Laser Capture Microdissection af Glioma subregions for rumlige og molekylære karakterisering af intratumoral heterogenitet, Oncostreams, og Invasion

Summary

Laser microdissection (LMD) er en følsom og meget reproducerbar teknik, der kan bruges til at afdække veje, der mægle gliom heterogenitet og invasion. Her beskriver vi en optimeret protokol til at isolere diskrete områder fra gliomvæv ved hjælp af laser LMD efterfulgt af transskriptionsanalyse.

Abstract

Gliomer er primære hjernetumorer karakteriseret ved deres invasiv og heterogenitet. Specifikke histologiske mønstre såsom pseudopalisader, mikrovaskulær spredning, mesenkymale transformation og nekrose karakteriserer den histologiske heterogenitet af højkvalitet gliomer. Vores laboratorium har vist, at tilstedeværelsen af høje tætheder af mesenkymale celler, navngivet oncostreams, korrelerer med tumor malignitet. Vi har udviklet en unik tilgang til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for gliomas vækst og invasion. Her beskriver vi en omfattende protokol, der udnytter laser capture microdissection (LMD) og RNA sekventering til at analysere differentialmRNA udtryk for intra-tumorheterogene multicellulære strukturer (dvs. mesenkymale områder eller områder af tumor invasion). Denne metode opretholder god væv histologi og RNA integritet. Perfusion, frysning, indlejring, skæring og farvning blev optimeret til at bevare morfologi og opnå høj kvalitet laser mikrodissektion prøver. Resultaterne viser, at perfusion af gliombærende mus ved hjælp af 30% saccharose giver god morfologi og RNA-kvalitet. Desuden, farvning tumor sektioner med 4% Cresyl violet og 0,5% eosin resulterer i god nuklear og cellulære farvning, samtidig med at RNA integritet. Den beskrevne metode er følsom og meget reproducerbar, og det kan udnyttes til at studere tumor morfologi i forskellige tumor modeller. Sammenfattende beskriver vi en komplet metode til at udføre LMD, der bevarer morfologi og RNA-kvalitet til sekventering for at studere de molekylære træk ved heterogene flercellede strukturer inden for solide tumorer.

Introduction

Gliomer er de mest aggressive primære tumorer i centralnervesystemet. De er meget invasive og heterogene¹. Analyse af cellulære og molekylære komponenter af tumoren vil afsløre nye terapeutiske mål.

Blandt forskellige metoder i øjeblikket til rådighed, laser capture microdissection (LMD) af frosne hjernetumor væv er en omkostningseffektiv, pålidelig teknik, der gør det muligt at isolation af diskrete anatomiske områder eller specifikke cellepopulationer fra tumorvæv til at studere deres molekylære profil^2,3. LMD gør det muligt at analysere mRNA-genekspressionsprofiler for udvalgte enkeltceller eller flercellede strukturer^4,5. LMD kan udnyttes til at få dybdegående mekanistisk viden om de molekylære begivenheder, der finder sted under tumorprogression. Forbedring i behandlingen af tumorvæv er nødvendig for at opnå optimal optisk opløsning af vævmorfologi og RNA-kvalitet⁶. Selvom paraformaldehydfiksering er den bedste løsning til morfologisk analyse, påvirkes RNA-kvaliteten og nedbrydes under disse forhold, hvilket resulterer i dårlig RNA-kvalitet til RNA-seq-analyse. Brugen af frosne vævssektioner undgår iskrystaldannelse, som kan bryde cellemembraner og producere huller i cellerne, og forbliver den bedste løsning for RNA-Seq-analyse⁷.

Her beskriver vi en optimeret sektion fiksering og farvning metode til at behandle frosne mus hjernetumor væv til LMD. For at forhindre iskrystaller i at danne i vævet, perfunderes vi mus med en opløsning på 30% saccharose. Denne løsning forstyrrer samspillet mellem polarvandmolekyler og forhindrer dannelsen af iskrystaller, bevare væv morfologi. Væv farvning er nødvendig for at differentiere og opnå specifikke population af celler eller anatomisk adskilte områder inden for tumoren. Det er vigtigt at fastsætte og plette vævet med uskadelige farvestoffer for at opretholde RNA-integritet. Det har tidligere været påvist, at farvningsvæv med hæmatoxylin/eosin (H&E) forringer RNA-integritet⁸. Vi fast og farves væv af interesse med ethanol, Cresyl violet 4% og eosin Y 0,5% opløsninger. Cresyl violet er en acidophilic farvestof, pletter cellekernen med en mørkeblå farve. Eosin Y er en basofile farvestof, pletter grundlæggende komponenter i cellerne, giver en sondring mellem cytoplasma og andre cellulære strukturer⁸. Begge farvestoffer er opløselige i ethanol og forringer ikke RNA-kvaliteten. For at undgå vævsskader og opretholde en høj optisk opløsning af de cellulære strukturer monterede vi vævssektionerne før LMD^9.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, at bruge forsøgsdyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Michigan.

BEMÆRK: Gliomneurosfærer genereret fra en GEMM eller stabile linjer kan bruges til intrakraniel tumor engraftment i mus¹⁰ og behandles for LMD og RNA sekventering. Disse celler konstituerende udtrykke firefly luciferase og GFP proteiner, som vil blive yderligere udnyttet til tumorvækst analyse og lokalisering.

