Laser Capture Microdissection av Glioma subregioner för rumslig och molekylär karakterisering av intratumoral heterogenitet, oncostreams och invasion

Summary

Laser microdissection (LMD) är en känslig och mycket reproducerbar teknik som kan användas för att avslöja vägar som medlar gliom heterogenitet och invasion. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för att isolera diskreta områden från gliomvävnad med laser LMD följt av transkriptomisk analys.

Abstract

Gliom är primära hjärntumörer som kännetecknas av deras invasivitet och heterogenitet. Specifika histologiska mönster såsom pseudopalisades, microvascular spridning, mesenchymal omvandling och nekros karakterisera histologiska heterogenitet av högvärdiga gliom. Vårt laboratorium har visat att förekomsten av höga tätheter av mesenkymala celler, som heter oncostreams, korrelerar med tumör malignitet. Vi har utvecklat ett unikt tillvägagångssätt för att förstå de mekanismer som ligger till grund för gliomas tillväxt och invasion. Här beskriver vi ett omfattande protokoll som använder laser fånga microdissection (LMD) och RNA sekvensering för att analysera differentiell mRNA uttryck för intra-tumoral heterogena multicellulära strukturer (dvs. mesenkymala områden eller områden av tumör invasion). Denna metod upprätthåller god vävnad histologi och RNA integritet. Perfusion, frysning, inbäddning, snittning och färgning optimerades för att bevara morfologi och få högkvalitativa laser microdissection prover. Resultaten visar att perfusion av gliombärande möss med 30% sackaros ger god morfologi och RNA-kvalitet. Dessutom, färgning tumör sektioner med 4% Cresyl violett och 0,5% eosin resulterar i god nukleära och cellulära färgning, samtidigt som RNA integritet. Den beskrivna metoden är känslig och mycket reproducerbar och det kan användas för att studera tumörmorfologi i olika tumörmodeller. Sammanfattningsvis beskriver vi en komplett metod för att utföra LMD som bevarar morfologi och RNA kvalitet för sekvensering att studera molekylära funktioner i heterogena multicellulära strukturer inom solida tumörer.

Introduction

Gliom är de mest aggressiva primära tumörerna i centrala nervsystemet. De är mycket invasiva och heterogena¹. Analys av cellulära och molekylära komponenter i tumören kommer att avslöja nya terapeutiska mål.

Bland olika metoder som för närvarande finns, laser fånga microdissection (LMD) av fryst hjärntumör vävnad är en kostnadseffektiv, tillförlitlig teknik som gör det möjligt att isolera diskreta anatomiska områden eller specifika cellpopulationer från tumörvävnader för att studera deras molekylärprofil^2,3. LMD möjliggör analys av mRNA genuttrycksprofiler för utvalda encelliga celler eller flercelliga strukturer^4,5. LMD kan användas för att få djupgående mekanistisk kunskap om de molekylära händelser som sker under tumörprogression. Förbättring av bearbetningen av tumörvävnader är nödvändig för att få optimal optisk upplösning av vävnadsmorfologi och RNA-kvalitet⁶. Även om paraformaldehyd fixering är det bästa alternativet för morfologiska analys, RNA kvalitet påverkas och försämras under dessa förhållanden, vilket resulterar i dålig RNA kvalitet för RNA-seq analys. Användningen av frysta vävnadssektioner undviker iskristallbildning, som kan bryta cellmembranen och producera hål i celler, och är fortfarande det bästa alternativet för RNA-Seq-analys⁷.

Här beskriver vi en optimerad avsnitt fixering och färgning metod för att bearbeta frysta mus hjärntumör vävnader för LMD. För att förhindra att iskristaller bildas i vävnaden perfunderade vi möss med en lösning på 30% sackaros. Denna lösning stör växelverkan mellan polarvattenmolekyler och förhindrar bildandet av iskristaller, bevara vävnadmorfologi. Vävnad färgning är nödvändigt att skilja och få specifik population av celler eller anatomiskt distinkta områden inom tumören. Det är viktigt att fixa och färga vävnaden med ofarliga färgämnen för att upprätthålla RNA integritet. Det har tidigare visats att färgning vävnad med hematoxylin / eosin (H & E) försämrar RNA integritet⁸. Vi fixade och färgade vävnaden av intresse med etanol, Cresyl violett 4% och eosin Y 0,5% lösningar. Cresyl violett är ett acidophilic färgämne som fläckar cellkärnan med en mörkblå färg. Eosin Y är ett basofilt färgämne som färgar grundläggande komponenter i cellerna, vilket ger en skillnad mellan cytoplasman och andra cellulära strukturer⁸. Båda färgämnena är lösliga i etanol och försämrar inte RNA-kvaliteten. För att undvika vävnadsskador och bibehålla en hög optisk upplösning av cellstrukturerna monterade vi vävnadssektionerna före LMD⁹.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här som använder försöksdjur har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Michigan.

OBS: Glioma neurospheres genereras från en GEMM eller stabila linjer kan användas för intrakraniell tumör engraftment hos möss¹⁰ och bearbetas för LMD och RNA sekvensering. Dessa celler utgörs av uttryckliga firefly luciferas och GFP proteiner, som kommer att utnyttjas ytterligare för tumör tillväxt analys och lokalisering.

