.
4. Monter et engangsblad i snittholderen.
5. Seksjon hjernen på 10 μm tykkelse. Pass på at det ikke er noen striper eller skrapeledninger i vevet. Ved hjelp av en pensel, forsiktig flate og uncurl vevet på skjæreflaten.
6. Monter forsiktig vevet som inneholder hjerneseksjonene på RNase free PEN glasslysbilder. Vend de positive ladet glassskliene med fingrene i retning av vevet og trykk jevnt på glasset skyv ned mot vevsdelen.
   MERK: Temperaturen på hendene vil hjelpe vevet feste til glasset.
7. Etter montering av hjerneseksjonene på lysbildene, hold lysbildene i en boks inne i kryostatkammeret og lagre dem deretter ved -80 °C. Oppbevar aldri lysbildene ved romtemperatur.
   MERK: Folding av vevet, og rive er vanlig. For nøyaktig bakre analyse er det viktig å minimere disse gjenstandene.

5. Fiksering og farging av kryobevarte hjernevevseksjoner

1. For å bevare RNA-integritet, rengjør alle instrumenter som skal brukes med RNase rengjøringsløsning. Fortsett med fikserings- og fargingsprotokollen inne i en røykhette.
2. Forbered de beskrevne fikserende løsningene i rene RNase-frie 50 ml rør. Lag alle løsninger med RNase fritt vann på dagen for farging.
3. Samme dag lasermikrodisseksjon en vil bli utført, forberede 100%, 95%, 70% og 50% etanol løsninger. Oppbevar løsningene i tett lukkede rør ved romtemperatur.
4. Forbered 4% Cresyl fiolett og 0,5% eosin Y i 75% etanolløsning. Vortex oppløsningen kraftig i 1 min og filtrer dem gjennom et 0,45 μm nylonfilter for å eliminere spor av uoppløst pulver.
5. Plasser vevet glir i en beholder med 95% etanol i 30 s. Overfør lysbilder til røret som inneholder 75% etanol; la lysbilder der i 30 s.
6. Overfør lysbilder til 50% etanol og la dem være der i 25 s. På dette punktet vil OCT bli oppløst. Overfør lysbildet til 4% Cresyl fiolett løsning for 20 s, og overfør deretter til 0,5% eosin Y-løsning for 5 s.
7. Ta skytsen ut av dye-oppløsningen og tørk av skysen med et filterpapir. Plasser deretter lysbildene i 50% etanol for 25 s. Overfør lysbildene til 75% etanol for 25 s. Overfør lysbildene til 95% etanol i 30 s. Overfør lysbildene til 100% etanol for 60 s.
8. Skyll lysbildet med xylen. Overfør dem til en beholder med xylen og vent 3 min.
9. Forbered monteringsmediet (f.eks. finn tyggegummi) i RNase-fritt vann. For å montere musehjerneseksjoner fortynner du monteringsmediet i RNase-fritt vann med et forhold på 1:10.
10. Tørk lysbildene på en RNase-fri overflate ved romtemperatur i 10 s. Før xylentørker, fortsett å montere lysbildene med vevsseksjonene.
11. Spre monteringsoppløsningen forsiktig på toppen av vevet på lysbildet med en steril og RNase-fri tynn pensel. Vent 10-20 s, og overfør deretter deretter vevsskliene umiddelbart til mikroskopmikrodisseksjonsplattformen.
    MERK: Forholdet mellom monteringsmiddel og RNase-fritt vann som brukes til montering varierer avhengig av vevet av interesse. Monteringsforholdet mellom middels/vann bevarer gliomavevmorfologi for lasermikrodisseksjon uten å påvirke RNA-integriteten.

6. Mikrodisseksjon for laserfangst

MERK: Et mikroskop for laserfangst mikrodisseksjon må brukes til å lasermikrodissekere bestemte interesseområder i tumorvevet. For å minimere tiden for vev laser mikrodisseksjon, har LMD mikroskop forberedt før fiksering og farging.