1. Generation af intrakraniel mus gliom model fra neurosfærer stammer fra genetisk manipuleret gliom modeller

1. Hvis du vil generere en primær kultur af neurosfæreceller fra en gensplejset musemodel (GEMM), skal du bruge den protokol, der tidligere er beskrevet^10,11.
2. Forbered neurosfærekultur medium som beskrevet: 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) suppleret med 10 ml 50x B-27 og 5 ml af 100x N-2 neuronal kultur kosttilskud, 5 ml af 100x antimycotic, og 1 ml Normocin. Før plating neurosfærerne, tilsættes 20 NG/ml menneskelige rekombinant EGF og FGF til kulturmediet.
3. Kultur gliom neurosfærer i en vævskultur inkubator ved 37 °C og 5% CO₂ i 2-3 dage før intrakraniel tumor engraftment.
4. På dagen for operationen, indsamle gliom neurosfærer og spin dem på 550 x g i 5 min ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepellet.
5. For at adskille neurosfærerne skal cellepelletsen suspenderes igen i 1 ml celleløsrivelsesopløsning og inkuberes ved 37 °C og 5% CO₂ i 2-4 min. Efter inkubationstiden pipettes neurosfærerne op og ned med en 1 ml mikropipette for at sikre en enkelt cellesuspension.
6. Inaktiver celleløsrivelsesopløsningen ved at fortynde neurosfæresuspensionen med 10 ml ikke-suppleret DMEM/F12-medie. Drej neurosfærerne ved 550 x g i 5 min ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten.
7. Resuspender cellepelletien i 100 μL DMEM/F12-medier uden tilskud. Der foresættes 1:50 fortynding af cellesuspensionen, og tilsæt derefter 50 μL Trypan Blue for at tælle levedygtige celler. Brug følgende formel til at bestemme koncentrationen af celler:
   celler/ml = [(((-celler optalt pr. kvadrat) / antal optalte kvadrater) x 50 x 10.000 celler/ml]
8. Efter bestemmelse af celletallet drejes neurosfærerne ned og suspenderes i den relevante mængde DMEM/F12 uden tilskud for at opnå en målkoncentration på 30.000 celler/μL i 100 μL-volumen.
9. Placer neurosfærer i et formærket 0,6 ml rør på is.
10. Forbered arbejdsløsninger af anæstesi, analgetisk, og anæstesi vending før implantation: For ketamin/dexmedetomidin anæstesi, tilsættes 0,6 ml 100 mg/ml ketamin hydrochlorid og 0,8 ml 0,5 mg/ml dexmedetomidin hydrochlorid til sterile 8,6 ml 0,9% NaCl indeholdende hætteglas. For buprenorphin analgetisk tilsættes 1 ml 0,3 mg/ml buprenorphin til 9 ml 0,9% NaCl indeholdende hætteglas. For atipamezole anæstesivending tilsættes 1 ml 5 mg/ml atipamezole til 9 ml 0,9% NaCl indeholdende hætteglas.
11. Brug 6-8-uger gamle C57BL/6J kvindelige mus til intrakraniel tumor engraftment.
12. I et rum godkendt til gnaver overlevelse kirurgi, oprette sterile forsyninger til intrakraniel tumor engraftment. Udfør operationer på en gnaver stereotaxic ramme udstyret med en steriliseret 10 μL Hamilton sprøjte med en aftagelig 33G nål. Udnyt en perle sterilisator til at sterilisere værktøjer mellem operationer.
13. Bedøve mus med en enkelt intraperitoneal injektion (i.p.) af bedøvelsesopløsningen fremstillet i trin 1.11 (ketamin:75,0 mg/kg og dexmedetomid:0,5 mg/kg). Ca. 250 μL volumen af bedøvelsesopløsningen vil blive leveret til en mus, der vejer 20 g. Sørg for, at musen ikke reagerer på pedalrefleks, før den fortsætter.
14. Når musen er i en dybt bestøvet tilstand, anvende sterile petrolatum oftalmologiske smøremiddel til øjnene for at forhindre tørring. Barber pelsen på musekraniet. Påfør 10% povidon-jod aktuel opløsning på det barberede område for at desinficere.
15. Fastgør musens kranium i en stereotaktisk ramme. Først skal du forsigtigt åbne munden med pincet og forsigtigt trække tungen og flytte den til den ene side af munden for at forhindre kvælning. Hold munden åben med pincet og placer de øverste fortænder i nøglehullet i tandstangen på stereotaktisk rammen.
16. Hold musehovedet ved ørerne, placer ørestængerne mod de postorbitale knogler og fastgør dem. Sørg for, at musens kranium er i niveau med den kirurgiske bordplade. Fastgør ørestængerne omhyggeligt og tryk ikke mod kraniet. Derefter skal næsestangen fastgøres omhyggeligt.
17. Brug en størrelse 15 skalpel klinge, lave et snit langs musehovedet, udsætter kraniet. Træk huden tilbage på incisionsstedet ved hjælp af Colibri-retraktorer. Brug en steril applikator til at fjerne alt perikranielt væv.
18. Identificer bregmaen, og sænk kanylen på Hamilton-sprøjten direkte over den. Brug rammen til at placere nålen 1 mm foran bregma og 1,5 mm lateral. Ved hjælp af en 26G nål, markere dette sted ved at score kraniet.
19. Brug en ledningsfri boremaskine udstyret med et 0,45 mm bor til at skabe et grathul på målstedet. Bor indtil den underliggende dura mater nås. Træk forsigtigt den resterende knogle i grathullet ud med en 26G nål.
20. Ved hjælp af en pipette homogeniseres cellerne grundigt, og der trækkes 7 μL af neurosfæresuspensionen ind i sprøjten. For at sikre, at sprøjten fungerer korrekt, skal 1 μL af suspensionen dispenseres på en 70 % alkoholgennemblødt pude.
21. Sænk nålen til overfladen af dura mater. Sænk sprøjten 3,5 mm ventral og træk 0,5 mm tilbage. Dette vil skabe en 0,5 mm plads i hjernen for neurosfærer at deponere, når injiceres.
22. Lad nålen være på plads i 2 minutter for trykekvilibrering. Langsomt og jævnt levere 1 μL af cellerne i løbet af 1 min. Lad cellerne bosætte sig i 6 min. Fjern sprøjten langsomt og glat fra hjernen i løbet af 2 min.
23. Brug steril saltvandsopløsning til at vaske kraniets overflade tre gange. Dispenser de overskydende celler i sprøjten på en 70% alkohol pad, og tør nålen ren med en anden 70% alkohol pad. Skyl sprøjten med steril PBS for at undgå tilstopning af nålen.
24. Fjern retraktorerne, og tag forsigtigt musen ud af den stereotaktiske ramme. Luk snittet med 3-0 nylon suturer, pincet, og en nål driver.
25. Administrere atipamezole (1,0 mg/kg), ca. 100 μL for en 20 g mus. Administrere buprenorphin (0,1 mg/kg subkutan) subkutant, ca. 70 μL for en 20 g mus. Placer post-kirurgiske mus i en ren opsving bur og overvåge dem, indtil alarm og aktiv.