1. Generering av intrakraniell mus gliom modell från neurosfärer som härrör från genetiskt modifierade gliom modeller

1. Om du vill generera en primär odling av neurosfärceller från en gemm-modell (genetically engineered mouse) använder du det protokoll som beskrevs tidigare^10,11.
2. Förbered neurosfärodlingsmedium enligt beskrivningen: 500 ml Dulbeccos Modifierade Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) kompletterat med 10 ml 50x B-27 och 5 ml 100x N-2 neuronal kulturtillskott, 5 ml 100x antibiotika-antimykotiska och 1 ml Normocin. Innan plätering av neurosfärerna, tillsätt 20 ng/mL mänskliga rekombinanta EGF och FGF till odlingsmediet.
3. Kultur gliom neurospheres i en vävnad kultur inkubator vid 37 °C och 5% CO₂ för 2-3 dagar före intrakraniell tumör engraftment.
4. På dagen för operationen, samla gliomneurosfärerna och snurra dem på 550 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
5. För att separera neurosfärerna, återsuspend cellpellet i 1 ml cellavlossning lösning och inkubera vid 37 °C och 5% CO₂ för 2-4 min. Efter inkubationstiden, pipettna neurospheres upp och ner med en 1 mL micropipette för att säkerställa en enda cell suspension.
6. Inaktivera lösningen för avlossning av cellen genom att späda ut neurosfärfjädringen med 10 ml otillförmlat DMEM/F12-medium. Snurra neurosfärerna vid 550 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten.
7. Resuspend cell pelleten i 100 μL DMEM/F12 media utan kosttillskott. Gör en 1:50 utspädning av cellfjädringen och tillsätt sedan 50 μL Trypan Blue för att räkna livskraftiga celler. Använd följande formel för att bestämma cellernas koncentration:
   celler/ml = [(((-celler som räknas per kvadrat) / # av kvadrater räknas) x 50 x 10.000 celler/ml]
8. Efter bestämning av antalet celler, för att uppnå en målkoncentration på 30 000 celler/μl i 100 μl volym, snurra ner neuosfärerna och återsuspend dem i lämplig volym av DMEM/F12 som inte innehåller några tillskott.
9. Placera neurosfärerna i ett förmärkt 0,6 ml-rör på is.
10. Förbered arbetslösningar av anestesi, smärtstillande, och anestesi återföring före implantation: För ketamin/dexmedetomidinanestesi, tillsätt 0,6 ml 100 mg/ml ketaminhydroklorid och 0,8 ml 0,5 mg/ml dexmedetomidydiumdroklorid för att sterila 8,6 ml 0,9% NaCl som innehåller vik. För buprenorfin smärtstillande, tillsätt 1 ml 0,3 mg/ml buprenorfin till 9 ml 0,9% NaCl innehållande injektionsflaska. För atipamezole anestesi återföring, tillsätt 1 ml 5 mg/ml atipamezole till 9 ml 0,9% NaCl innehållande injektionsflaska.
11. Använd 6-8 veckor gamla C57BL/6J kvinnliga möss för intrakraniell tumör engraftment.
12. I ett rum som är godkänt för gnagare överlevnad kirurgi, inrätta sterila leveranser för intrakraniell tumör engraftment. Utför operationer på en gnagare stereotaxisk ram utrustad med en steriliserad 10 μL Hamilton spruta med en avtagbar 33G nål. Använd en pärla autoklav för att sterilisera verktyg mellan operationer.
13. Söva möss med en enda intraperitoneal (i.p.) injektion av bedövningsmedel lösning beredd i steg 1.11 (ketamin:75.0 mg/kg och dexmedetomidine:0.5 mg/kg). Ungefär, en 250 μL volym av bedövningslösningen kommer att levereras till en mus som väger 20 g. Se till att musen inte svarar på pedalreflex innan du fortsätter.
14. När musen är i ett djupt sövt tillstånd, applicera sterila petrolatum oftalmiskt smörjmedel i ögonen för att förhindra torkning. Raka pälsen på muskraniet. Applicera 10% povidone-jod topikal lösning på det rakade området för att desinficera.
15. Säkra musens skalle i en stereotaktisk ram. Först försiktigt öppna munnen med pincett och försiktigt dra tungan och flytta den till ena sidan av munnen för att förhindra kvävning. Håll munnen öppen med pincetten och placera de övre framtänderna i tandstångens nyckelhål på den stereotaktiska ramen.
16. Håll mushuvudet i öronen, placera öronstängerna mot de postorbitala benen och säkra dem. Se till att musens kranium är i nivå med den kirurgiska bordsskivan. Säkra öronstängerna försiktigt utan att trycka mot skallen. Därefter försiktigt säkra nosstången.
17. Med hjälp av en storlek 15 skalpell blad, gör ett snitt längs mushuvudet, utsätta kraniet. Dra tillbaka huden vid snittstället med Colibri-upprullningsdon. Använd en steril applikator för att avlägsna all pericranial vävnad.
18. Identifiera bregma och sänk nålen på Hamilton sprutan direkt över den. Använd ramen, placera nålen 1 mm främre av bregma och 1,5 mm i sidled. Med hjälp av en 26G nål, markera denna plats genom att göra mål i kraniet.
19. Använd en sladdlös borrmaskin utrustad med en 0,45 mm borr för att skapa ett burrhål vid målplatsen. Borra tills dura mater når den underliggande duramatern. Extrahera försiktigt det återstående benet i burrhålet med en 26G-nål.
20. Med hjälp av en pipett, homogenisera cellerna noggrant och dra upp 7 μL av neurosfärfjädringen i sprutan. För att säkerställa att sprutan fungerar som den ska, fördela 1 μl av suspensionen på en 70% alkoholblödad dyna.
21. Sänk nålen till dura mater. Sänk sprutan 3,5 mm ventralt och dra tillbaka 0,5 mm. Detta kommer att skapa en 0,5 mm utrymme i hjärnan för neurosfärerna att deponera när de injiceras.
22. Låt nålen vara på plats i 2 minuter för tryckjämvikt. Leverera långsamt och smidigt 1 μL av cellerna under 1 min. Låt cellerna bosätta sig i 6 min. Ta bort sprutan långsamt och smidigt från hjärnan under 2 min.
23. Tvätta kraniets yta tre gånger med steril koksaltlösning. Fördela överflödiga celler i sprutan på en 70% alkohol pad, och torka nålen ren med ytterligare 70% alkohol pad. Skölj sprutan med steril PBS för att undvika att nålen täpps igen.
24. Ta bort upprullningsdonen och ta försiktigt ut musen ur den stereotaktiska ramen. Stäng snittet med 3-0 nylon suturer, pincett, och en nål förare.
25. Administrera atipamezole (1,0 mg/kg), cirka 100 μL för en 20 g mus. Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg subkutant), cirka 70 μL för en 20 g mus. Placera postkirurgiska möss i en ren återhämtning bur och övervaka dem tills alert och aktiv.

