Summary
Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.
Abstract
Gliomlar invazivlik leri ve heterojenlikleri ile karakterize primer beyin tümörleridir. Psödopalisatlar, mikrovasküler proliferasyon, mezenkimal transformasyon ve nekroz gibi spesifik histolojik paternler yüksek dereceli gliomların histolojik heterojenliğini karakterize eder. Laboratuvarımız, oncostreams adı verilen mezenkimal hücrelerin yüksek yoğunluklarının varlığının tümör malignitesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Glioma'nın büyüme ve istilasının altında yatan mekanizmaları anlamak için eşsiz bir yaklaşım geliştirdik. Burada, intra-tümöral heterojen multisellüler yapıların diferansiyel mRNA ekspresyonunu (yani mezenkimal alanlar veya tümör invazyonu alanları) analiz etmek için lazer yakalama mikrodizesi (LMD) ve RNA dizilimi kullanan kapsamlı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem iyi doku histolojisi ve RNA bütünlüğünü korur. Perfüzyon, donma, gömme, kesit ve boyama morfolojisini korumak ve yüksek kaliteli lazer mikrodiskes örnekleri elde etmek için optimize edildi. Sonuçlar, %30 sakaroz kullanan glioma taşıyan farelerin perfüzyonunun iyi morfoloji ve RNA kalitesi sağladığını göstermektedir. Buna ek olarak,% 4 Cresyl menekşe ve% 0.5 eozin ile tümör bölümleri boyama iyi nükleer ve hücresel boyama ile sonuçlanır, RNA bütünlüğünü korurken. Açıklanan yöntem hassas ve son derece tekrarlanabilir ve çeşitli tümör modellerinde tümör morfolojisi çalışmak için kullanılabilir. Özetle, katı tümörler deki heterojen çok hücreli yapıların moleküler özelliklerini incelemek için sıralama için morfolojive RNA kalitesini koruyan LMD'yi gerçekleştirmek için tam bir yöntem açıklıyoruz.
Introduction
Gliomas merkezi sinir sisteminin en agresif primer tümörlerdir. Onlar son derece invaziv ve heterojen1. Tümörün hücresel ve moleküler bileşenlerinin analizi yeni terapötik hedefleri ortaya çıkaracaktır.
Şu anda mevcut farklı yöntemler arasında, dondurulmuş beyin tümör dokusunun lazer yakalama mikrodizması (LMD) kendi moleküler profil2,3çalışma tümör dokularından ayrık anatomik alanların veya belirli hücre popülasyonlarının izolasyon sağlayan bir maliyet-etkin, güvenilir bir tekniktir., LMD seçilen tek hücre veya çok hücreli yapıların mRNA gen ekspresyon profillerianalizi sağlar4,5. LMD tümör ilerlemesi sırasında meydana gelen moleküler olaylar hakkında derinlemesine mekanik bilgi kazanmak için kullanılabilir. Doku morfolojisi ve RNA kalitesinde6'nınen uygun optik çözünürlüğünü elde etmek için tümör dokularının işlenmesinde iyileştirme gereklidir. Paraformaldehit fiksasyonu morfolojik analiz için en iyi seçenek olmasına rağmen, RNA kalitesi etkilenir ve bu koşullar altında bozulur, RNA-seq analizi için düşük RNA kalitesi ile sonuçlanır. Dondurulmuş doku bölümlerinin kullanımı hücre zarlarını kırmak ve hücreler içinde delik üretebilir buz kristaloluşumunu önler, ve RNA-Seq analizi için en iyi seçenek kalır7.
Burada, LMD için dondurulmuş fare beyin tümörü dokuları işlemek için optimize edilmiş bir kesit fiksasyon ve boyama yöntemi açıklar. Dokuda buz kristallerinin oluşmasını önlemek için fareleri %30 sakaroz çözeltisi ile perfüzyonladık. Bu çözelti kutup su molekülleri arasındaki etkileşimleri bozar ve doku morfolojisini koruyarak buz kristallerinin oluşumunu önler. Doku boyama ayırt etmek ve tümör içinde hücrelerin veya anatomik olarak farklı alanlarda belirli nüfus elde etmek için gereklidir. RNA bütünlüğünü korumak için dokuyu zararsız boyalarla onarmak ve lekelemek esastır. Daha önce hematoksilin/eozin (H&E) ile boyama dokusunun RNA bütünlüğünü bozdığı gösterilmiştir8. Biz sabit ve etanol, Cresyl menekşe% 4 ve eozin Y 0.5% çözümleri ile ilgi doku lekeli. Cresyl menekşe koyu mavi renk ile hücre çekirdeği lekeler asiofilik boya. Eozin Y hücrelerin temel bileşenleri lekeler bir bazofilik boya, sitoplazma ve diğer hücresel yapılar arasında bir ayrım sağlayan8. Her iki boya da etanolde çözünür ve RNA kalitesini bozmaz. Doku hasarını önlemek ve hücresel yapıların yüksek optik çözünürlüğünü korumak için, DOKU KESİmLERINI LMD9'danönce monte ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada deneysel hayvanların kullanıldığı belirtilen tüm yöntemler Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: GEMM veya stabil hatlardan üretilen glioma nörosferleri farelerde intrakranial tümör engraftment için kullanılabilir10 ve LMD ve RNA dizilimi için işlenebilir. Bu hücreler, tümör büyüme analizi ve lokalizasyonu için daha fazla kullanılacak olan ateş böceği luciferase ve GFP proteinlerini constitutively ifade eder.
1. Genetik olarak tasarlanmış glioma modellerinden elde edilen nörosferlerden intrakranial fare glioma modelinin üretimi
- Genetik olarak tasarlanmış bir fare (GEMM) modelinden nörosfer hücrelerinin birincil kültürünü oluşturmak için, daha önce açıklanan protokolü kullanın10,11.
- Açıklandığı gibi nörosfer kültür ortamı hazırlayın: 500 mL Dulbecco's Modifiye Kartal Orta F-12 (DMEM/F12) 50 mL 50x B-27 ve 5 mL 100x N-2 nöronal kültür takviyeleri, 5 mL 100x Antibiyotik-Antimikotik ve Normocin 1 mL ile desteklenmiştir. Nörosferleri kaplamadan önce, kültür ortamına 20 ng/mL insan rekombinant EGF ve FGF ekleyin.