2. Dyreperfusion og hjernekonservering

1. At overvåge tumor progression, bestemme in vivo bioluminescens ved hjælp af en in vivo imaging system, indtil dyrene viser tegn på tumor byrde. Euthaniser mus, når de når et signal mellem 10⁶ til 10⁷ foton/ s.
2. Bedøve mus viser tegn på tumor byrde med intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin (75.0mg/kg) og dexmedforetomidin (0.5 mg/kg) opløsning. Lever ca. 250 μL til en mus, der vejer 20 g. Sørg derefter for, at musen ikke reagerer på pedalrefleks.
3. Brug pincet, holde huden over bughulen, og ved hjælp af et stort par dissektion saks gøre en "Y" snit ved at trænge ind i bugvæggen, punktere mellemgulvet, og derefter skære brystkassen.
4. Sæt en stump 20G kanyl i venstre hjertekammer i musens hjerte. Så klip højre atrium af hjertet for at give mulighed for exsanguination.
5. Tillad iltet Tyrodes opløsning (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl_2,0,005% NaH₂PO_4,0,1% glukose, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) til at flyde gennem musekredsløbet, indtil leveren og lungerne er helt ryddet på grund af fjernelse af blod (~ 5 min).
6. Fortsæt med at perfusing dyret med 30% saccharoseopløsning opløst i Tyrodes opløsning i yderligere 15 min. For at vurdere succesen af perfusion, bekræfte, at hals, hale og ben er stive post 30% saccharose cirkulation.
7. Ved hjælp af et lille par dissektion saks, skære hovedbunden på midterlinjen. Starter ved occipital knoglen og arbejder fremad mod snuden. Dette vil afsløre kraniet.
8. Ved hjælp af et par rongeurs, bryde gennem kraniet begynder ved occipital knoglen og fortsætte fremad til helt at udsætte overflader af hjernen. Drej derefter hovedet op og dissekere nerverne i bunden af hjernen for at frigøre det fra kraniet.
9. Forbered 30% saccharoseopløsning med RNase frit vand og filtrere det gennem et 40 μm nylon mesh filter for at reducere RNA nedbrydning.
10. For at maksimere infiltration af saccharoseopløsning skal de dissekerede hjerner anbringes i 30 % saccharoseopløsning og opbevares ved 4 °C natten over. Før yderligere behandling sikre, at hjernen når bunden af de rør, der indeholder saccharose opløsning.

3. Kryopræservering af hjerner huser gliom tumorer

1. Før kryopræservering af hjerner, forberede en krukke fyldt med kolde isopentan/2-methylbutan og placere krukken i en beholder fyldt med flydende nitrogen. Lad opløsningsmidlet køle af.
2. Fjern hjernen fra 30% saccharose opløsning og blot det tørre på et filterpapir.
3. Mærk kromolden med en permanent markør. Tilsæt forsigtigt ca. 5 ml OLT (optimal skæretemperaturforbindelse) ind i midten af kromolden og undgå luftbobler.
4. Placer hjernen i cryomold indeholder OLT i den ønskede orientering. Fyld formen med OLT, indtil hjernen er helt nedsænket. Brug rene pincet, hurtigt placere cryomold med OLT og hjernen i den kolde isopentan/2-methylbutan.
5. Når OLT størkner (~ 30-40 s), fjerne cryomold med hjernen og læg den i tøris. Efterlad ikke formen, der indeholder hjernen i 2-methylbutan forbi 2 min, da dette kan forårsage revner i fast OCT. Pak kromolden ind med hjernen i aluminiumsfolie og opbevar den ved -80 °C.

4. Afsnit frosne hjernetumor væv

1. Mærke 2 μm polyethylennaphthalat (PEN) dias med prøveoplysningerne. Væv sektioner vil blive placeret direkte på disse dias efter skæring.
2. Indstil kryocentrets temperatur mellem -20 til -24 °C. Før skæring ender prøveblokken i kryodekammeret, og den skal bringes i ligevægt med temperaturen i kammeret i 30-60 min.
3. Rengør kryotørrekammeret og knivholderen med 100% ethanol, og spray de børster, der skal anvendes, med RNase rengøringsopløsning. Arbejde inde i kryodekammeret, fjerne formen og fastgør OLT blok, der indeholder hjernen til kryoat prøve disk med OCT. Placer blokken i diskholderen og tilpasse blokken med knivbladet.
4. Sæt en engangsklinge i snitholderen.
5. Del hjernen ved 10 μm tykkelse. Sørg for, at der ikke er striber eller ridselinjer i vævet. Ved hjælp af en pensel, forsigtigt flade og uncurl vævet på skæreoverfladen.
6. Monter forsigtigt vævet, der indeholder hjernesektionerne, på RNase-frie PEN-glasdias. Vend de positive ladede glasdias med fingrene i retning af vævet og tryk forsigtigt glasglideren ned mod vævssektionen.
   BEMÆRK: Temperatur af hænder vil hjælpe vævet tillægger glasset.
7. Efter montering af hjernesektionerne på objektglassene, opbevares objektglas i en kasse inde i kryodekammeret og derefter opbevares ved -80 °C. Hold aldrig objektglassene ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Foldning af vævet, og rive er almindelige. For nøjagtig bageste analyse, er det vigtigt at minimere disse artefakter.