2. Djurperfusion och hjärnans bevarande

1. För att övervaka tumörprogression, bestämma in vivo bioluminescens med hjälp av en in vivo bildbehandling system tills djur visar tecken på tumör börda. Avliva möss när de når en signal mellan 10⁶ till 10⁷ foton/s.
2. Bedöva möss som uppvisar tecken på tumörbörda med intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin (75,0 mg/kg) och dexmedetomidin (0,5 mg/kg) lösning. Leverera ca 250 μL till en mus som väger 20 g. Se sedan till att musen inte svarar på pedalreflexen.
3. Med hjälp av pincett, håll huden ovanför bukhinnan hålighet, och med hjälp av ett stort par dissekering sax göra en "Y" snitt genom att tränga in i peritoneal väggen, punktera membranet, och sedan klippa bröstkorgen.
4. Sätt in en trubbig 20G kanyl i den vänstra ventrikeln i musens hjärta. Sedan klipp höger atrium i hjärtat för att möjliggöra exsanguination.
5. Tillåt syresatt Tyrodes lösning (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glukos, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) att flöda genom muscirkulationssystemet tills levern och lungorna har helt rensat på grund av avlägsnande av blod (~ 5 min).
6. Fortsätt att parfymera djuret med 30% sackaroslösning upplöst i Tyrodes lösning i ytterligare 15 minuter. För att utvärdera framgången för perfusion, bekräfta att nacke, svans och ben är styva efter 30% sackaros cirkulation.
7. Med hjälp av en liten dissekering sax, skär hårbotten vid mittlinjen. Börja vid occipital ben och arbetar framåt mot nosen. Detta kommer att avslöja kraniet.
8. Med hjälp av ett par rongeurs, bryta igenom kraniet börjar vid occipital ben och fortsätta framåt för att helt exponera ytorna i hjärnan. Vrid sedan huvudet åt sidan upp och dissekera nerverna vid basen av hjärnan för att frigöra den från kraniet.
9. Förbered 30% sackaroslösning med RNase fritt vatten och filtrera den genom ett 40 μm nylonnätfilter för att minska RNA-nedbrytningen.
10. För att maximera sackaroslösningens infiltration, placera de dissekerade hjärnorna i 30% sackaroslösning och förvara dem vid 4 °C över natten. Innan ytterligare bearbetning se till att hjärnan når botten av rören som innehåller sackaroslösningen.

3. Kryobevarande av hjärnor som hyser gliomtumörer

1. Innan cryo bevara hjärnorna, förbereda en burk fylld med kall isopentan/2-metylbutan och placera burken i en behållare fylld med flytande kväve. Låt lösningsmedlet svalna.
2. Ta bort hjärnan från 30% sackaroslösning och blot det torrt på ett filterpapper.
3. Märk kryomolden med en permanent markör. Tillsätt försiktigt ca 5 ml OKT (optimal skärtemperaturförening) i mitten av kryomolden och undvik luftbubblor.
4. Placera hjärnan i kryomåld som innehåller OCT i önskad orientering. Fyll formen med OCT tills hjärnan är helt nedsänkt. Använd rena pincett, placera snabbt cryomold med OCT och hjärnan i kylan isopentane/2-metylbutan.
5. När OCT stelnar (~ 30-40 s), ta bort cryomold med hjärnan och placera den i torris. Lämna inte formen som innehåller hjärnan i 2-metylbutan förbi 2 min eftersom detta kan orsaka sprickor i fast OKt. Linda kryomolden med hjärnan i aluminiumfolie och förvara den på -80 °C.

4. Snittning frysta hjärntumörvävnader

1. Märk 2 μm polyetentesmetytalat (PEN) diabilder med provinformationen. Vävnadssektioner placeras direkt på dessa bilder efter snittning.
2. Ställ in temperaturen på kryostatkammaren mellan -20 till -24 °C. Innan snittning, placera provblocket i kryostatkammaren och låt det balansera till temperaturen i kammaren i 30-60 min.
3. Rengör kryostatkammaren och knivhållaren med 100% etanol och spraya borstarna som ska användas med RNase rengöringslösning. Arbeta inuti kryostatkammaren, ta bort formen och fäst OCT-blocket som innehåller hjärnan på kryostatprovskivan med OCT. Placera blocket i diskhållaren och rikta in blocket med knivbladet.
4. Montera ett engångsblad i snitthållaren.
5. Dela upp hjärnan med 10 μm tjocklek. Se till att det inte finns några ränder eller replinjer i vävnaden. Med hjälp av en pensel, försiktigt platta och uncurl vävnaden på skärytan.
6. Montera försiktigt vävnaden som innehåller hjärnsektionerna på RNase fria PEN glasglas diabilder. Vänd de positivt laddade glasrutschbanorna med fingrarna i vävnadens riktning och tryck smidigt ner glasbilden mot vävnadsdelen.
   OBS: Temperaturen på händerna hjälper vävnaden att fästa på glaset.
7. När du har monterat hjärnsektionerna på bilderna, förvara rutorna i en låda inuti kryostatkammaren och förvara dem sedan vid -80 °C. Förvara aldrig rutschbanorna i rumstemperatur.
   OBS: Vikning av vävnaden och rivning är vanliga. För korrekt bakre analys är det viktigt att minimera dessa artefakter.