1. For å starte systemet, først slå på strømledningen, etterfulgt av å slå på laseren. Slå deretter på mikroskopkontrolleren og datamaskinen. Start LMD-programvaren.
2. Velg 10x forstørrelse under Mikroskopkontroll. Under Laserkontroll, sett laserparametrene for vevdisseksjon. Angi en laserfrekvens på 120 Hz for best å kutte resultater. Sett alltid laserstrømmen til 100 %.
3. For nøyaktig lasermikrodisseksjon, sett hastigheten på 10 og en blenderåpningsinnstilling på 2,0-10,0 μm. Sett strømmen til 53. Å ha laserkraften ved en høyere innstilling kan forårsake glassetsning.
4. Last vevssamleren som vil fange opp vevet etter disseksjon. Klikk på den andre utlastingsknappen. Fjern den tomme samleren og plasser DNase/RNase free 0,5 ml PCR flate hoderør som inneholder 30 μL lysisbuffer i samleren. Plasser samleren tilbake i maskinen og klikk fortsett på programvaren for å fortsette.
5. Legg den behandlede (faste og beisede) prøven på mikroskopet. Først klikker du på utlastning på LMD-programvaren. Deretter monterer du prøven på glideholderen og plasserer glideholderen på scenen. Klikk på Fortsett på programvaren for å fortsette.
6. Velg Tegn + Klipp utunder Klipp ut figurer-vinduer. Bruk mikroskopkontrollene til å finne interesseområdet. Tegn interesseområdet (ROI) og velg et målsamlerrør. Det er mulig å tegne flere ROIer for å mikrodissekere forskjellige områder fra et enkelt lysbilde samtidig.
7. Klikk Start Kutt for å gå videre til vev mikro disseksjon. Etter snitting av interesseområdene fjerner du samlerrørene fra holderen og legger rørene på tørris. Overfør RNA-vevsprøvene som er samlet inn til -80 °C for langtidslagring.

7. RNA-isolering av mikrodissektret gliomvev

1. For RNA-ekstraksjon fra LMD må du bruke et RNA-isolasjonssett som er optimalisert for små prøver og lavt RNA-utbytte (se Materialtabellen). Følg produksjonsinstruksjonene. Utfør alle isolasjonstrinnene ved romtemperatur (25 °C). For å opprettholde RNA-kvalitet, arbeid raskt. Forbered alle løsningene som angitt av produsenten.
2. Juster prøvevolumet til 350 μL med lysisbuffer med 1 % β-merkaptoetanol. Vortex prøven for 40 s for å redusere prøveviskositet og øke RNA elution spin kolonne effektivitet.
3. Overfør hele prøven til en gDNA eliminator spin kolonne plassert i en 2 ml samling tube. Sentrifuge røret for 30 s på 8000 x g. Lagre gjennomstrømningen og sørg for at det ikke er væske igjen i kolonnen etter sentrifugering.
4. Tilsett 350 μL av 70% etanol til gjennomstrømningen og bland godt ved å pipetting opp og ned. Overfør prøven, til en RNA elution spin kolonne plassert i en 2 ml samling tube. Lukk lokket forsiktig, og sentrifuge i 15 s på 8000 x g. Forkast gjennomstrømningen og lagre kolonnen.
5. Tilsett 700 μL RNA vaskebuffer 1 (20% etanol, 900 mGItC, 10 mTris-HCl pH 7.5) til RNA elution spin-kolonnen. Lukk lokket forsiktig, og sentrifuge i 15 s på 8000 x g for å vaske spin kolonnemembranen. Kast gjennomstrømningen.
6. Etter sentrifugering fjerner du forsiktig RNA-elutionspin-kolonnen fra oppsamlingsrøret slik at kolonnen ikke kommer i kontakt med gjennomstrømningen.
7. Tilsett 500 μL av den andre RNA vaskebufferen (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) til spinnkolonnen. Lukk lokket på kolonnen og spinn 8000 x gr i 20 s for å vaske kolonnemembranen. Kast gjennomstrømningen.
8. For å vaske RNA elution kolonnen, tilsett 500 μL av 80% etanol, lukk lokket på kolonnen og sentrifuge på 8000 x g i 2 min. Kast ut rørene med elution løsningen.
9. Bruk et nytt oppsamlingsrør, åpne lokket på spin-kolonnen og sentrifugen på 8000 x g i 5 min for å tørke kolonnen. Kast elutionrøret.
10. Plasser RNA elution spin-kolonnen i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør. Tilsett 12 μL rnasefritt vann varmet ved 37 °C direkte til midten av sentrifugemembranen. Vent i 4 min og sentrifuge i 1 min ved full hastighet til elute RNA.