5. Fiksering og farvning af kryoreserverede hjernevæv sektioner

1. For at bevare RNA-integriteten skal alle instrumenter rengøres, så de kan anvendes sammen med RNase-rengøringsopløsningen. Fortsæt med fikserings- og farvningsprotokollen inde i en røghætte.
2. Klargør de beskrevne fiksative opløsninger i rene RNase-frie 50 ml rør. Lav alle løsninger med RNase frit vand på dagen for farvningen.
3. Samme dag laser mikrodissektion vil blive udført, forberede 100%, 95%, 70% og 50% ethanol opløsninger. Opbevar opløsningerne i tæt lukkede rør ved stuetemperatur.
4. Der fremstilles 4% Cresyl violet og 0,5% eosin Y i 75% ethanolopløsning. Vortex opløsningen kraftigt i 1 min og filtrere dem gennem en 0,45 μm nylon filter for at fjerne spor af uopløst pulver.
5. Vævsgliderne anbringes i en beholder med 95 % ethanol til 30 s. Overfør objektglas til røret, der indeholder 75 % ethanol. efterlade dias der i 30 s.
6. Overfør dias til 50% ethanol og lad dem der for 25 s. På dette tidspunkt vil OLT blive opløst. Skubet overføres til 4% Cresyl violet opløsning i 20 s, og derefter overføres til 0,5% eosin Y opløsning til 5 s.
7. Tag slæden ud af farveopløsningen og skamplet slæden tør med et filterpapir. Placer derefter objektglassene i 50% ethanol i 25 s. Overfør objektglassene til 75% ethanol for 25 s. Overfør objektglassene til 95% ethanol i 30 s. Overfør objektglassene til 100% ethanol til 60 s.
8. Skyl slæden med xylen. Overfør dem til en beholder med xylen og vent 3 min.
9. Forbered monteringsmediet (f.eks. Pinpoint-gummi) i RNase-frit vand. For at montere musehjernesektioner fortyndes monteringsmediet i RNase-frit vand i et forhold på 1:10.
10. Tør objektglassene på en RNase-fri overflade ved stuetemperatur i 10 s. Før xylen tørrer, gå videre til montering af dias med væv sektioner.
11. Disperb forsigtigt monteringsopløsningen oven på vævet på sliden med en steril og RNase-fri tynd pensel. Vent 10-20 s, og derefter straks overføre væv dias til mikroskopet microdissection platform.
    BEMÆRK: Forholdet mellem monteringsmedium til RNase-frit vand, der anvendes til montering, varierer afhængigt af det væv, der er af interesse. Monteringsforholdet mellem medium/vand bevarer gliomvævsmorfologi til lasermikrodissektion uden at påvirke RNA-integriteten.

6. Laser capture mikrodissection

BEMÆRK: En laser capture microdissektion mikroskop skal udnyttes til laser microdissect specifikke områder af interesse inden for tumorvæv. For at minimere tiden for vævlasermikrodissekafk, skal LMD-mikroskopet fremstilles før fiksering og farvning.

1. For at starte systemet skal du først tænde for strømstrimlen efterfulgt af at tænde for laseren. Tænd derefter mikroskopcontrolleren og computeren. Start LMD-softwaren.
2. Vælg 10x forstørrelse under Mikroskopkontrol. Under Laser kontrol, indstille laser parametre for væv dissektion. Indstil en laserfrekvens på 120 Hz for at opnå de bedste skæreresultater. Indstille altid laserstrømmen til 100%.
3. For nøjagtig lasermikrodissektion indstilles hastigheden til 10 og en blændeindstilling til 2,0-10,0 μm. Indstil effekten til 53. Hvis lasereffekten er højere, kan det medføre, at der ætser glas.
4. Læg vævsopsamleren, der fanger vævet efter dissektion. Klik på den anden aflæsningsknap. Fjern den tomme opsamler, og de dnasefri 0,5 ml PCR-rør, der indeholder 30 μL lysisbuffer, anbringes i opsamleren. Placer opsamleren tilbage i maskinen, og klik på Fortsæt på softwaren for at fortsætte.
5. Læg den forarbejdede (faste og farvede) prøve på mikroskopet. Først skal du klikke på aflæs på LMD-softwaren. Monter derefter prøven på objektglasholderen, og placer objektholderen på scenen. Klik på Fortsæt på softwaren for at fortsætte.
6. Vælg Tegn + Klip under Vinduer til Klip figurer. Brug mikroskopkontrolelementerne til at finde det område, der interesserer sig. Tegn interesseregionen (ROI), og vælg et destinationsopsamlerrør. Det er muligt at trække flere ROI'er til mikrodissekere forskellige områder fra et enkelt dias på samme tid.
7. Klik på Start klip for at fortsætte til vævsmikrodissektion. Efter at have opdelt de områder, der er af interesse, fjernes opsamlerrørene fra holderen og rørene anbringes på tøris. RNA-vævsprøverne overføres til -80 °C til langtidsopbevaring.