5. Fixering och färgning av kryobevarandes hjärnvävnadssektioner

1. För att bevara RNA-integriteten, rengör alla instrument som ska användas med RNase rengöringslösning. Fortsätt med fixerings- och färgningsprotokollet inuti en rökhuva.
2. Förbered de beskrivna fixativa lösningarna i rena RNase-fria 50 ml-rör. Gör alla lösningar med RNase fritt vatten på fläckens dag.
3. Samma dag lasermikrodissection kommer att utföras, förbereda 100%, 95%, 70% och 50% etanol lösningar. Förvara lösningarna i tätt tillslutna rör i rumstemperatur.
4. Förbered 4% Cresyl violett och 0,5% eosin Y i 75% etanollösning. Vortex lösningen kraftigt i 1 min och filtrera dem genom en 0,45 μm nylonfilter för att eliminera spår av oupplöst pulver.
5. Placera vävnadsrutschbanorna i en behållare med 95 % etanol för 30 s. Överför diabilder till röret som innehåller 75 % etanol. lämna bilderna där i 30 s.
6. Överför rutschkanor till 50% etanol och lämna dem där i 25 s. Vid denna punkt kommer OCT att upplösas. Överför bilden till 4% Cresyl violett lösning för 20 s, och sedan överföra till 0,5% eosin Y lösning för 5 s.
7. Ta ut bilden ur färglösningen och blot bilden torr med ett filterpapper. Placera sedan rutschbanorna i 50% etanol för 25 s. Överför rutschbanorna till 75% etanol för 25 s. Överför rutschbanorna till 95% etanol för 30 s. Överför rutschbanorna till 100% etanol för 60 s.
8. Skölj bilden med xylen. Överför dem till en behållare med xylen och vänta 3 min.
9. Förbered monteringsmedium (t.ex. Pinpoint-gummi) i RNase-fritt vatten. För att montera mushjärnsnitt, späd monteringsmediet i RNase-fritt vatten i ett förhållande av 1:10.
10. Torka rutschbanorna på en RNase-fri yta i rumstemperatur i 10 s. Innan xylen torkar, fortsätt att montera bilderna med vävnadssektionerna.
11. Dispergera försiktigt monteringslösningen ovanpå vävnaden på bilden med en steril och RNase-fri tunn pensel. Vänta 10-20 s, och sedan omedelbart överföra vävnadsrutschbanor till mikroskopmikringsplattformen.
    OBS: Förhållandet mellan monteringsmedium och RNase-fritt vatten som används för montering varierar beroende på vilken vävnad av intresse. Monteringsmediet/vattenförhållandet bevarar gliomvävnadsmorfologi för lasermikrodissection utan att påverka RNA-integriteten.

6. Laser fånga microdissection

OBS: En laser fånga microdissection mikroskop måste användas för att laser mikrodissect specifika områden av intresse inom tumörvävnaden. För att minimera tiden för vävnadslasermidissection, har LMD mikroskop beredd före fixering och färgning.

1. För att starta systemet, slå först på grenuttaget, följt av att slå på lasern. Slå sedan på mikroskopstyrenheten och datorn. Starta LMD-programvaran.
2. Under Mikroskopkontrollväljer du 10x förstoring. Under Laserkontroll, ställ in laserparametrarna för vävnadsdissekering. Ställ in en laserfrekvens på 120 Hz för bästa skärresultat. Ställ alltid in laserströmmen på 100 %.
3. För noggrann lasermikrodissection ställer du in hastigheten på 10 och en bländare inställning på 2,0-10,0 μm. Ställ in strömmen på 53. Om du har lasereffekten vid en högre inställning kan det leda till glasetsning.
4. Ladda vävnadssamlaren som fångar vävnaden efter dissekering. Klicka på den andra avlastningsknappen. Ta bort den tomma uppsamlaren och placera DNase/RNase fritt 0,5 ml PCR-rör med platt huvud som innehåller 30 μl lysbuffert i uppsamlaren. Placera tillbaka insamlaren i maskinen och klicka på Fortsätt på programvaran för att fortsätta.
5. Lasta det bearbetade (fasta och färgade) preparatet på mikroskopet. Klicka först på ta bort på LMD-programvaran. Montera sedan provet på glidhållaren och placera bildhållaren på scenen. Klicka på Fortsätt på programvaran för att fortsätta.
6. Under Fönstret Klipp ut former väljer du Rita + Klipp. Använd mikroskopkontrollerna för att hitta intresseområdet. Rita intresseregionen (ROI) och välj ett destinationsinsamlarerör. Det är möjligt att rita flera ROIs till mikro dissekera olika områden från en enda bild samtidigt.
7. Klicka på Start Cut för att gå vidare till vävnad mikro dissekering. Efter snittning av de områden av intresse ta bort uppsamlare rören från hållaren och placera rören på torris. Överför RNA-vävnadsproverna som samlats in till -80 °C för långtidsförvaring.