8. RNA kvalitetskontroll, bibliotekforberedelse og RNA-Seq-analyse

1. Etter RNA-ekstraksjon og rensing forsterker du RNA og oppretter et cDNA-bibliotek ved hjelp av et spesielt sett som er egnet for RNA-isolasjon ved pico-molarkonsentrasjoner etter produsentens instruksjoner (se Materialtabellen). Følg produsentens instruksjoner. Ren arbeidsstasjon for å unngå kontaminering med andre PCR-produkter og nukleoasenedbrytning av prøver.
2. Hvis RNA har en RIN-verdi større enn 4, noe som betyr at RNA er av god kvalitet eller bare delvis degradert, fortsett med fragmenteringstrinnet. Forbered alle gjenstander på is.
3. Opprett en hovedmiks som angitt (tabell 1). Lag reaksjonsblanding i et nukleoskefritt PCR-rør med tynn vegg. Inkuber rørene ved 94 °C i en termisk syklusr med varmt lokk. Fragmenteringsinkubasjonstiden avhenger av kvaliteten på RNA. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Etter inkubasjon, plasser rørene på et PCR-kjølestativ som tidligere var avkjølt ved -20 °C og la det sitte i 2 min.
5. For hvert rør med RNA-prøve, forberede første trådsyntesereaksjonsmalblanding (Tabell 2). Inkuber rørene i en varmelokktermisk cycler under forhold som er beskrevet i tabell 3. cDNA-produkter kan fryses ved -20 °C til i to uker før de går videre til neste trinn.
6. Opprett PCR-hovedblandingen som angitt i tabell 4. Plasser rørene i en varmelokktermisk cycler og kjør PCR-reaksjonen under innstillingene som er angitt i tabell 5.
7. La perlene, som vil bli brukt til å rense DNA, for å varme til romtemperatur. Når de varvarer, tilsett 40 μL av perlene til hver prøve. Vorrørene for å blande og spinne ned kort for å samle væske nederst på røret. La rørene inkubere ved romtemperatur i 8 min for å la DNA å binde seg til perlene.
8. Plasser rørene på en magnetisk separasjonsenhet og la sitte i ca 5 min, eller til løsningen blir helt klar. Hold rørene på separasjonsenheten, bruk en pipette for å fjerne supernatanten nøye uten å forstyrre perlene.
9. Hold rørene på separasjonsenheten, tilsett 200 μL nylaget 80% etanol til perlene for å vaske uten å forstyrre perlene. Vent i 30 s før du fjerner 80% etanol. Gjenta dette trinnet.
10. Spinn kort ned rørene og plasser rørene tilbake på separasjonsenheten. Fjern eventuelle rester 80% etanol uten å forstyrre perlene.
11. La rørene lufttørke med hettene åpne i 5 min. Ikke la det sitte lenger som perlene vil over tørke.
12. Hold rørene på separasjonsenheten, tilsett 52 μL nucleasefritt vann for å dekke perlene. Fjern rørene fra separasjonsenheten og pipetten opp og ned til alle perlene er suspendert på nytt. Inkuber ved 5 min ved romtemperatur.
13. Plasser rørene tilbake på separasjonsenheten til oppløsningen blir klar, ca 1 min. Overfør 50 μL av den resulterende supernatanten til brønnene på en 8-brønnsstripe. Tilsett 40 μL nye perler til hver prøve. Vortex grundig for å blande. La perler binde seg til DNA ved å ruge ved romtemperatur i 8 min.
14. I løpet av denne inkubasjonsperioden begynner du å tine komponentene som skal brukes til enhver rRNA som finnes i prøvene. Når du er tint, legg dem på is. Forvarm også en termisk cycler til 72 °C.