7. RNA-isolering af mikrodissekeret gliomvæv

1. Til RNA-ekstraktion fra LMD skal du bruge et RNA-isolationssæt, der er optimeret til små prøver og lavt RNA-udbytte (se Materialetabel). Følg producentens anvisninger. Alle isolationstrinene udføres ved stuetemperatur (25 °C). For at opretholde RNA-kvalitet skal du arbejde hurtigt. Klargør alle de løsninger, som producenten har angivet.
2. Prøvevolumenet justeres til 350 μL med lysisbuffer med 1% β-mercaptoethanol. Vortex prøven for 40 s for at reducere prøven viskositet og øge RNA eluering spin kolonne effektivitet.
3. Hele prøven overføres til en gDNA eliminatorspinkolonne, der er anbragt i et 2 ml opsamlingsrør. Røret centrifugeres i 30 s ved 8.000 x g. Gem gennemstrømningen og sørg for, at der ikke efterlades væske på kolonnen efter centrifugering.
4. Der tilsættes 350 μL 70% ethanol til gennemstrømningen og blandes godt ved pipettering op og ned. Prøven overføres til en RNA-elueringsspinkolonne, der er placeret i et 2 ml opsamlingsrør. Luk låget forsigtigt, og centrifuger i 15 s ved 8.000 x g. Kassér gennemstrømningen og gemme kolonnen.
5. Der tilsættes 700 μL RNA-vaskebuffer 1 (20% ethanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) til RNA-elueringspinsøjlen. Luk låget forsigtigt, og centrifuger i 15 s ved 8.000 x g for at vaske spinsøjlemembranen. Kassér gennemstrømningen.
6. Efter centrifugering fjernes RNA-elueringspinsøjlen forsigtigt fra opsamlingsrøret, så kolonnen ikke kommer i kontakt med gennemstrømningen.
7. 500 μL af den anden RNA-vaskebuffer (ethanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) til spin-kolonnen. Luk låget af kolonnen og drej 8.000 x g i 20 s for at vaske søjlemembranen. Smid gennemstrømningen ud.
8. For at vaske RNA-elueringskolonnen tilsættes 500 μL 80% ethanol, låget af kolonnen og centrifugeres ved 8000 x g i 2 min. Smid rørene ud med elueringsopløsningen.
9. Brug et nyt opsamlingsrør, åbn låget på centrifugeringskolonnen, og centrifugering ved 8000 x g i 5 min for at tørre kolonnen. Se elueringsrøret ud.
10. Placer RNA-elueringsspinsøjlen i et nyt 1,5 ml opsamlingsrør. Der tilsættes 12 μL RNase-frit vand opvarmet ved 37 °C direkte til midten af centrifugeringsmembranen. Vent i 4 minutter og centrifuger i 1 minut ved fuld hastighed til elute RNA.

8. RNA-kvalitetskontrol, biblioteksforberedelse og RNA-Seq-analyse

1. Efter RNA-ekstraktion og rensning kan RNA forstærkes, og der oprettes et cDNA-bibliotek ved hjælp af et særligt sæt, der er egnet til RNA-isolation ved pico-molære koncentrationer efter producentens anvisninger (se Materialetabel). Følg producentens anvisninger. Rengør arbejdsstationen for at undgå kontaminering med andre PCR-produkter og nukladening af prøver.
2. Hvis RNA har en RIN-værdi på mere end 4, hvilket betyder, at RNA er af god kvalitet eller kun delvist nedbrudt, skal du fortsætte med fragmenteringstrinnet. Forbered alle genstande på is.
3. Opret en mastermix som angivet (tabel 1). Opret reaktionsblanding i et nukleaserfrit tyndvægsrør på 0,2 ml PCR. Inkuberrørene ved 94 °C i en varmelågsvarmecykelmaskine. Fragmenteringsinkubationstiden afhænger af RNA'ets kvalitet. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Efter inkubation anbringes rørene på en PCR-køler, der tidligere blev afkølet ved -20 °C, og lad den sidde i 2 min.
5. For hvert rør af RNA-prøven fremstilles første strengsyntesemastermix (tabel 2). Rørgene inkuberes i en varmelågscykelmaskine under de i tabel 3 beskrevneforhold . cDNA-produkter kan fryses ved -20 °C indtil i to uger, før du går videre til næste trin.
6. Opret PCR-masterblandingen som angivet i tabel 4. Anbring rørene i en varm lågvarmevarmer , og pcr-reaktionen køres under de indstillinger, der er angivet i tabel 5.
7. Lad perlerne, som vil blive brugt til at rense DNA'et, til at varme til stuetemperatur. Når perlerne er opvarmet, tilsættes der 40 μL af perlerne til hver prøve. Vortex rørene til at blande og spinde ned kort for at indsamle væske i bunden af røret. Lad rørene inkubere ved stuetemperatur i 8 minutter for at lade DNA'et binde sig til perlerne.
8. Placer rørene på en magnetisk adskillelsesanordning og lad sidde i ca. 5 min, eller indtil opløsningen bliver helt klar. Hold rørene på separationsanordningen, brug en pipette til at fjerne supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre perlerne.
9. Hold rørene på separationsanordningen, tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol til perlerne for at vaske uden at forstyrre perlerne. Vent i 30 s, før du fjerner 80% ethanol. Gentag dette trin.
10. Drej kortvarigt ned i rørene og placer rørene tilbage på separationsanordningen. Fjern eventuel resterende 80% ethanol uden at forstyrre perlerne.
11. Lad rørene lufttørre med hætterne åbne i 5 min. Lad det ikke sidde længere, da perlerne vil over tørre.
12. Hold rørene på separationsanordningen, tilsæt 52 μL nukleaserfrit vand til at dække perlerne. Fjern rørene fra separationsanordningen og pipette op og ned, indtil alle perlerne er opslæmmet. Inkuber på 5 min ved stuetemperatur.
13. Anbring rørene tilbage på separationsanordningen, indtil opløsningen bliver klar, ca. 1 min. Overfør 50 μL af den resulterende supernatant til brøndene på en 8-brøndsstrimmel. Der tilsættes 40 μL nye perler til hver prøve. Vortex grundigt at blande. Lad perler ne binde sig til DNA ved at inkubere ved stuetemperatur i 8 min.
14. I denne inkubationsperiode påbegyndes optøningen af de komponenter, der skal anvendes til rRNA i prøverne. Når optøet, placere dem på is. Også, forvarm en termisk cycler til 72 °C.
15. Prøverne anbringes på den magnetiske separationsanordning, indtil opløsningen er klar (ca. 5 min). Aliquot 1,5 μL sonder pr. prøve til et kølet PCR-rør. Røret anbringes i den forvarmede varme cykelmaskine under indstillingerne på 72 °C i 2 min. og 4 °C.
16. Hold prøverørene i den magnetiske adskillelsesanordning, fjern supernatanten med en pipet uden at forstyrre perlerne. Derefter tilsættes 200 μL frisklavet 80% ethanol til perlerne til at vaske uden at forstyrre perlerne. Vent 30 s, før du fjerner 80% ethanol. Gentag dette trin.
17. Drej kortvarigt ned i rørene og placer rørene tilbage på separationsanordningen. Fjern eventuel resterende 80% ethanol uden at forstyrre perlerne. Lad rørene lufttørre med hætterne åbne i 2 min. Lad ikke sidde længere, da perlerne vil over tørre.
18. Der fremstilles mastermix til alle prøver ved at kombinere følgende komponenter i den viste rækkefølge (tabel 6).
19. Mastermixet blandes ved vortexing, og der tilsættes 22 μL af blandingen til de tørrede perler i hver prøve, og blandes grundigt for at resuspendere. Lad det inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
20. Spin ned rørene og læg dem på den magnetiske adskillelse enhed i 1 minut, eller indtil prøverne bliver klare. 20 μL af supernatanten overføres uden at forstyrre perlerne til nye PCR-rør. Rørene anbringes i en forvarmet termisk cycler under indstillingerne i tabel 7.
21. Forbered en PCR master mix for nok til reaktioner for hver prøve. Føj følgende komponenter til masterblandingen i den angivne tabel 8. 80 μL af PCR-masterblandingen tillægges hvert af prøverørene fra trin 8.20 og placeres i den termiske cycler ved følgende indstillinger (tabel 9).
22. Tillad perler, som vil blive brugt til at rense DNA, at varme til stuetemperatur. Når perlerne er opvarmet, tilsættes de 100 μL perler til hver prøve. Lad rørene inkubere ved stuetemperatur i 8 minutter for at lade DNA'et binde sig til perlerne.
23. Placer rørene på en magnetisk adskillelsesanordning og lad sidde i ca. 5 min, eller indtil opløsningen bliver helt klar.
24. Hold rørene på separationsanordningen, brug en pipette til at fjerne supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre perlerne.
25. Hold rørene på separationsanordningen, tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol til perlerne for at vaske uden at forstyrre perlerne. Vent i 30 s, før du fjerner 80% ethanol. Gentag dette trin.
26. Drej kortvarigt ned i rørene, og placer rørene tilbage på separationsanordningen. Fjern eventuel resterende 80% ethanol uden at forstyrre perlerne.
27. Lad rørene lufttørre med hætterne åbne i 5 min. Lad ikke sidde længere, da perlerne vil overtørre. Pipette 20 μL Tris Buffer til den tørrede pellet. Fjern røret fra separationsanordningen og bland grundigt med en pipet for at resuspendere perlerne. Lad det inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
28. Anbring rørene på separationsanordningen i 2 minutter, eller indtil opløsningen bliver klar. Anskaf supernatanten og overfør den til nye rør. Derefter opbevares den indsamlede opløsning ved -20 °C.
29. Kontroller de endelige bibliotekers behov for kvalitetskontrol og kvantitetskontrol. Pool prøverne, grupperet på og sekvens, som parret-end 50 nt læser, i henhold til producentens anbefalede protokoller.