- Kültür glioma nörosferler bir doku kültürü kuluçka 37 °C ve 5% CO2 2 intrakranial tümör engraftment önce 2-3 gün.
- Ameliyat günü, glioma nörosferleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika için 550 x g onları spin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Nörosferleri ayırmak için hücre peletini 1 mL hücre ayırma çözeltisinde yeniden askıya alın ve 37 °C'de ve %5 CO2'de 2-4 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka dönemini takiben, tek hücresüspansiyonu sağlamak için 1 mL mikropipet ile nörosferleri yukarı ve aşağı pipet.
- Nörosfer süspansiyonuna 10 mL'lik un-takviye edilmiş DMEM/F12 ortamile seyrelterek hücre ayırma çözeltisini inaktive edin. Oda sıcaklığında 5 dk için 550 x g nörosferler spin. Dikkatlice, supernatant çıkarın.
- Hücre peletini 100 μL DMEM/F12 medyasında hiçbir ek olmadan yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 1:50 seyreltin ve canlı hücreleri saymak için 50 μL Trypan Blue ekleyin. Hücrelerin konsantrasyonu belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
cells/mL = [((hücreler kare başına sayılır) / # sayılan kareler) x 50 x 10.000 hücre/mL] - Hücre sayısını belirledikten sonra, 100 μL hacimde 30.000 hücre/μL'lik bir hedef konsantrasyonelde etmek için, nörosferleri aşağı döndürün ve takviye içermeyen Uygun DMEM/F12 hacminde yeniden askıya alın.
- Nörosferleri önceden etiketlenmiş 0,6 mL'lik bir tüpe buz ayarı.
- İmplantasyon öncesi anestezi, analjezik ve anestezi geri dönüş çalışma çözümlerini hazırlayın: Ketamin/deksmedetomidin anestezisi için 0.6 mL 100 mg/mL ketamin hidroklorür ve 0.8 mL 0.5 mg/mL deksmedemidine hidrolid ilave edin ve %0.9 NaCl içeren NaCl içeren 0.6 mL. Buprenorfin analjezik için, şişe içeren 0.9% NaCl 9 mL için 0.3 mg/mL buprenorfin 1 mL ekleyin. Atipamezole anestezisi ters için, şişe içeren 0.9% NaCl 9 mL için 5 mg /mL atipamezole 1 mL ekleyin.
- İntrakranial tümör engraftment için 6-8 haftalık C57BL/6J dişi fareler kullanın.
- Kemirgen sağkalım cerrahisi için onaylanmış bir odada, intrakranial tümör engraftment için steril malzemeler kurmak. Çıkarılabilir 33G iğneile sterilize edilmiş 10 μL Hamilton şırıngası ile donatılmış bir kemirgen stereotaksik çerçeve üzerinde ameliyatlar gerçekleştirin. Ameliyatlar arasında araçları sterilize etmek için bir boncuk sterilizatör kullanmak.
- Adım 1.11'de hazırlanan anestezik solüsyonun tek bir intraperitoneal (yani) enjeksiyonu ile fareleri anestezik (ketamin:75.0 mg/kg ve deksmedetomidin:0.5 mg/kg). Yaklaşık olarak, anestezik çözeltinin 250 μL hacmi 20 g ağırlığındaki bir fareye teslim edilecektir.
- Fare derin bir anestezi durumuna geldikten sonra, kurumasını önlemek için gözlere steril petrolatum oftalmik yağ uygulayın. Fare kafatasının üzerindeki kürkü tıraş edin. Dezenfekte etmek için tıraş lı bölgeye %10 povione-iyot topikal solüsyonu uygulayın.
- Farenin kafatasını stereotaktik bir çerçevede sabitle. İlk olarak, dikkatle forceps ile ağız açın ve yavaşça dil çekin ve boğulma önlemek için ağzın bir tarafına hareket ettirin. Pİştiler ile ağzı açık tutun ve stereotaktik çerçeve üzerinde diş çubuğunun anahtar deliği içine üst kesici yerleştirin.
- Fare başını kulakların yanında tutarak, kulak çubuklarını yörünge sonrası kemiklere yerleştirin ve sabitleyin. Farenin kafatasının cerrahi masa ile aynı seviyede olduğundan emin olun. Kafatasına baskı uygulamadan kulak çubuklarını dikkatlice sabitle. Sonra, dikkatlice burun çubuğu güvenli.
- 15 beden neşter bıçağı kullanarak fare kafası boyunca bir kesi yapın ve kafatasını açığa çıkarın. Colibri retraktörlerini kullanarak kesi yerindeki deriyi geri alın. Tüm pericranial doku kaldırmak için steril bir aplikatör kullanın.
- Bregma'yı tanımlayın ve Hamilton şırıngasının iğnesini doğrudan üzerine indirin. Çerçeveyi kullanarak, iğneyi bregma'nın 1 mm ön ve 1,5 mm lateral pozisyonunu yerleştirin. 26G iğne kullanarak, kafatası puanlama bu nokta işaretleyin.
- Hedef bölgede bir çapak deliği oluşturmak için 0,45 mm matkap ucuyla donatılmış kablosuz güç matkabı kullanın. Altta yatan dura mater ulaşana kadar matkap. 26G iğneile çapak deliğinde kalan kemiği dikkatlice ayıklayın.
- Bir pipet kullanarak, hücreleri iyice homojenize ve şırınga içine nörosfer süspansiyon 7 μL kadar çizin. Şırınganın düzgün çalıştığından emin olmak için süspansiyonun 1 000'ini %70 alkolle ıslatılmış bir pedin üzerine dağıtın.
- İğneyi dura mater'in yüzeyine indirin. Şırıngayı 3,5 mm ventral'ı indirin ve 0,5 mm geri çekin. Bu, nörosferlerin enjekte edildiğinde birikmeleri için beyinde 0.5 mm'lik bir boşluk yaratacaktır.
- Basınç dengesi için 2 dakika boyunca yerinde iğne bırakın. Yavaş ve sorunsuz 1 dakika boyunca hücrelerin 1 μL teslim. Hücrelerin 6 dakika yerleşmek için izin verin. 2 dakika boyunca beynden yavaş ve sorunsuz şırınga çıkarın.