7. RNA-isolering av mikrodissekerad gliomvävnad

1. För RNA-extraktion från LMD använd en RNA-isoleringssats som är optimerad för små prover och låg RNA-kapacitet (se Tabell över material). Följ tillverkningsanvisningarna. Utför alla isoleringssteg vid rumstemperatur (25 °C). För att bibehålla RNA-kvaliteten, arbeta snabbt. Förbered alla lösningar som anges av tillverkaren.
2. Justera provvolymen till 350 μL med lysbuffert med 1% β-merkaptoetanol. Vortex provet för 40 s för att minska provviskositeten och öka RNA elueringsspinnkolonnens effektivitet.
3. Överför hela provet till en gDNA eliminator-spinnkolonn placerad i ett 2 ml-uppsamlingsrör. Centrifugera röret för 30 s vid 8000 x g. Spara genom flödet och se till att ingen vätska finns kvar på kolonnen efter centrifugering.
4. Tillsätt 350 μL 70% etanol till genomströmningen och blanda väl genom pipettering upp och ner. Överför provet till en RNA elueringsspinnekolonn placerad i ett 2 ml-uppsamlingsrör. Stäng locket försiktigt och centrifugera i 15 s vid 8 000 x g. Ignorera flödet och spara kolumnen.
5. Tillsätt 700 μl RNA-tvättbuffert 1 (20 % etanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) till RNA eluionsspinn column. Stäng locket försiktigt och centrifugera i 15 s vid 8 000 x g för att tvätta spinnkolonnmembranet. Kasta flödet genom.
6. Efter centrifugering, ta försiktigt bort RNA elueringsspinnen från uppsamlingsröret så att kolonnen inte kommer i kontakt med flödet.
7. Tillsätt 500 μL av den andra RNA-tvättbufferten (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) till spinnkolonnen. Stäng locket på kolonnen och snurra 8 000 x g i 20 s för att tvätta kolonnmembranet. Kassera flödet.
8. För att tvätta RNA elueringskolonn, tillsätt 500 μL 80% etanol, stäng locket på kolonnen och centrifugen vid 8000 x g i 2 min. Kasta ut rören med elueringslösningen.
9. Använd ett nytt uppsamlingsrör, öppna locket på spinnkolonnen och centrifugera på 8000 x g i 5 min för att torka kolonnen. Kassera elueringsröret.
10. Placera RNA elueringsspinnen i ett nytt 1,5 ml-uppsamlingsrör. Tillsätt 12 μL RNase-fritt vatten som värms upp vid 37 °C direkt i mitten av spinnkolonnmembranet. Vänta i 4 min och centrifug i 1 min i full fart för att elute RNA.

8. RNA-kvalitetskontroll, biblioteksberedning och RNA-Seq-analys

1. Efter RNA-extraktion och rening, förstärka RNA och skapa ett cDNA-bibliotek med hjälp av ett speciellt kit som lämpar sig för RNA-isolering vid pico-molarkoncentrationer enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell över material). Följ tillverkarens anvisningar. Rengör arbetsstationen för att undvika kontaminering med andra PCR-produkter och nukleas nedbrytning av prover.
2. Om RNA har ett RIN-värde som är större än 4, vilket innebär att RNA är av god kvalitet eller endast delvis försämras, fortsätt med fragmenteringssteget. Förbered alla föremål på is.
3. Skapa en huvudmix enligt vad som anges (tabell 1). Skapa reaktionsblandning i ett nukleafritt tunnväggsrör på 0,2 ml PCR. Inkubera rören vid 94 °C i en termisk cykel med varma lock. Fragmentering inkubationstiden beror på kvaliteten på RNA. RIN ≥ 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Efter inkubationen placerar du rören på ett PCR-kylställ som tidigare kyldes vid -20 °C och låt det sitta i 2 min.
5. För varje rör av RNA-prov, bered första strängen syntes reaktion master mix (tabell 2). Inkubera rören i en termisk cykelturgörare med varma lock under de förhållanden som beskrivs i tabell 3. cDNA-produkter kan frysas vid -20 °C tills i två veckor innan de fortsätter till nästa steg.
6. Skapa PCR-huvudmixen enligt tabell 4. Placera rören i en termisk cykelcykel med varmt lock och kör PCR-reaktionen under de inställningar som anges i tabell 5.
7. Låt pärlorna, som kommer att användas för att rena DNA, värmas upp till rumstemperatur. När du har värmts, tillsätt 40 μL av pärlorna till varje prov. Vortex rören att blanda och snurra ner kort för att samla vätska längst ner i röret. Låt rören ruva i rumstemperatur i 8 min så att DNA kan binda till pärlorna.
8. Placera rören på en magnetisk separationsanordning och låt sitta i ca 5 min, eller tills lösningen blir helt klar. Håll rören på separationsanordningen, använd en pipett för att försiktigt ta bort supernatanten utan att störa pärlorna.
9. Om du håller rören på separationsanordningen, tillsätt 200 μL nygjord 80 % etanol till pärlorna för att tvätta utan att störa pärlorna. Vänta i 30 s innan du tar bort 80% etanol. Upprepa det här steget.
10. Snurra ner rören och placera rören på separationsanordningen. Ta bort eventuella rester 80% etanol utan att störa pärlorna.
11. Låt rören lufttorka med locken öppna i 5 min. Låt den inte sitta längre eftersom pärlorna torkar över.
12. Om du håller rören på separationsanordningen, tillsätt 52 μl nukleasfritt vatten för att täcka pärlorna. Ta bort rören från separationsanordningen och pipetten uppåt tills alla pärlor har återsuspenderats. Inkubera vid 5 min vid rumstemperatur.
13. Placera rören tillbaka på separationsanordningen tills lösningen blir klar, ca 1 min. Överför 50 μL av den resulterande supernatanten till brunnarna på en 8-brunnsremsa. Tillsätt 40 μl nya pärlor till varje prov. Vortex grundligt att blanda. Låt pärlorna bindas till DNA genom att ruva i rumstemperatur i 8 min.
14. Under denna inkubationstid börjar du tina upp de komponenter som ska användas för alla rRNA som finns i proverna. När tinade, placera dem på is. Också, förvärm en termisk cycler till 72 °C.
15. Placera proverna på den magnetiska separationsanordningen tills lösningen klarnar (ca 5 min). Aliquot 1,5 μL sonder per prov till ett kylt PCR-rör. Placera röret i den förvärmda termiska cyclern under inställningarna 72 °C i 2 min och 4 °C.
16. Håll provrören i den magnetiska separationsanordningen, ta bort supernatanten med en pipet utan att störa pärlorna. Tillsätt sedan 200 μL nygjord 80% etanol till pärlorna för att tvätta utan att störa pärlorna. Vänta 30 s innan du tar bort 80% etanol. Upprepa det här steget.
17. Snurra ner rören och placera rören på separationsanordningen. Ta bort eventuella rester 80% etanol utan att störa pärlorna. Låt rören lufttorka med locken öppna i 2 min. Låt inte sitta längre eftersom pärlorna kommer över torr.
18. Förbered huvudblandningen för alla prover genom att kombinera följande komponenter i den ordning som presenteras (tabell 6).
19. Blanda huvudblandningen genom att virvla och tillsätt 22 μL av blandningen till de torkade pärlorna i varje prov och blanda noggrant för att återsuspendera. Låt det ruva i rumstemperatur i 5 min.
20. Snurra ner rören och placera dem på den magnetiska separationsanordningen i 1 minut eller tills proverna blir klara. Överför 20 μL av supernatanten, utan att störa pärlorna till nya PCR-rör. Placera rören i en förvärmd värmecykel under inställningarna i tabell 7.
21. Förbered en PCR-master mix tillräckligt för reaktioner för varje prov. Lägg till följande komponenter i huvudmixen i den angivna tabell 8. Tillsätt 80 μl av PCR-huvudblandningen till vart och ett av provrören från steg 8.20 och placera i termiskcykeln vid följande inställningar(tabell 9).
22. Låt pärlor, som kommer att användas för att rena DNA, för att värma till rumstemperatur. När du har värmts, tillsätt 100 μL av pärlorna till varje prov. Låt rören ruva i rumstemperatur i 8 min så att DNA kan binda till pärlorna.
23. Placera rören på en magnetisk separationsanordning och låt sitta i ca 5 min, eller tills lösningen blir helt klar.
24. Håll rören på separationsanordningen, använd en pipett för att försiktigt ta bort supernatanten utan att störa pärlorna.
25. Om du håller rören på separationsanordningen, tillsätt 200 μL nygjord 80 % etanol till pärlorna för att tvätta utan att störa pärlorna. Vänta i 30 s innan du tar bort 80% etanol. Upprepa det här steget.
26. Kort, snurra ner rören och placera rören tillbaka på separationsanordningen. Ta bort eventuella rester 80% etanol utan att störa pärlorna.
27. Låt rören lufttorka med locken öppna i 5 min. Låt inte sitta längre eftersom pärlorna kommer att överdetor. Pipetter 20 μL Tris Buffer till den torkade pelleten. Ta bort röret från separationsanordningen och blanda noggrant med en pipet för att återsuspend pärlorna. Låt det ruva i rumstemperatur i 5 min.
28. Placera rören på separationsanordningen i 2 min, eller tills lösningen blir klar. Skaffa supernatanten och överför den till nya rör. Förvara sedan den insamlade lösningen vid -20 °C.
29. Kontrollera de slutliga biblioteken behovet av kvalitet och kvantitet kontroll. Poola exemplen, grupperade på och sekvens, som parade 50 nt läser, enligt tillverkarens rekommenderade protokoll.