15. Plasser prøvene på den magnetiske separasjonsenheten til oppløsningen tømmes (ca. 5 min). Aliquot 1,5 μL prober per prøve til et kjølt PCR-rør. Plasser røret i den forvarmede termiske cycleren under innstillingene på 72 °C i 2 min og 4 °C.
16. Hold prøverørene i den magnetiske separasjonsenheten, fjern supernatanten med et rør uten å forstyrre perlene. Tilsett deretter 200 μL nylaget 80% etanol til perlene for å vaske uten å forstyrre perlene. Vent 30 s før du fjerner 80% etanol. Gjenta dette trinnet.
17. Spinn kort ned rørene og plasser rørene tilbake på separasjonsenheten. Fjern eventuelle rester 80% etanol uten å forstyrre perlene. La rørene lufttørke med hettene åpne i 2 min. Ikke la sitte lenger som perlene vil over tørke.
18. Forbered hovedblandingen for alle prøver ved å kombinere følgende komponenter i rekkefølgen som presenteres (Tabell 6).
19. Bland masterblandingen ved å virvle og tilsett 22 μL av blandingen til de tørkede perlene til hver prøve og bland godt for å suspendere igjen. La det inkubere ved romtemperatur i 5 min.
20. Snurr rørene og plasser dem på den magnetiske separasjonsenheten i 1 minutt eller til prøvene blir klare. Overfør 20 μL av supernatanten, uten å forstyrre perlene til nye PCR-rør. Plasser rørene i en forvarmet termisk cycler under innstillinger i tabell 7.
21. Klargjør en PCR-hovedmiks for nok for reaksjoner for hver prøve. Legg til følgende komponenter i hovedblandingen i den angitte tabell 8. Tilsett 80 μL av PCR-hovedblandingen i hvert av prøverørene fra trinn 8,20 og plasser i den termiske syklussyklusen ved følgende innstillinger (tabell 9).
22. Tillat perler, som vil bli brukt til å rense DNA, for å varme til romtemperatur. Når de varvarer, tilsett 100 μL av perlene til hver prøve. La rørene inkubere ved romtemperatur i 8 min for å la DNA å binde seg til perlene.
23. Plasser rørene på en magnetisk separasjonsenhet og la sitte i ca 5 min, eller til løsningen blir helt klar.
24. Hold rørene på separasjonsenheten, bruk en pipette for å fjerne supernatanten nøye uten å forstyrre perlene.
25. Hold rørene på separasjonsenheten, tilsett 200 μL nylaget 80% etanol til perlene for å vaske uten å forstyrre perlene. Vent i 30 s før du fjerner 80% etanol. Gjenta dette trinnet.
26. Spinn kort ned rørene og plasser rørene tilbake på separasjonsenheten. Fjern eventuelle rester 80% etanol uten å forstyrre perlene.
27. La rørene lufttørke med hettene åpne i 5 min. Ikke la sitte lenger som perlene vil overdry. Pipette 20 μL trisbuffer til den tørkede pelleten. Fjern røret fra separasjonsenheten og bland godt med et rør for å resuspendere perlene. La det inkubere ved romtemperatur i 5 min.
28. Plasser rørene på separasjonsenheten i 2 min, eller til oppløsningen blir klar. Erverve supernatant og overføre den til nye rør. Oppbevar deretter den innsamlede oppløsningen ved -20 °C.
29. Kontroller de endelige bibliotekenes behov for kvalitets- og kvantitetskontroll. Grupper prøvene, gruppert på og sekvens, som paret-end 50 nt leser, i henhold til produsentens anbefalte protokoller.