- Steril tuzlu çözelti kullanarak, kafatası yüzeyini üç kez yıkayın. Şırıngadaki fazla hücreleri %70'lik bir alkol yastığına dağıtın ve iğneyi %70 daha alkol yastığıyla temizleyin. İğnenin tıkanmasını önlemek için şırıngayı steril PBS ile durula.
- Retraktörleri çıkarın ve fareyi stereotaktik çerçeveden dikkatlice çıkarın. 3-0 naylon dikişler, forceps ve bir iğne sürücüsü kullanarak kesi kapatın.
- 20 g fare için yaklaşık 100 μL atipamezole (1.0 mg/kg), uygulayın. Buprenorfin (0.1mg/kg subkutan) deri altı, 20 g fare için yaklaşık 70 μL uygulayın. Ameliyat sonrası fareleri temiz bir iyileşme kafesine yerleştirin ve uyarı ve aktif olana kadar onları izleyin.
2. Hayvan perfüzyonu ve beyin koruma
- Tümör ilerlemesini izlemek için, hayvanlar tümör yükü belirtileri gösterene kadar in vivo görüntüleme sistemi kullanarak in vivo biyolüminesans belirlemek. 106 ila 107 foton/s arasında bir sinyale ulaştıklarında ötenazi fareleri.
- İntraperitoneal (yani) ketamin enjeksiyonu (75.0mg/kg) ve deksmedetomidin (0.5 mg/kg) solüsyonu ile tümör yükü belirtileri gösteren anestezi fareler. 20 g ağırlığındaki bir fareye yaklaşık 250 l l teslim edin. Daha sonra, pedal refleksine yanıt vermeyen farenin olduğundan emin olun.
- Forceps kullanarak, periton boşluğu üzerinde deri tutun, ve diseksiyon makası büyük bir çift kullanarak periton duvarı nüfuz ederek bir "Y" kesi yapmak, diyafram delinmek, ve sonra göğüs kafesi kesti.
- Farenin kalbinin sol ventriküliçine künt 20G kanül yerleştirin. Sonra exsanguination için izin vermek için kalbin sağ atriyum snip.
- Oksijenli Tyrode çözeltisi izin (%0.8 NaCl, 0.0264% CaCl2, 0.005% NaH2PO4, 0.1% glikoz, 0.1% NaHCO3, 0.02% KCl) karaciğer ve akciğerler tamamen kan çıkarılması nedeniyle temizlenmiş kadar fare dolaşım sistemi üzerinden akmasına izin (~ 5 dk).
- Ek bir 15 dakika için Tyrode çözeltisi çözünmüş% 30 sakaroz çözeltisi ile hayvan perfüzyon devam edin. Perfüzyon başarısını değerlendirmek için, boyun, kuyruk ve bacaklar sert sonrası olduğunu teyit 30% sakaroz dolaşımı.
- Diseksiyon makası küçük bir çift kullanarak, orta hatta kafa derisi kesti. Oksipital kemikten başlayıp buruna doğru ilerliyoruz. Bu kafatasını ortaya çıkaracak.
- Bir çift rongeur kullanarak, oksipital kemikten başlayan kafatasını kırın ve beynin yüzeylerini tamamen açığa çıkarmak için ilerlemeye devam edin. Sonra baş tarafını yukarı çevirin ve kafatasından serbest bırakmak için beynin tabanındaki sinirleri inceleyin.
- RNa içermeyen su ile %30 sakaroz çözeltisi hazırlayın ve RNA bozulmasını azaltmak için 40 μm naylon kafes filtresiile filtreleyin.
- Sakaroz çözeltisi infiltrasyonuna en üst ünü maksimize etmek için, parçalanmış beyinleri %30 sakaroz çözeltisine yerleştirin ve bir gecede 4 °C'de saklayın. Daha fazla işleme önce beynin sakaroz çözeltisi içeren tüplerin altına ulaştığından emin olun.
3. Glioma tümörlerini barındıran beyinlerin kriyopreservation
- Önce beyin kriyokoruma, soğuk isopentane/2-metilbütan dolu bir kavanoz hazırlamak ve sıvı nitrojen dolu bir kap içine kavanoz yerleştirin. Çözücü soğumaya bırakın.
- Beyni %30 sakaroz çözeltisinden çıkarın ve bir filtre kağıdında kurulayın.
- Kriyomold'u kalıcı bir işaretle etiketleyin. Dikkatle, kriyomold hava kabarcıkları kaçınarak merkezine OCT (optimum kesme sıcaklığı bileşik) yaklaşık 5 mL ekleyin.
- İstenilen yönde OCT içeren kriyomold içine beyin yerleştirin. Beyin tamamen batırılmış olana kadar OCT ile kalıp doldurun. Temiz forceps kullanarak, hızlı bir şekilde soğuk isopentane/2-methylbutane içine OCT ve beyin ile kriyomold yerleştirin.
- BIR kez OCT katılaşmak (~ 30-40 s), beyin ile kriyomold çıkarın ve kuru buz yerleştirin. Bu katı OCT çatlaklara neden olabilir gibi 2-metilbütan geçmiş 2 dakika içinde beyin içeren kalıp bırakmayın.
4. Dondurulmuş beyin tümörü dokuların kesiti
- Etiket 2 μm polietilen naftalalate (PEN) örnek bilgileri ile slaytlar. Doku kesitleri kesitden sonra doğrudan bu slaytların üzerine yerleştirilir.
- Kriyostat haznesinin sıcaklığını -20 ila -24 °C arasında ayarlayın. Kesitlenmeden önce, numune bloğunu kriyostat haznesine yerleştirin ve 30-60 dk için haznedeki sıcaklığa dengelesin.
- Kriyostat haznesini ve bıçak tutucuyu %100 etanol ile temizleyin ve RNase temizleme solüsyonuyla kullanılacak fırçaları püskürtün. Kriyostat odası içinde çalışan, kalıp çıkarın ve OCT ile cryostat örnek diske beyin içeren OCT blok takın.
- Kesit tutucuya tek kullanımlık bir bıçak takın.
- Beyni 10 μm kalınlığında kesin. Dokuda çizgiler veya çizik çizgileri olmadığından emin olun. Bir boya fırçası kullanarak, dikkatlice düzleştirmek ve kesme yüzeyine doku uncurl.