Representative Results

Vores laboratorium har genereret en genetisk manipuleret mus modeller (GEMM' er) ved hjælp af sovende skønhed transposase system (Figur 1A). Dette system indeholder specifikke genetiske ændringer i genomet af neurale progenitor celler i neonatal mus. Disse ændrede stamdømmeceller danner endogene gliomtumorer. Plasmid sekvenser bruges til at generere tumorer var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X for Sleeping Beauty transposon & luciferase udtryk, (2) pT2-NRASSV12 for NRAS udtryk, (3) pT2-shp53-GFP4 for p53 knock-down og GFP protein udtryk, og (4) pT2-shATRx-GFP4 for ATRX knock-down. Plasmider blev injiceret i den laterale ventrikel af 1-dages gamle nyfødte unger som beskrevet tidligere¹¹. Plasmid optagelse og tumor dannelse blev overvåget via in vivo bioluminescens imaging system. Når tumor-bærende mus viste tegn på tumor byrde, de blev ofret. Tumorer blev enten brugt til at generere neurosfærekulturer eller direkte kryokonserveret til LMD-behandling (Figur 1A).

Cellekulturer startet fra GEMM blev brugt til at generere en oversættelig gliommodel (Figur 1B). Gliom neurosfærer stammer fra GEMM tumorer blev dyrket og implanteret intrakranielt ind i striatum af immun-kompetente mus. Enkelt celle suspensioner fremstillet af neurosfærer kultur blev brugt til at generere gliom tumorer ved intrakraniel implantation som beskrevet før af vores laboratorium^10,11,12. Denne metode gør det muligt at kvantificere antallet af celler omhyggeligt pr. mus (30.000 celler/1 μL/mus). Denne protokol tillader reproducerbarhed af resultaterne mellem forskellige eksperimentelle implantationer. Men, implantation af neurosfærer kunne være en alternativ mulighed for at generere mus gliom tumorer og efterfølgende LMD og RNA-Seq analyse. Ikke desto mindre anses denne metode for at være mere præcis. Tumor progression blev overvåget af in vivo bioluminescens spektrum imaging system. Mus, der viste tegn på tumorbyrde, blev transcardialt perfunderet, og hjernen blev kryokonserveret til LMD-behandling (figur 1C).

Væv sektioner blev laser microdissected at karakterisere transskription af multicellulære strukturer i gliomer. De beskrevne perfusions-, fryse- og indlejringsprocedurer blev optimeret til at bevare vævmorfologi og opnå RNA af god kvalitet efter lasermikrodissektion. Forskellige perfusionsmetoder blev evalueret med henblik på at erhverve væv med overlegen morfologi og RNA-integritet (tabel 10). For at dissekere de områder af interesse, var det nødvendigt at plette vævet med uskadelige farvestoffer til RNA (Figur 2). Vi observerede, at perfunderende tumorbærende mus med Tyrodes opløsning i 5 min, og derefter 30% saccharose i 15 min, efterfulgt af natten opbevaring af dissekeret hjernen i 30% saccharose bevarer morfologi og RNA integritet tumorvæv (Figur 3D). Perfusion med 30% saccharoseopløsning forhindrede iskrystaldannelse i vævet. Selv om paraformaldehydvævsfiksering resulterede i vævsmorfologi af høj kvalitet, blev RNA-integriteten negativt påvirket (figur 3B). Andre tilgange såsom Tyrodes opløsning i 5 min eller Tyrodes opløsning i 5 min + 30% saccharoseopløsning i 15 min (figur 3A og C)påvirkede ikke RNA-kvaliteten. Under disse forhold blev hjerner ikke bevaret i 30% saccharose natten over; vi observerede nedsat opløsning i vævmorfologi.