Representative Results

Vårt laboratorium har generert en genmodifisert mus modeller (GEMMs) ved hjelp av sove skjønnhet transposase system (Figur 1A). Dette systemet inkorporerer spesifikke genetiske endringer i genomet til nevrale stamceller i nyfødte mus. Disse endrede stamceller danner endogene gliomasvulster. Plasmid sekvenser som brukes til å generere svulster var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X for Sleeping Beauty transposon & luciferase uttrykk, (2) pT2-NRASSV12 for NRAS uttrykk, (3) pT2-shp53-GFP4 for p53 knock-down og GFP protein uttrykk, og (4) pT2-shATRx-GFP4 for ATRX knock-down. Plasmids ble injisert i lateral ventrikkel av 1-dagers gamle neonatal valper som beskrevet tidligere¹¹. Plasmid opptak og tumordannelse ble overvåket via in vivo bioluminescence bildesystem. Når tumorbærende mus viste tegn på tumorbyrde, ble de ofret. Svulster ble enten brukt til å generere nevrosfærekulturer eller direkte kryo-bevart for LMD-behandling (figur 1A).

Cellekulturer startet fra GEMM ble brukt til å generere en forbigående gliomamodell (Figur 1B). Glioma nevrosfærer avledet fra GEMM svulster ble kultivert og implantert intrakranielt inn i striatum av immunkompetente mus. Encellede suspensjoner hentet fra nevrosfærer kultur ble brukt til å generere glioma svulster ved intrakraniell implantasjon som beskrevet før av vårt laboratorium^10,11,12. Denne metoden gjør det mulig å kvantifisere nøye antall celler som skal implanteres per mus (30 000 celler / 1 μL / mus). Denne protokollen tillater reproduserbarhet av resultatene mellom ulike eksperimentelle implantasjoner. Implantasjon av nevrosfærer kan imidlertid være et alternativ for å generere musegliomasvulster og påfølgende LMD- og RNA-Seq-analyse. Likevel anses denne metoden å være mer nøyaktig. Tumorprogresjon ble overvåket av in vivo bioluminescensspektrumbildesystem. Mus som viste tegn på tumorbyrde ble transkaralt perfundert og hjernen ble kryo-bevart for LMD-behandling (figur 1C).

Vevseksjoner ble lasermikrodissekert for å karakterisere transkripsjonen av flercellede strukturer i gliomer. Perfusjons-, fryse- og innebyggingsprosedyrene som ble beskrevet, ble optimalisert for å bevare vevmorfologi og oppnå god kvalitet RNA etter lasermikrodisseksjon. Ulike perfusjonsmetoder ble evaluert for å skaffe vev med overlegen morfologi og RNA-integritet (Tabell 10). For å dissekere interesseområdene var det nødvendig å flekke vevet med uskyldige fargestoffer for RNA (Figur 2). Vi observerte at perfusing tumorbærende mus med Tyrode oppløsning i 5 min, og deretter 30% sukrose i 15 min, etterfulgt av overnatting lagring av dissekert hjernen i 30% sukrose bevarer morfologi og RNA integritet av tumorvev (Figur 3D). Perfusjon med 30% sukroseløsning forhindret iskrystalldannelse i vevet. Selv om paraformaldehydvevfiksering resulterte i vevsfonologi av høy kvalitet, ble RNA-integritet negativt påvirket (figur 3B). Andre tilnærminger som Tyrodes løsning i 5 min eller Tyrodes løsning i 5 min + 30% sukroseløsning i 15 min (Figur 3A og C) påvirket ikke RNA-kvaliteten. Under disse forholdene ble hjernen ikke bevart i 30% sukrose over natten; vi observerte redusert oppløsning i vevmorfologi.