- Beyin bölümlerini içeren dokuyu rnase içermeyen PEN cam slaytlara dikkatlice monte edin. Pozitif yüklü cam slaytları parmaklarınızla doku yönünde çevirin ve cam kaydırağı doku bölümüne doğru düzgün bir şekilde bastırın.
NOT: Ellerin sıcaklığı dokunun cama bağlanmasına yardımcı olur. - Slaytlar üzerine beyin bölümleri monte ettikten sonra, cryostat odası içinde bir kutu içinde slaytlar tutun ve daha sonra -80 °C onları saklayın. Slaytları asla oda sıcaklığında tutmayın.
NOT: Doku katlama ve yırtılma yaygındır. Doğru posterior analiz için, bu eserler en aza indirmek için önemlidir.
5. Kriyopayrılmış beyin dokusu bölümlerinin fiksasyonu ve boyanması
- RNA bütünlüğünü korumak için, RNase temizleme solüsyonu ile kullanılacak tüm aletleri temizleyin. Bir duman başlık içinde sabitleme ve boyama protokolü ile devam edin.
- Açıklanan fiksatif çözümleri temiz RNase içermeyen 50 mL tüplerde hazırlayın. Boyama gününde RNase içermeyen su ile tüm çözümleri yapın.
- Aynı gün lazer mikrodiszeyapılacak, %100, %95, %70 ve %50 etanol çözeltisi hazırlanacaktır. Çözümleri oda sıcaklığında sıkıca kapalı tüplerde saklayın.
- %4'ü krem menekşe ve %0,5 eozin Y%75 etanol çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 1 dk boyunca şiddetle girdap layın ve çözülmemiş toz izlerini ortadan kaldırmak için 0,45 m'lik naylon filtreden geçirin.
- Doku slaytlarını 30 s. %75 etanol içeren tüpe aktarın slaytlar için % 95 etanol ile bir kap içine yerleştirin; slaytları orada 30 s için bırakın.
- Slaytları %50 etanole aktarın ve 25 s'ye orada bırakın. Bu noktada, OCT çözülecektir. Slaytı 20 s için %4 Cresyl menekşe solüsyonuna aktarın ve 5 s için %0,5 eozin Y çözeltisine aktarın.
- Skalı boya çözeltisinin dışına çıkarve slaydı bir filtre kağıdıyla kurulayın. Daha sonra, 25 s. Slaytları 25 s. Slaytları %75 etanole aktarın. Slaytları 30 s için %95 etanole aktarın. Slaytları 60 s için %100 etanole aktarın.
- Slaytı ksilen ile durula. Ksilen ile bir konteyner aktarın ve 3 dk bekleyin.
- RNase içermeyen suda montaj ortamını (örn. Pinpoint sakız) hazırlayın. Fare beyin bölümlerini monte etmek için, RNase içermeyen sudaki montaj ortamını 1:10 oranında seyreltin.
- Slaytları rnase içermeyen bir yüzeyde oda sıcaklığında 10 s kurulayın. Ksilen kurumadan önce, doku bölümleri ile slaytlar montaj devam edin.
- Steril ve RNase içermeyen ince bir fırça ile slayttaki dokunun üzerine montaj çözeltisini hafifçe dağıtın. 10-20 s bekleyin ve sonra hemen mikroskop mikrodissing platformuna doku slaytlar aktarın.
NOT: Montaj için kullanılan rNase içermeyen su montaj ortamıoranı ilgi dokusuna bağlı olarak değişir. Montaj ortamı/su oranı, RNA bütünlüğünü etkilemeden lazer mikrodisseksi için glioma doku morfolojisini korur.
6. Lazer yakalama mikrodisseksi
NOT: Lazer yakalama mikrodisze mikroskobu, tümör dokusu içindeki belirli ilgi alanlarını lazer mikrodissect için kullanılmalıdır. Doku lazer mikrodiszeksiyon süresini en aza indirmek için, fiksasyon ve boyama önce LMD mikroskop hazırlayın.
- Sistemi başlatmak için, önce güç şeridini açın, ardından lazeri açın. Sonra, mikroskop denetleyicisini ve bilgisayarı açın. LMD yazılımını başlatın.
- Mikroskop kontrolüaltında, 10x büyütme seçin. Lazer kontrolüaltında, doku diseksiyonu için lazer parametrelerini ayarlayın. En iyi kesme sonuçları için 120 Hz'lik bir lazer frekansı ayarlayın. Lazer akımını her zaman %100'e ayarlayın.
- Doğru lazer mikrodisseksi için hızı 10'a, diyafram ayarını 2,0-10,0 m.'ye ayarlayın. Lazer gücünün daha yüksek bir ayarda olması cam gravüre neden olabilir.
- Diseksiyondan sonra dokuyu yakalayacak doku kolektörüne yükleyin. İkinci boşalt düğmesini tıklatın. Boş kolektörü çıkarın ve 30 μL lysis tamponiçeren DNase/RNase içermeyen 0,5 mL PCR düz kafa tüplerini kolektöre yerleştirin. Toplayıcıyı makineye geri yerleştirin ve devam etmek için yazılımı continue'ye tıklayın.
- İşlenmiş (sabit ve lekeli) numuneyi mikroskoba yükleyin. İlk olarak, LMD yazılımıüzerindeki boşalt'ı tıklatın. Ardından, örneği slayt tutucuya yerleştirin ve slayt tutucuyu sahneye yerleştirin. Devam etmek için yazılımı Continue'ye tıklayın.
- Şekilleri Kes pencerelerin altında, Draw + Cut'ı seçin. İlgi alanını bulmak için mikroskop kontrollerini kullanın. İlgi bölgesini (RoI) çizin ve bir hedef toplayıcı tüp seçin. Aynı anda tek bir slayttan farklı alanları mikro parçalara ayırmak için birden fazla ROI çizmek mümkündür.
- Doku mikro diseksiyonuna devam etmek için Kes'i Başlat'ı tıklatın. İlgi alanları kesitsonra tutucu dan kolektör tüpleri çıkarın ve kuru buz üzerine tüpler yerleştirin. Toplanan RNA doku örneklerini uzun süreli depolama için -80 °C'ye aktarın.