Representative Results

Vårt laboratorium har genererat en genetiskt modifierad mus modeller (GEMMs) med hjälp av törnrosa transposase system(figur 1A). Detta system innehåller specifika genetiska förändringar i arvsmassan hos neurala stamceller hos neonatala möss. Dessa förändrade stamfaderceller bildar endogena gliom tumörer. Plasmid sekvenser som används för att generera tumörer var: (1) pT2C-LucPGK-SB100X för Törnrosa transposon & luciferas uttryck, (2) pT2-NRASSV12 för NRAS uttryck, (3) pT2-shp53-GFP4 för p53 knock-down och GFP protein uttryck, och (4) pT2-shATRx-GFP4 för ATRX knock-down. Plasmider injicerades i den laterala ventrikeln hos 1-dagars gamla neonatala valpar enligt beskrivningen tidigare¹¹. Plasmid upptag och tumör bildas övervakades via in vivo bioluminescens imaging system. När tumörbärande möss visas tecken på tumör börda, de offrades. Tumörer användes antingen för att generera neurosfärkulturer eller direkt kryobevarad för LMD-bearbetning (figur 1A).

Cellkulturer som startades från GEMM användes för att generera en översättbar gliommodell (figur 1B). Glioma neurospheres härrör från GEMM tumörer odlades och implanteras intrakraniellt i striatum av immun-kompetenta möss. Encelliga suspensioner som erhållits från neurosfärer kultur användes för att generera gliom tumörer genom intrakraniell implantation som beskrivs tidigare av vårt laboratorium^10,,11,12. Denna metod gör det möjligt att noggrant kvantifiera antalet celler som ska implanteras per mus (30 000 celler/1 μl/mus). Detta protokoll tillåter reproducerbarhet av resultaten mellan olika experimentella implantationer. Implantation av neurospheres kan dock vara ett alternativ för att generera mus glioma tumörer och efterföljande LMD och RNA-Seq analys. Denna metod anses dock vara mer exakt. Tumör progression övervakades av in vivo biolumineescence spektrum imaging system. Möss som uppvisar tecken på tumörbörda var transkarialt perfunderade och hjärnan var kryobevarad för LMD-bearbetning (figur 1C).

Vävnad avsnitt var laser microdissected att karakterisera transkriptom av flercelliga strukturer inom gliom. Den perfusion, frysning och inbäddning förfaranden som beskrivs var optimerade för att bevara vävnad morfologi och få god kvalitet RNA efter laser microdissection. Olika perfusionsmetoder utvärderades för att förvärva vävnader med överlägsen morfologi och RNA-integritet (tabell 10). För att dissekera intresseområdena var det nödvändigt att färga vävnaden med ofarliga färgämnen för RNA (figur 2). Vi observerade att perfusing tumörbärande mus med Tyrodes lösning i 5 min, och sedan 30% sackaros i 15 min, följt av övernattning lagring av den dissekerade hjärnan i 30% sackaros bevarar morfologi och RNA integritet tumörvävnad (figur 3D). Perfusion med 30% sackaroslösning förhindrade iskristallbildning i vävnaden. Även om paraformaldehydvävnad fixering resulterade i hög kvalitet vävnad morfologi, RNA integritet påverkades negativt (figur 3B). Andra metoder såsom Tyrodes lösning för 5 min eller Tyroddes lösning för 5 min + 30% sackaroslösning i 15 min (figur 3A och C) påverkade inte RNA-kvaliteten. Under dessa förhållanden, hjärnor bevarades inte i 30% sackaros över natten; observerade vi minskad upplösning i vävnad morfologi.