Vi udførte forskellige farvningsteknikker efterfulgt af RNA integritet kvalitetskontrol analyse. Vi bemærkede, at 4% Cresyl violet og 0,5% eosin Y farvning var tilstrækkelig til at identificere gliom flercellede strukturer og opretholde RNA integritet. Cresyl violet er en acidophilic farvestof, pletter kernen af celler med en mørkeblå farve. Eosin Y er et basofiltfarvestof, der pletter grundlæggende komponenter i cellerne.

Vi bemærkede, at hvis vævet ikke var monteret med monteringsmedium, blev sektionerne dehydreret og morfologien forværret (Figur 4A). For at opretholde vævsmorfologi af høj kvalitet monterede vi vævet med monteringsmedium. Vi bemærkede, at 15% monteringmedium opløst i vand (30 μL i 200 μL vand) opretholdt høj kvalitet væv morfologi (Figur 4B).

I figur 5Avises områder med gliomheterogenitet. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en laser capture microdissection mikroskop forud for dissektion. Røde linjer skildrer områder med rigelige mesenkymale celler (aflange celler). Blå linjer viser områder uden mesenkymale celler (afrundede celler) (Figur 5A, mellembillede). Figur 5B viser billeder af mikrodissekeret laser-dissekeret tumorområder (røde linjer) og normale hjernevævsområder (blå linjer). Valg af roi foretages for at dissekere interesseområder(figur 5A og B, lavere billeder). Vi kan observere i disse billeder succes i dissektion af de udvalgte områder.

RNA ekstraktion blev udført ved hjælp af et kommercielt kit. Det blev fastslået, at et samlet areal af dissekeret væv mellem 2,5 x 10⁶ - 7 x 10⁶ μm² var påkrævet til mRNA-ekstraktion og cDNA-biblioteksforberedelse til efterfølgende RNA-sekvensering. RNA's kvalitetskontrol afgjorde en RIN mellem 6 og 7 i gliomvæv efter lasermikrodissektion. En RIN på 6 blev fastslået at være passende for cDNA bibliotek forberedelse. Efter RNA ekstraktion blev et sæt til RNA-isolation ved picomolarkoncentrationer brugt til at generere et cDNA-bibliotek, der er egnet til næste generations sekventering.

0,25 ng - 10 ng (1-8 μL) af RNA

4 μL af 5x First-Strand Buffer

1 μL af Oligos Mix V2

Nuclease-frit vand til det endelige rumfang på 13 μL

Tabel 1: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Master Mix forberedelse til trin 8.3.

4,5 μL Blanding V2

0,5 μL RNase-hæmmer

2 μL omvendt transskriptase

Endeligt rumfang på 7 μL

7 μL tilRNA-prøverøret tilsættes

Tabel 2: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Master Mix forberedelse til trin 8.5.

42 °C i 90 min.

70 °C i 10 min.

4 °C hold

Tabel 3: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Termocyclerbetingelser for trin 8.5.

2 μL nukle-frit vand

25 μL 2x PCR-buffer

1 μL DNA Polymerase for hver reaktion

Bland forsigtigt og drej ned kort

28 μL af masterblandingen tilsættes til hvert prøveglas

Der tilsættes 1 μL af hver 5' og 3' primer til hvert rør

Bland reaktionerne forsigtigt og drej ned kort

Tabel 4: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Master Mix forberedelse til trin 8.6.

1 cyklus

94 °C i 1 min.

5 cyklusser

98 °C for 15 s

55 °C for 15 s

68 °C for 30 s

1 cyklus

68 °C i 2 min. 4 °C hold

Tabel 5: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Termocyclerbetingelser for trin 8.6.

16,8 μL nukle-frit vand

2,2 μL 10x R Buffer

1,5 μL R v2

1,5 μL R-sonder v2

Tabel 6: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Master Mix forberedelse til trin 8.18.

37 °C 60 min.

72 °C 10 min.

4 °C hold

Tabel 7: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Termocyclerbetingelser for trin 8.20.

26 μL nuclease-frit vand

50 μL CB PCR-buffer

2 μL PCR2 Primere v2

2 μL DNA Polymerase

Tabel 8: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Master Mix forberedelse til trin 8.21.

1 cyklus

94 °C i 1 min.

X-cyklusser

98 °C for 15 s

55 °C for 15 s

68 °C for 30 s

1 cyklus

68 °C i 2 min. 4 °C hold

Tabel 9: RNA-kvalitetskontrol og biblioteksforberedelse: Termocyclerbetingelser for trin 8.21.

	Trin 1	Trin 2	Trin 3
Metode 1	Tyrode's 15'	--	--
Metode 2	Tyrode's 5'	Saccharose 30% 15'	--
Metode 3	Tyrode's 5'	4% PFA 10'	--
Metode 4	Tyrode's 5'	30% Saccharose 15'	Hjerne i 30% Saccharose Overnight

Tabel 10: Metoder til forskellige perfusionsmetoder.