7. Mikro-diseksiyonlu glioma dokusunun RNA izolasyonu
- LMD'den RNA ekstraksiyonu için küçük numuneler ve düşük RNA verimi için optimize edilmiş bir RNA izolasyon kiti kullanın (bkz. Üretim talimatlarına uyun. Tüm izolasyon adımlarını oda sıcaklığında (25 °C) uygulayın. RNA kalitesini korumak için, hızlı bir şekilde çalışın. Üretici tarafından belirtildiği gibi tüm çözümleri hazırlayın.
- %1 β-mercaptoetanol ile lisis tamponu ile numune hacmini 350 μL'ye ayarlayın. Numune viskozitesini azaltmak ve RNA elüsasyon spin sütun verimliliğini artırmak için numuneyi 40 s'lik bir girdap.
- Numunenin tamamını 2 mL toplama tüpüne yerleştirilen bir gDNA eliminator spin sütununa aktarın. 8.000 x g30 s için tüp santrifüj . Akışı kaydedin ve santrifüjden sonraki sütunda sıvı kalmadığından emin olun.
- Akışa %70 etanol 350 μL ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. Örneği, 2 mL toplama tüpüne yerleştirilen bir RNA elüsasyon spin sütununa aktarın. Kapağı nazikçe kapatın ve 8.000 x g'de15 s santrifüj . Sütunu kaydederek akışı atın.
- RNA elüsasyon spin sütununa 700 μL RNA yıkama tamponu 1 (%20 etanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7,5) ekleyin. Kapağı nazikçe kapatın ve spin sütun membranını yıkamak için 8.000 x g'de 15 s santrifüj. Akışı atın.
- Santrifüjden sonra, sütunun akışla temas etmeyecek şekilde rna elüsasyon spin sütununu toplama tüpünden dikkatlice çıkarın.
- Dönüş sütununa ikinci RNA yıkama tamponunun 500 μL'sini (etanol %80, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) ekleyin. Sütunun kapağını kapatın ve kolon zarını yıkamak için 20 s için 8.000 x g döndürün. Akışı atın.
- RNA elüsasyon sütunu yıkamak için% 80 etanol 500 μL ekleyin, 2 dk için 8000 x g sütun un kapağını kapatın.
- Yeni bir toplama tüpü kullanın, spin sütununun kapağını açın ve kolon ukuruması için 8000 x g'de santrifüj kurutun. Elüsyon tüpünü atın.
- RNA elüsasyon spin sütununu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin. 37 °C'de ısıtılmış 12 μL RNase içermeyen suyu doğrudan spin sütun membranının merkezine ekleyin. RNA'yı ezilemek için tam hızda 1 dk 4 dk ve santrifüj bekleyin.
8. RNA kalite kontrolü, kütüphane hazırlama ve RNA-Seq analizi
- RNA çıkarma ve saflaştırmayı takiben, RNA'yı güçlendirin ve üretici yönergelerini izleyerek piko-molar konsantrasyonlarında RNA izolasyonu için uygun özel bir kit kullanarak bir cDNA kitaplığı oluşturun (bkz. Üreticinin talimatlarına uyun. Diğer PCR ürünleri yle kontaminasyonu ve numunelerin nükleaz bozulmasını önlemek için iş istasyonunu temizleyin.
- RNA'nın RIN değeri 4'ten büyükse, yani RNA kaliteli veya kısmen bozulmuşsa, parçalanma adımına devam edin. Buz üzerinde tüm öğeleri hazırlayın.
- Belirtildiği gibi bir ana karışım oluşturun (Tablo 1). Nükleaz içermeyen ince duvarlı 0,2 mL PCR tüpte reaksiyon karışımı oluşturun. Tüpleri 94 °C'de sıcak kapaklı termal döngüde kuluçkaya yatırın. Parçalanma kuluçka süresi RNA kalitesine bağlıdır. RIN ≥ 7: 4 dk, RIN 5-6: 3 dk, RIN 4-5: 2 dk.
- Kuluçkadan sonra tüpleri daha önce -20 °C'de soğutulmuş bir PCR soğutucu rafına yerleştirin ve 2 dakika boyunca bekleyin.
- RNA numunesinin her tüpü için, ilk ipliksentez reaksiyonu ana karışımını hazırlayın (Tablo 2). Tüplerini sıcakkapaklı termal döngücörde, Tablo 3'te açıklanan koşullar altında kuluçkaya yatırın. cDNA ürünleri bir sonraki adıma geçmeden önce iki hafta boyunca -20 °C'de dondurulabilir.
- Tablo 4'tebelirtildiği gibi PCR ana karışımını oluşturun. Tüpleri sıcak kapaklı termal döngüye yerleştirin ve PCR reaksiyonu Tablo 5'tebelirtilen ayarların altında çalıştırın.
- DNA'yı arındırmak için kullanılacak olan boncukların oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Isındıktan sonra, her numuneye 40°L boncuk ekleyin. Girdap tüpleri karıştırmak ve tüpün altında sıvı toplamak için kısa bir süre aşağı spin. Tüplerin 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatmasını bekleyin ve DNA'nın boncuklara bağlanmasını bekleyin.
- Tüpleri manyetik bir ayırma cihazına yerleştirin ve yaklaşık 5 dakika veya çözelti tamamen netleşene kadar oturun. Ayırma cihazında tüpleri tutarak, boncukları rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Tüpleri ayırma cihazında tutarak, boncukları rahatsız etmeden yıkamak için boncuklara %80 etanol ekleyin. % 80 etanol çıkarmadan önce 30 s bekleyin. Bu adımı tekrarlayın.
- Kısaca tüpleri aşağı çevirin ve tüpleri ayırma cihazına geri yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden kalan %80 etanolü çıkarın.
- Tüpler 5 dakika boyunca kapakları açık kuru hava sağlar. Boncuklar kuruyacak gibi daha uzun oturup izin vermeyin.
- Tüpleri ayırma cihazında tutarak, boncukları kaplayacak 52°L nükleaziçermeyen su ekleyin. Tüm boncuklar askıya alınana kadar tüpleri ayırma cihazından ve pipetten yukarı ve aşağı çıkarın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka.