Vi utförde olika färgningstekniker följt av RNA integritet kvalitetskontroll analys. Vi konstaterade att 4% Cresyl violett och 0,5% eosin Y färgning var tillräcklig för att identifiera glioma flercelliga strukturer och upprätthålla RNA integritet. Cresyl violett är ett acidophilic färgämne som fläckar kärnan i celler med en mörkblå färg. Eosin Y är ett basofofofiskt färgämne som fläckar grundläggande komponenter i cellerna.

Vi konstaterade att om vävnaden inte var monterad med monteringsmedium, blev sektionerna uttorkade och morfologin försämrades (figur 4A). För att upprätthålla hög kvalitet vävnad morfologi, monterade vi vävnaden med monteringsmedium. Vi observerade att 15% monteringsmedium upplöst i vatten (30 μL i 200 μL vatten) upprätthålls högkvalitativ vävnadmorfologi (figur 4B).

I figur 5Avisas områden med gliom heterogenitet. Bilder förvärvades med hjälp av en laser fånga microdissection mikroskop före dissekering. Röda linjer skildrar områden med rikliga mesenkymala celler (långsträckta celler). Blå linjer visar områden utan mesenkymala celler (rundade celler) (Figur 5A, mellanbild). Figur 5B visar bilder av lasermikrodissekerade tumörområden (röda linjer) och normala hjärnvävnadsområden (blå linjer). Roi-urval görs för att dissekera intresseområden (figur 5A och B, lägre bilder). Vi kan i dessa bilder observera framgången i dissekeringen av de utvalda områdena.

RNA-extraktion utfördes med hjälp av ett kommersiellt kit. Det fastställdes att en total yta av dissekerad vävnad mellan 2,5 x 10⁶ - 7 x 10^{μm 2} krävdes för mRNA utvinning och cDNA bibliotek förberedelse för efterföljande RNA sekvensering. RNA kvalitetskontroll bestäms en RIN mellan 6 till 7 i gliom vävnad efter laser microdissection. En RIN av 6 bestämdes vara lämplig för cDNA bibliotek förberedelse. Efter RNA utvinning, ett kit för RNA isolering vid picomolar koncentrationer användes för att generera en cDNA bibliotek lämplig för nästa generations sekvensering.

0,25 ng - 10 ng (1-8 μL) RNA

4 μL av 5x förstasträngsbufferten

1 μl av Oligos Mix V2

Nukleasfritt vatten till slutvolymen på 13 μL

Tabell 1: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Master Mix förberedelse för steg 8.3.

4,5 μl blandning V2

0,5 μL RNase-hämmare

2 μl omvänd transkriptas

Slutlig volym på 7 μL

Tillsätt 7 μL till RNA-provröret

Tabell 2: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Master Mix förberedelse för steg 8.5.

42 °C för 90 min

70 °C i 10 min

4 °C håll

Tabell 3: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Termohjulsförhållanden för steg 8.5.

2 μl nukleasfritt vatten

25 μL 2x PCR-buffert

1 μl DNA-polymeras för varje reaktion

Blanda försiktigt och snurra ner en kort stund

Tillsätt 28 μl av huvudblandningen till vart och ett av provrören

Tillsätt 1 μl av varje 5' och 3 'primer till varje rör

Blanda reaktionerna försiktigt och snurra ner en kort stund

Tabell 4: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Master Mix förberedelse för steg 8.6.

1 cykel

94 °C i 1 min

5 cykler

98 °C för 15 s

55 °C för 15 s

68 °C för 30 s

1 cykel

68 °C i 2 min, 4 °C håll

Tabell 5: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Termohjulsförhållanden för steg 8.6.

16,8 μl nukleasfritt vatten

2,2 μL 10x R-buffert

1,5 μL R v2

1,5 μL R-sonder v2

Tabell 6: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Master Mix förberedelse för steg 8.18.

37 °C 60 min

72 °C 10 min

4 °C håll

Tabell 7: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Termohjulsförhållanden för steg 8.20.

26 μL nukleasfritt vatten

50 μl CB PCR-buffert

2 μl PCR2 Primers v2

2 μl DNA-polymeras

Tabell 8: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Master Mix förberedelse för steg 8.21.

1 cykel

94 °C i 1 min

X cykler

98 °C för 15 s

55 °C för 15 s

68 °C för 30 s

1 cykel

68 °C i 2 min, 4 °C håll

Tabell 9: RNA-kvalitetskontroll och förberedelse av bibliotek: Termohjulsförhållanden för steg 8.21.

	Steg 1	Steg 2	Steg 3
Metod 1	Tyrodes 15'	--	--
Metod 2	Tyrodes 5'	Sackaros 30% 15"	--
Metod 3	Tyrodes 5'	4% PFA 10"	--
Metod 4	Tyrodes 5'	30% Sackaros 15"	Hjärnan i 30% sackaros över natten

Tabell 10: Metoder för olika perfusionsmetoder.