Vi utførte ulike fargeteknikker etterfulgt av RNA integritet kvalitetskontrollanalyse. Vi observerte at 4% Cresyl fiolett og 0,5% eosin Y farging var tilstrekkelig til å identifisere glioma multicellulære strukturer og opprettholde RNA integritet. Cresyl violet er en surofil fargestoff som flekker kjernen av celler med en mørk blå farge. Eosin Y er en basofile farge som flekker grunnleggende komponenter i cellene.

Vi observerte at hvis vevet ikke var montert med monteringsmedium, ble seksjonene dehydrert og morfologien forverret seg (figur 4A). For å opprettholde høy kvalitet vev morfologi, monterte vi vevet med monteringsmedium. Vi observerte at 15 % monteringsmedium oppløst i vann (30 μL i 200 μL vann) opprettholdt vevmorfologi av høy kvalitet (figur 4B).

I figur 5Avises områder med glioma heterogenitet. Bilder ble kjøpt ved hjelp av et laserfangstmikroskop før disseksjon. Røde linjer skildrer områder med rikelig mesenchymale celler (langstrakte celler). Blå linjer skildrer områder uten mesenchymale celler (avrundede celler) (Figur 5A, midtbilde). Figur 5B viser bilder av lasermikrodissekerte tumorområder (røde linjer) og normale hjernevevområder (blå linjer). Avkastningsvalg gjøres for å dissekere områder av interesse (Figur 5A og B, lavere bilder). Vi kan observere i disse bildene suksessen i disseksjon av de valgte områdene.

RNA-ekstraksjon ble utført ved hjelp av et kommersielt sett. Det ble fastslått at et samlet areal av dissekert vev mellom 2,5 x 10⁶ - 7 x 10⁶ μm² var nødvendig for mRNA-ekstraksjon og cDNA-bibliotekforberedelse for påfølgende RNA-sekvensering. RNA kvalitetskontroll fastslått en RIN mellom 6 og 7 i gliomavev etter lasermikrodisseksjon. En RIN på 6 var fast bestemt på å være hensiktsmessig for cDNA bibliotek forberedelse. Etter RNA-ekstraksjon ble det benyttet et sett for RNA-isolasjon ved picomolære konsentrasjoner til å generere et cDNA-bibliotek som passer for neste generasjons sekvensering.

0,25 ng - 10 ng (1-8 μL) av RNA

4 μL av 5x First-Strand Buffer

1 μL av Oligos Mix V2

Nuclease-fritt vann til endelig volum på 13 μL

Tabell 1: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Master Mix forberedelse til trinn 8.3.

4,5 μL Mix V2

0,5 μL RNase-hemmer

2 μL omvendt transkripsjonase

Endelig volum på 7 μL

Tilsett 7 μL til RNA-prøverøret

Tabell 2: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Master Mix forberedelse til trinn 8.5.

42 °C i 90 min

70 °C i 10 min

4 °C hold

Tabell 3: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Termocycler-forhold for trinn 8.5.

2 μL kjernevann

25 μL 2x PCR Buffer

1 μL DNA Polymerase for hver reaksjon

Bland forsiktig og snurre ned kort

Tilsett 28 μL av hovedblandingen i hvert av prøverørene

Tilsett 1 μL av hver 5' og 3 ' primer til hvert rør

Bland reaksjonene forsiktig og snur res

Tabell 4: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Master Mix forberedelse til trinn 8.6.

1 syklus

94 °C i 1 min

5 sykluser

98 °C i 15 s

55 °C i 15 s

68 °C i 30 s

1 syklus

68 °C i 2 min, 4 °C hold

Tabell 5: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Termocycler-forhold for trinn 8.6.

16,8 μL kjernevann

2,2 μL 10x R Buffer

1,5 μL R v2

1,5 μL R-prober v2

Tabell 6: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Master Mix forberedelse til trinn 8.18.