- Çözelti netleşene kadar tüpleri ayırma cihazına geri yerleştirin, yaklaşık 1 dk. Elde edilen supernatant'ın 50 μL'sini 8 kuyulu bir şeridin kuyularına aktarın. Her örneğe 40°L yeni boncuk ekleyin. Girdap iyice karıştırmak için. 8 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile boncuk DNA'ya bağlamak için izin verin.
- Bu kuluçka döneminde, numunelerde bulunan herhangi bir rRNA için kullanılacak bileşenlerin erimesine başlayın. Çözüldükten sonra, onları buza yerleştirin. Ayrıca, bir termal çevrimciyi 72 °C'ye önceden ısıtın.
- Çözelti temizlenene kadar (yaklaşık 5 dk) numuneleri manyetik ayırma cihazına yerleştirin. Aliquot 1.5 μL numune başına soğutulmuş PCR tüpüne prob. Tüpü önceden ısıtılmış termal döngüye 2 dk ve 4 °C için 72 °C'lik ayarların altına yerleştirin.
- Örnek tüpleri manyetik ayırma cihazında tutarak, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı bir pipetle çıkarın. Daha sonra boncukları rahatsız etmeden yıkamak için boncuklara %80 etanol ekleyip 200°L taze üretin. % 80 etanol çıkarmadan önce 30 s bekleyin. Bu adımı tekrarlayın.
- Kısaca tüpleri aşağı çevirin ve tüpleri ayırma cihazına geri yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden kalan %80 etanolü çıkarın. Tüpler 2 dakika boyunca kapakları açık kuru hava sağlar. Boncuklar kuruyacak gibi daha uzun oturup izin vermeyin.
- Aşağıdaki bileşenleri sunulan sırada birleştirerek tüm numuneler için ana karışım hazırlayın(Tablo 6).
- Girdap ile ana karışımı karıştırın ve her numunenin kurutulmuş boncuklar için karışımı 22 μL ekleyin ve iyice yeniden askıya almak için karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri aşağı doğru çevirin ve 1 dakika boyunca veya numuneler netleşenine kadar manyetik ayırma cihazına yerleştirin. Boncukları yeni PCR tüplere rahatsız etmeden 20 μL'lik süpernatant aktarın. Tüpleri Tablo 7'dekiayarların altına önceden ısıtılmış bir termal döngüye yerleştirin.
- Her numune için reaksiyonlar için yeterli bir PCR ana karışımı hazırlayın. Belirtilen Tablo 8'dekiana karışıma aşağıdaki bileşenleri ekleyin. 8.20 adımdan itibaren numune tüplerinin her birine 80 μL PCR ana karışımı ekleyin ve aşağıdaki ayarlarda termal döngüye yerleştirin(Tablo 9).
- DNA'yı arındırmak için kullanılacak boncukların oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Isındıktan sonra, her numuneye boncuklardan 100 μL ekleyin. Tüplerin 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatmasını bekleyin ve DNA'nın boncuklara bağlanmasını bekleyin.
- Tüpleri manyetik bir ayırma cihazına yerleştirin ve yaklaşık 5 dakika veya çözelti tamamen netleşene kadar oturun.
- Ayırma cihazında tüpleri tutarak, boncukları rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Tüpleri ayırma cihazında tutarak, boncukları rahatsız etmeden yıkamak için boncuklara %80 etanol ekleyin. % 80 etanol çıkarmadan önce 30 s bekleyin. Bu adımı tekrarlayın.
- Kısaca, tüpleraşağı spin ve ayırma cihazı geri tüpleri yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden kalan %80 etanolü çıkarın.
- Tüpler 5 dakika boyunca kapakları açık kuru hava sağlar. Boncuklar aşırı kuruyacak gibi daha uzun oturup izin vermeyin. Pipet 20 μL Tris Tampon kurutulmuş pelet için. Ayırma cihazından tüpü çıkarın ve boncukları yeniden askıya almak için bir pipetle iyice karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri ayırma cihazına 2 dakika veya çözelti netleşene kadar yerleştirin. Supernatant edinin ve yeni tüpler e aktarın. Daha sonra toplanan çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
- Kalite ve miktar kontrolü için son kitaplıklar gereksinimini kontrol edin. Üreticinin önerdiği protokollere göre, eşleştirilmiş uçlu 50 nt okunan numuneleri toplayıp sırala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laboratuvarımız, uyuyan güzellik transposaz sistemini kullanarak genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM) üretmiştir(Şekil 1A). Bu sistem, yenidoğan farelerde nöral progenitor hücrelerinin genomuna özel genetik değişiklikler içermektedir. Bu değiştirilmiş progenitor hücreleri endojen glioma tümörleri oluşturur. Tümörleri oluşturmak için kullanılan plazmid dizileri: (1) pT2C-LucPGK-SB100X Sleeping Beauty transposon & luciferase ekspresyonu, (2) NRAS ekspresyonu için pT2-NRASSV12, (3) p53 knock-down ve GFP protein ekspresyonu için pT2-shp53-GFP4 ve (4) ATRX knock-down için pT2-shATRx-GFP4. Plazmidler daha önce açıklandığı gibi 1 günlük yenidoğan yavrularının lateral ventriküliçine enjekte edildi11. Plazmid alımı ve tümör oluşumu in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi ile izlendi. Tümör taşıyan fareler tümör yükü belirtileri gösterdikten sonra kurban edildiler. Tümörler ya nörosfer kültürleri oluşturmak için kullanıldı ya da LMD işleme için doğrudan kriyo korunmuştur(Şekil 1A).
GEMM'den başlayan hücre kültürleri translatable glioma modeli oluşturmak için kullanılmıştır (Şekil 1B). GEMM tümörlerinden elde edilen glioma nörosferleri kültürlü ve bağışıklık sistemi olan farelerin striatumuna intrakranial olarak implante edildi. Nörosfer kültüründen elde edilen tek hücreli süspansiyonlar, laboratuarımız tarafından daha önce açıklandığı gibi intrakranial implantasyon ile glioma tümörleri üretmek için kullanılmıştır10,11,12. Bu metodoloji, fare başına yerleştirilmesi gereken hücre sayısının dikkatli bir şekilde ölçülmesine olanak sağlar (30.000 hücre/1 μL/fare). Bu protokol, farklı deneysel implantasyonlar arasındaki sonuçların tekrarlanabilirliğine izin verir. Ancak, nörosferlerin implantasyonu fare glioma tümörleri ve sonraki LMD ve RNA-Seq analizi oluşturmak için alternatif bir seçenek olabilir. Yine de, bu yöntem daha doğru olarak kabul edilir. İn vivo biyolüminesans spektrum görüntüleme sistemi ile tümör progresyonu izlendi. Tümör yükü belirtileri gösteren fareler transkardi olarak perfüzyona alındı ve beyin LMD işleme için kriyo-korunmuştur(Şekil 1C).