Figur 1: Musgliommodeller som används för lasermikrodissection. (A)Törnrosa GEMM används för att utveckla de novo glioma. Bilder visar tumör progression: (i) plasmid injektion i den laterala ventrikeln hos nyfödda, (ii) tumör börda. (B)Generering av transplanterbar gliom modell med gliom cell kulturer. Neurosfärceller odlade från GEMM implanteras intrakraniellt i striatum. (C) Skildring av cryo-snittning av hjärnan inbäddade i koronal orientering efter perfusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematisk representation av den metod som används för att färga kryobevarad vävnadssektioner med Cresyl violett och Eosin. Diabilder som användes för färgning hanterades med verktyg som rengjorts med RNase-fritt vatten. Alla lösningar har utarbetats med RNase / DNase fritt vatten på dagen för färgning. Cresyl violett fläckar kärnor violett och eosin Y fläckar cytoplasma rosa. Färgämnen upplöstes i 70% etanol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Jämförelse av olika perfusion metoder för att bevara vävnad morfologi och RNA integritet. H&E-bilder representerar jämförande morfologi av hjärnvävnad som utsatts för perfusion under olika metoder: (A) Tyrondes lösning i 15 min,(B)Tyrondes lösning i 5 min, 4% PFA i 10 min, (C)Tyrondes lösning i 5 min, 30% sackaros i 15 min och (D) Tyrondes lösning för 5 min, 30% sackaros i 15 min med övernattningsfördjupning i 30% sackaros. RNA-kvalitetsbedömning visas för varje perfusionsmetod. Tomter visar 18s och 28s rRNA toppar och den ursprungliga markör topp. Förhållandet mellan 18s och 28s rRNA används för att bestämma RNA-kvalitet. En gelbild av RNA-fragmenten visas till höger om tomterna. RNA-kvalitet bedömdes med rin-värdena. RNA-kvaliteten var hög i metoderna A, C och D. Vävnadmorfologi var överlägsen i metoderna C och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Representativa bilder av monterad och icke-monterad gliomvävnad. (A)Representativa bilder av vävnad som färgats med H&E. Denna vävnad lämnades omonterad och blev uttorkad visar dålig morfologi med pauser i vävnaden. (B)Representativa bilder av vävnad som färgats med H&E och monterade med monteringsmedium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Representativa bilder av gliomvävnad som används för lasermikrodissection. (A-B) Representativa bilder av vävnad färgas med H & E och områden av flercelliga strukturer som valts ut för LMD. (A) Till vänster valdes områden med långsträckta celler (röda) och kontrollområden (blå) för LMD. (B)Till höger valdes områden med kollektiv invasion (röd) och kontrollområden (blå) ut för LMD. C)Representativ RNA-kvalitetskontroll för lasermikrodissecterade områden. En total yta på 6,5 x 10^{μm 2} var mikrodissected. Analysen visar RNA-koncentrationen på 2 346 pg/μL och RNA Integrity Number (RIN): 6.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Förstå de molekylära mekanismerna bakom gliom heterogenitet och invasion är av avgörande betydelse för att avslöja nya terapeutiska mål¹³. I detta manuskript beskriver vi en detaljerad och optimerad metod för att analysera det molekylära landskapet av gliom heterogenitet och invasion med hjälp av laser capture microdissection (LMD) följt av transkriptomanalys.

Laseravskiljning microdissection (LMD) kan användas för att identifiera olika områden eller enstaka celler i tumören, vilket ger ett specifikt prov för att ytterligare analysera det molekylära mönstret upprätthålla den rumsliga kontexten av tumören¹⁴. Denna teknik är tillförlitlig och billig jämfört med andra metoder som används för att analysera den rumsliga transkriptom i solida tumörer¹⁵. Vi analyserade glioma heterogenitet och invasion i genetiskt modifierade modeller mus tumör eller intrakraniell implanterbara modeller med LMD. Dessa modeller sammanfatta de framträdande egenskaperna hos mänskliga gliom, vilket gör det möjligt att studera gliom heterogenitet och invasion^10,12.

Upprätthålla högkvalitativa tumör vävnad morfologi och RNA integritet är en av begränsningarna för LMD. För att förbättra vävnadsmorfologin perfunderade vi möss med Tyrodes lösning i 5 minuter, följt av 30% sackaros upplöst i samma lösning. När hjärnan dissekerades, bevarade vi den i 30% sackaros upplöst i RNase/DNase-fritt vatten över natten eller tills hjärnan nådde botten av förvaringsbehållaren. Dessa steg förbättrar vävnadens morfologi avsevärt och minskade bildandet av iskristaller i vävnaden under kryokonservering. Även om mänskliga glioma vävnad inte användes för detta protokoll, inkubation av mänskliga prover i 30% sackaros lösning över natten kan vara en genomförbar metod för att förbättra kryosections morfologi. En annan möjlig begränsning för LMD är bevarandet av RNA integritet post-färgning⁸. Även om andra forskargrupper har utfört lasermikrodissection på gliomvävnad följt av RNA-seq analys de inte illustrerar någon RNA och / eller morfologi inte heller kommentera morfologiska kvalitet, eller särskilda kontroller för gliom frysta avsnitt¹⁶. I detta protokoll korrekt morfologiska identifiering var viktigt för att laser mikrodissect exakta makrocellulära strukturer inom gliom. Vi observerade att fastställande gliom vävnad med etanol lösning och färgning det med 4% Cresyl violett och 0,5% eosin Y upplöst i etanol-underhållna RNA kvalitet och möjliggjorde mikroskopisk identifiering av enskilda celler och flercelliga strukturer. Vi visade att montering gliom sektioner med monteringslösning är ett kritiskt steg som förhindrar sprickbildning och spricka bildas i vävnaden. Observera att monteringsmediet måste beredas i vatten, eftersom användning av monteringsmediet upplöst i etanol kommer att resultera i dålig vävnadmorfologi. Lasermikrodissection måste utföras så snabbt som möjligt i en RNase-fri miljö. Vi rekommenderar också att avsnitt upp till 2,5 x 10^{6 μm 2} totalt tumör/vävnad område för att få lämpliga mängder RNA, både för RNA kvalitetskontroll och transkriptomisk analys.

LMD möjliggör analys av de molekylära signalvägar som reglerar gliom heterogenitet och invasion. Denna analys kan avslöja nya potentiella mål för diagnos, prognos och framtida translationell utveckling i prekliniska gliom modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571