37 °C 60 min.

72 °C 10 min.

4 °C hold

Tabell 7: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Termocycler-forhold for trinn 8.20.

26 μL nukleoasefritt vann

50 μL CB PCR Buffer

2 μL PCR2 Primers v2

2 μL DNA Polymerase

Tabell 8: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Master Mix forberedelse til trinn 8.21.

1 syklus

94 °C i 1 min

X sykluser

98 °C i 15 s

55 °C i 15 s

68 °C i 30 s

1 syklus

68 °C i 2 min, 4 °C hold

Tabell 9: RNA kvalitetskontroll og bibliotekforberedelse: Termocycler-forhold for trinn 8.21.

	Trinn 1	Trinn 2	Trinn 3
Metode 1	Tyrode er 15'	--	--
Metode 2	Tyrode er 5'	Sukrose 30 % 15'	--
Metode 3	Tyrode er 5'	4 % PFA 10'	--
Metode 4	Tyrode er 5'	30% sukrose 15'	Hjernen i 30% sukrose over natten

Tabell 10: Metoder for ulike perfusjonstilnærminger.

Figur 1: Museglioma modeller som brukes til laser mikrodisseksjon. (A) Sleeping skjønnhet GEMM brukes til å utvikle de novo glioma. Bilder viser tumorprogresjon: (i) plasmid injeksjon i lateral ventrikkel av nyfødte, (ii) tumorbyrde. (B) Generasjon av transplanterbar glioma modell ved hjelp av glioma celle kulturer. Nevrosfæreceller dyrket fra GEMM implanteres intrakranielt inn i striatum. (C) Skildring av kryo-snitting av hjernen innebygd i koronarorientering etter perfusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjematisk representasjon av metoden som brukes til å farge cryo-bevarte vevsseksjoner med Cresyl fiolett og Eosin. Lysbilder som brukes til farging ble håndtert med verktøy rengjort med RNase-fritt vann. Alle løsninger ble tilberedt med RNase/DNase fritt vann på flekkdagen. Cresyl fiolette flekker kjerner fiolett og eosin Y flekker cytoplasma rosa. Fargestoffer ble oppløst i 70% etanol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Sammenligning av ulike perfusjonsmetoder for å bevare vevmorfologi og RNA-integritet. H&E-bilder representerer komparativ morfologi av hjernevev som ble utsatt for perfusjon under forskjellige metoder: (A) Tyrodes løsning i 15 min, (B) Tyrodes løsning i 5 min, 4% PFA for 10 min, (C) Tyrodes løsning i 5 min, 30% sukrose i 15 min, og (D) Tyrodes løsning i 5 min, 30% sukrose i 15 min med overnatten nedsenking i 30% sukrose. RNA kvalitetsvurdering vises for hver perfusjonsmetode. Tomter skildrer 18s og 28s rRNA topper og den første markør toppen. Forholdet mellom 18 og 28 rRNA brukes til å bestemme RNA-kvalitet. Et gelbilde av RNA-fragmentene vises til høyre for plottene. RNA-kvaliteten ble vurdert ved hjelp av RIN-verdiene. RNA-kvaliteten var høy i metode A, C og D. Vevmorfologi var overlegen i metoder C og D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative bilder av montert og ikke-montert gliomvev. (A) Representative bilder av vev farget med H&E. Dette vevet ble igjen umontert og ble dehydrert viser dårlig morfologi med brudd i vevet. (B) Representative bilder av vev farget med H & E og montert med monteringsmedium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Representative bilder av gliomavev som brukes til lasermikrodisseksjon. - Jeg har ikke noe åsi. Representative bilder av vev farget med H & E og områder av flercellet strukturer valgt for LMD. (A) Til venstre ble områder med langstrakte celler (røde) og kontrollområder (blå) valgt for LMD. (B) Til høyre ble områder med kollektiv invasjon (rød) og kontrollområder (blå) valgt for LMD. (C) Representativ RNA kvalitetskontroll for lasermikrodissekerte områder. Et samlet areal på 6,5 x 10⁶ μm² ble mikrodissekert. Analysen viser RNA-konsentrasjon på 2346 pg/μL og RNA Integrity Number (RIN): 6,8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Forstå molekylære mekanismer underliggende glioma heterogenitet og invasjon er av avgjørende betydning for å avdekke nye terapeutiske mål¹³. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert og optimalisert metode for å analysere det molekylære landskapet av glioma heterogenitet og invasjon ved hjelp av laserfangst mikrodisseksjon (LMD) etterfulgt av transkripsjonomisk analyse.