Doku kesitleri gliomlar içindeki çok hücreli yapıların transkripsiyonu karakterize etmek için lazer mikrodissected edildi. Tanımlanan perfüzyon, donma ve katıştırma prosedürleri doku morfolojisini korumak ve lazer mikrodisseksinden sonra kaliteli RNA elde etmek için optimize edildi. Üstün morfolojisi ve RNA bütünlüğü olan dokuların elde edilmesi için farklı perfüzyon yaklaşımları değerlendirildi(Tablo 10). İlgi alanlarını incelemek için, rna için zararsız boyalarla dokuyu lekelemek gerekiyordu (Şekil 2). Tyrode'un çözeltisi ile perfüzyon tümör taşıyan farenin 5 dakika, ardından %30 sakarozun 15 dakika sakpiş olduğunu, ardından da tümör dokusunun morfolojisini ve RNA bütünlüğünü koruduğunu gözlemledik (Şekil 3D). %30 sakaroz çözeltisi ile perfüzyon doku içinde buz-kristal oluşumunu engelledi. Paraformaldehit doku fiksasyonu yüksek kaliteli doku morfolojisi ile sonuçlanmasına rağmen RNA bütünlüğü olumsuz etkilenmiştir(Şekil 3B). 5 dk için Tyrode çözeltisi veya 15 dk için 5 dk + %30 sakaroz çözeltisi(Şekil 3A ve C)için Tyrode çözeltisi gibi diğer yaklaşımlar RNA kalitesini etkilemedi. Bu koşullar altında, beyinler bir gecede% 30 sakaroz korunmuş değildi; doku morfolojisinde azalmış çözünürlüğü gözlemledik.
RNA bütünlük kalite kontrol analizini takip eden çeşitli boyama teknikleri uyguladık. %4 Cresyl menekşeve %0.5 eozin Y boyamanın glioma çok hücreli yapıları belirlemek ve RNA bütünlüğünü korumak için yeterli olduğunu gözlemledik. Cresyl menekşe koyu mavi renk ile hücrelerin çekirdeğilekeleri asiofilik boya. Eozin Y hücrelerin temel bileşenleri lekeler bir bazofilik boya.
Doku montaj ortamı ile monte edilmemişse, kesitlerin susuz kaldığını ve morfolojinin bozulduğunu gözlemledik (Şekil 4A). Yüksek kaliteli doku morfolojisini korumak için, biz montaj orta ile doku monte. %15 montaj ortamının suda çözünmüş olduğunu (200°L suda 30°L) yüksek kaliteli doku morfolojisi(Şekil 4B)koruduğunu gözlemledik.
Şekil 5A'daglioma heterojenitesi alanları gösterilmiştir. Görüntüler, diseksiyon dan önceki lazer yakalama mikrodisksiyon mikroskobu kullanılarak elde edildi. Kırmızı çizgiler bol mezenkimal hücreleri (uzamış hücreler) olan alanları tasvir eder. Mavi çizgiler mezenkimal hücrelerin (yuvarlak hücreler) olmayan alanları tasvir eder(Şekil 5A, orta görüntü). Şekil 5B lazer mikro-diseksiyontümör alanları (kırmızı çizgiler) ve normal beyin dokusu alanları (mavi çizgiler) görüntüleri gösterir. Yatırım getirisi seçimi ilgi alanlarının incelenmesi için yapılır(Şekil 5A ve B, daha düşük görüntüler). Bu görüntülerde seçilen alanların diseksiyonundaki başarıyı gözlemleyebiliriz.
RNA ekstraksiyonu ticari bir kit kullanılarak gerçekleştirildi. MRNA ekstraksiyonu ve sonraki RNA dizilimi için cDNA kütüphane hazırlığı için toplam 2.5 x 106 - 7 x 106 m2 arasında parçalanmış doku alanının gerekli olduğu saptandı. RNA kalite kontrolü lazer mikrodiszeksiyon sonrası glioma dokusunda 6 ile 7 arasında rIN saptandi. CDNA kitaplığı hazırlığı için uygun olduğu 6 rIN saptandı. RNA ekstraksiyonundan sonra, picomolar konsantrasyonlarda RNA izolasyonu için bir kit, yeni nesil sıralamaya uygun bir cDNA kütüphanesi oluşturmak için kullanılmıştır.
| 0,25 ng - 10 ng (1-8 μL) RNA |
| 5x Birinci İplik Tamponunun 4 μL'si |
| 1 μL Oligos Mix V2 |
| Nükleaz içermeyen su 13 μL'lik son hacmine |
Tablo 1: RNA kalite kontrol ve kütüphane hazırlama: Adım 8.3 için Master Mix hazırlık.
| 4,5 μL Karışım V2 |
| 0,5 μL RNase inhibitörü |
| 2 μL Ters Transkriptaz |
| 7 μL'lik son hacim |
| RNA numune tüpüne 7 μL ekleyin |
Tablo 2: RNA kalite kontrol ve kütüphane hazırlama: Adım 8.5 için Master Mix hazırlık.
| 90 dk için 42 °C |
| 10 dk için 70 °C |
| 4 °C tutma |
Tablo 3: RNA kalite kontrolü ve kütüphane hazırlama: Adım 8.5 için termocycler koşulları.
| 2 μL nükleaziçermeyen su |
| 25 μL 2x PCR Tampon |
| Her reaksiyon için 1 μL DNA Polimeraz |
| Yavaşça karıştırın ve kısa bir süre aşağı doğru döndür |
| Örnek tüplerin her birine ana karışımın 28 l'sini ekleyin |
| Her tüpe her 5' ve 3' astardan 1 μL ekleyin |
| Reaksiyonları hafifçe karıştırın ve kısa bir süre aşağı doğru döndür |
Tablo 4: RNA kalite kontrol ve kütüphane hazırlama: Adım 8.6 için Master Mix hazırlık.