Figur 1: Gliommodeller for mus, der anvendes til lasermikrodissektion. (A) Sovende skønhed GEMM bruges til at udvikle de novo glioma. Billeder viser tumor progression: (i) plasmid injektion i den laterale ventrikel af nyfødte, (ii) tumor byrde. (B) Generation af transplanterbar gliommodel ved hjælp af gliomcellekulturer. Neurosfæreceller dyrket fra GEMM er implanteret intrakranielt ind i striatum. (C) Skildring af kryo-skæring af hjernen indlejret i koronal orientering efter perfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Skematisk repræsentation af den metode, der anvendes til at plette kryokonserverede vævssektioner med Cresyl violet og Eosin. Slides, der anvendes til farvning, blev håndteret med værktøj, der blev rengjort med RNase-frit vand. Alle løsninger blev tilberedt med RNase/DNase frit vand på farvningsdagen. Cresyl violet pletter kerner violet og eosin Y pletter cytoplasma pink. Farvestoffer blev opløst i 70% ethanol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Sammenligning af forskellige perfusionsmetoder for at bevare vævmorfologi og RNA-integritet. H&E-billeder repræsenterer sammenlignende morfologi af hjernevæv, der blev udsat for perfusion under forskellige metoder: (A) Tyrodeopløsning i 15 min. (B) Tyrodes opløsning i 5 min, 4% PFA i 10 min,(C)Tyrodeopløsning i 5 min, 30% saccharose i 15 min og(D)Tyrodeopløsning i 5 min. 30% saccharose i 15 min med nedsænkning natten over i 30% saccharose. RNA-kvalitetsvurderingen vises for hver perfusionsmetode. Parceller skildrer 18s og 28s rRNA toppe og den oprindelige markør peak. Forholdet mellem 18s og 28s rRNA bruges til at bestemme RNA kvalitet. Et gelbillede af RNA-fragmenterne vises til højre for parcellerne. RNA-kvaliteten blev vurderet ved hjælp af RIN-værdierne. RNA-kvaliteten var høj i metode A, C og D. Vævsmorfologi var overlegen i metode C og D. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentative billeder af monteret og ikke-monteret gliomvæv. (A) Repræsentative billeder af væv, der er farvet med H&E. Dette væv blev efterladt umonteret og blev dehydreret viser dårlig morfologi med pauser i vævet. (B) Repræsentative billeder af væv, der er plettet med H&E, og som er monteret med monteringsmedium. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Repræsentative billeder af gliomvæv, der anvendes til lasermikrodissektion. (A-B) Repræsentative billeder af væv farves med H & E og områder af multicellulære strukturer udvalgt til LMD. (A) Til venstre blev der valgt områder med aflange celler (røde) og kontrolområder (blå) til LMD. (B) Til højre blev der udvalgt områder med kollektiv invasion (rød) og kontrolområder (blå) til LMD. (C) Repræsentativ RNA-kvalitetskontrol for mikrodissekerede laserområder. Et samlet areal på 6,5 x 10⁶ μm² blev mikrodisseket. Analysen viser RNA-koncentration på 2.346 pg/μL og RNA Integrity Number (RIN): 6.8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for gliom heterogenitet og invasion, er af afgørende betydning for at afdække nye terapeutiske mål¹³. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret og optimeret metode til at analysere det molekylære landskab af gliom heterogenitet og invasion ved hjælp af laser capture microdissection (LMD) efterfulgt af transskriptionsanalyse.

Laser capture microdissection (LMD) kan bruges til at identificere forskellige områder eller enkelte celler i tumoren, hvilket giver en specifik prøve til yderligere at analysere det molekylære mønster opretholde den rumlige sammenhæng tumor¹⁴. Denne teknik er pålidelig og billig sammenlignet med andre metoder, der anvendes til at analysere den rumlige transkription i solide tumorer¹⁵. Vi analyserede gliom heterogenitet og invasion i gensplejsede musetumormodeller eller intrakranielle implantable modeller ved hjælp af LMD. Disse modeller opsummerede de vigtigste egenskaber ved humane gliomer, så studiet af gliom heterogenitet og invasion^10,12.

Opretholdelse af høj kvalitet tumorvæv morfologi og RNA integritet er en af begrænsningerne for LMD. For at forbedre vævmorfologien gennemgik vi mus med Tyrodes opløsning i 5 minutter, efterfulgt af 30% saccharose opløst i samme opløsning. Når hjernen var dissekeret, vi bevaret det i 30% saccharose opløst i RNase / DNase-fri vand natten over, eller indtil hjernen nåede bunden af opbevaringsbeholderen. Disse trin væsentligt forbedre morfologi af vævet og reduceret dannelsen af is-krystaller i vævet under kryo-konservering. Selv om humant gliomvæv ikke blev anvendt til denne protokol, kunne inkubation af humane prøver i 30% saccharoseopløsning natten over være en mulig metode til at forbedre kryosektioner morfologi. En anden mulig begrænsning for LMD er bevarelsen af RNA-integritet efter farvning⁸. Selv om andre forskerhold har udført lasermikrodissektion på gliomvæv efterfulgt af RNA-seq-analyse, illustrerer de ikke nogen RNA og/eller morfologi, og de kommenterer heller ikke morfologisk kvalitet eller særlige kontroller for gliomfrosne afsnit¹⁶. I denne protokol var nøjagtig morfologisk identifikation afgørende for at lasermikrodissekct præcise makrocellulære strukturer i gliomer. Vi observerede, at fastsættelse af gliomvæv med ethanolopløsning og farvning af det med 4% Cresyl violet og 0,5% eosin Y opløst i ethanol-vedligeholdt RNA-kvalitet og muliggjorde mikroskopisk identifikation af enkelte celler og flercellede strukturer. Vi har vist, at montering af gliomsektioner med monteringsopløsning er et kritisk trin, som forhindrer revner og revnedannelse i vævet. Bemærk venligst, at monteringsmediet skal fremstilles i vand, da brug af monteringsmediet opløst i ethanol vil resultere i dårlig vævmorfologi. Lasermikrodissektion skal udføres så hurtigt som muligt i et RNase-frit miljø. Vi anbefaler også at sektion op til 2,5 x 10⁶ μm² samlede tumor /væv område for at opnå passende mængder af RNA, både for RNA kvalitetskontrol og transkriptora analyse.

LMD gør det muligt at analysere de molekylære signalveje, der regulerer gliom heterogenitet og invasion. Denne analyse kunne afsløre nye potentielle mål for diagnose, prognose og fremtidig translationel udvikling i prækliniske gliommodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571