Laser fangst mikrodisseksjon (LMD) kan brukes til å identifisere ulike områder eller enkeltceller i svulsten, noe som gir en bestemt prøve for å ytterligere analysere molekylært mønster opprettholde den romlige konteksten av svulsten¹⁴. Denne teknikken er pålitelig og rimelig sammenlignet med andre metoder som brukes til å analysere romlig transkripsjon i faste svulster¹⁵. Vi analyserte glioma heterogenitet og invasjon i genmodifiserte musetumormodeller eller intrakranielle implanterbare modeller ved hjelp av LMD. Disse modellene rekapitulere de viktigste egenskapene til menneskelige gliomer, slik at studiet av glioma heterogenitet og invasjon^10,12.

Opprettholde høy kvalitet tumor vev morfologi og RNA integritet er en av begrensningene for LMD. For å forbedre vevmorfologien gjennomsyret vi mus med Tyrodes løsning i 5 minutter, etterfulgt av 30% sukrose oppløst i samme løsning. Når hjernen ble dissekert, bevarte vi den i 30% sukrose oppløst i RNase / DNase-fritt vann over natten eller til hjernen nådde bunnen av oppbevaringsbeholderen. Disse trinnene forbedrer vevsmorfologien betydelig og reduserte dannelsen av iskrystaller i vevet under kryobevaring. Selv om menneskelig gliomavev ikke ble brukt til denne protokollen, kan inkubasjon av menneskelige prøver i 30% sukroseløsning over natten være en mulig metodikk for å forbedre kryoseksjoner morfologi. En annen mulig begrensning for LMD er bevaring av RNA integritet etter farging⁸. Selv om andre forskningsteam har utført lasermikrodisseksjon på gliomavev etterfulgt av RNA-seqanalyse, illustrerer de ikke noen RNA og / eller morfologi, og de kommenterer heller ikke morfologisk kvalitet, eller bestemte kontroller for gliomafrosne seksjoner¹⁶. I denne protokollen var nøyaktig morfologisk identifikasjon avgjørende for å lasermikrodissekere presise makrocellulære strukturer i gliomer. Vi observerte at å fikse gliomavev med etanolløsning og fargelegge det med 4% Cresyl fiolett og 0,5% eosin Y oppløst i etanol-vedlikeholdt RNA-kvalitet og aktivertmikroskopisk identifisering av enkeltceller og flercellulære strukturer. Vi viste at montering av gliomaseksjoner med monteringsløsning er et kritisk skritt som forhindrer sprekkdannelse og sprekkdannelse i vevet. Vær oppmerksom på at monteringsmediet må tilberedes i vann, da bruk av monteringsmediet oppløst i etanol vil resultere i dårlig vevmorfologi. Lasermikrodisseksjon må utføres så fort som mulig i et RNase-fritt miljø. Vi anbefaler også å seksjon opp til 2,5 x 10⁶ μm² totalt tumor/ vev område for å oppnå passende mengder RNA, både for RNA kvalitetskontroll og transkripsjonsanalyse.

LMD muliggjør analyse av molekylære signalveier som regulerer glioma heterogenitet og invasjon. Denne analysen kan avsløre nye potensielle mål for diagnose, prognose og fremtidig translasjonell utvikling i prekliniske gliomamodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571