| 1 döngü |
| 1 dk için 94 °C |
| 5 döngü |
| 15 s için 98 °C |
| 15 s için 55 °C |
| 30 s için 68 °C |
| 1 döngü |
| 68 °C için 2 dk, 4 °C tutun |
Tablo 5: RNA kalite kontrolü ve kütüphane hazırlama: Adım 8.6 için termocycler koşulları.
| 16.8 μL nükleaziçermeyen su |
| 2.2 μL 10x R Tampon |
| 1,5 μL R v2 |
| 1.5 μL R-Problar v2 |
Tablo 6: RNA kalite kontrol ve kütüphane hazırlama: Adım 8.18 için Master Mix hazırlık.
| 37 °C 60 dk |
| 72 °C 10 dk |
| 4 °C tutma |
Tablo 7: RNA kalite kontrolü ve kütüphane hazırlama: Adım 8.20 için termocycler koşulları.
| 26 μL nükleaziçermeyen su |
| 50 μL CB PCR Tampon |
| 2 μL PCR2 Astar v2 |
| 2 μL DNA Polimeraz |
Tablo 8: RNA kalite kontrol ve kütüphane hazırlama: Adım 8.21 için Master Mix hazırlık.
| 1 döngü |
| 1 dk için 94 °C |
| X döngüleri |
| 15 s için 98 °C |
| 15 s için 55 °C |
| 30 s için 68 °C |
| 1 döngü |
| 68 °C için 2 dk, 4 °C tutun |
Tablo 9: RNA kalite kontrolü ve kütüphane hazırlama: Adım 8.21 için termocycler koşulları.
| Adım 1 | Adım 2 | Adım 3 | |
| Yöntem 1 | Tyrode'un 15'i. | -- | -- |
| Yöntem 2 | Tyrode'un 5' | Sakaroz %30 15' | -- |
| Yöntem 3 | Tyrode'un 5' | %4 PFA 10' | -- |
| Yöntem 4 | Tyrode'un 5' | %30 Sakaroz 15' | Beyin de 30% Sakaroz Gecede |
Tablo 10: Farklı perfüzyon yaklaşımları için yöntemler.
Şekil 1: Lazer mikrodisseksi için kullanılan fare glioma modelleri. (A) Uyku güzelliği GEMM de novo glioma geliştirmek için kullanılır. Görüntüler tümör progresyonu gösterir: (i) neonatların lateral ventriküliçine plazmid enjeksiyonu, (ii) tümör yükü. (B) Glioma hücre kültürleri kullanılarak nakledilebilir glioma modelinin üretimi. GEMM'den kültürlenen nörosfer hücreleri striatuma intrakranial olarak yerleştirilir. (C) Perfüzyon sonrası koronal oryantasyona gömülü beynin kriyo-kesitinin tasviri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kriyo-korunmuş doku kesitlerini Cresyl menekşeve Eosin ile lekelemek için kullanılan yöntemin şematik gösterimi. Boyama için kullanılan slaytlar, RNase içermeyen su ile temizlenmiş aletlerle işlenmiştir. Tüm çözeltiler boyama gününde RNase/DNase içermeyen su ile hazırlanmıştır. Cresyl menekşe lekeleri çekirdekleri menekşe ve eozin Y lekeleri sitoplazma pembe. Boyalar %70 etanolle eritildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Doku morfolojisi ve RNA bütünlüğünü korumak için çeşitli perfüzyon yaklaşımlarının karşılaştırılması. H&E görüntüleri, farklı yöntemlerle perfüzyona maruz kalan beyin dokusunun karşılaştırmalı morfolojisini temsil eder: (A) Tyrode'un 15 dk. (B) 5 dk için Tyrode çözeltisi, 10 dk için % 4 PFA, (C) 5 dk için Tyrode çözeltisi, 15 dakika için % 30 sakaroz, ve (D) Tyrode çözeltisi 5 dk, 30% sakaroz gecede daldırma ile 15 dakika için% 30 sakaroz. Her perfüzyon yöntemi için RNA kalite değerlendirmesi görüntülenir. Çizimler 18'ler ve 28'ler rRNA zirveleri ve ilk marker tepe tasvir. RNA kalitesini belirlemek için 18 ve 28'lik rRNA oranı kullanılır. RNA parçalarının jel görüntüsü arazilerin sağında görüntülenir. RNA kalitesi RIN değerleri kullanılarak değerlendirildi. RNA kalitesi a, c ve D. Doku morfolojisi yöntemleri nde yüksekti C ve D yöntemlerinde üstündü.
Şekil 4: Monte edilmiş ve monte edilmemiş glioma dokusunun temsili görüntüleri. (A) H&E ile boyanmış dokuların temsili görüntüleri. Bu doku unmounted kaldı ve dokuda tatili ile kötü morfoloji gösteren susuz oldu. (B) H&E ile boyanmış ve montaj ortamıile monte edilmiş dokunun temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Lazer mikrodisseksi için kullanılan glioma dokusunun temsili görüntüleri. (A-B) H&E ile boyanmış dokuların temsili görüntüleri ve LMD için seçilen çok hücreli yapıların alanları. (A) Solda, LMD için uzatılmış hücrelerin alanları (kırmızı) ve kontrol alanları (mavi) seçilmiştir. (B) Sağda, LMD için toplu istila alanları (kırmızı) ve kontrol alanları (mavi) seçilmiştir. (C) Lazer mikrodissected alanlar için temsilci RNA kalite kontrolü. Toplam 6.5 x 106 m2 alan mikrodissected edildi. Analiz, RNA konsantrasyonunun 2.346 pg/μL ve RNA Bütünlük Numarası (RIN): 6.8 olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glioma heterojenitesinin ve invazyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir13. Bu yazıda, lazer yakalama mikrodisyonu (LMD) kullanılarak glioma heterojenitesinin ve istilasının moleküler manzarasını analiz etmek ve ardından transkripsiyonanalizini yapmak için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir yöntem açıklanmıştır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LMD) tümör içinde farklı alanları veya tek hücreleri tanımlamak için kullanılabilir, daha fazla tümörün uzamsal bağlamını koruyan moleküler desen analiz etmek için özel bir örnek sağlayan14. Bu teknik, solid tümörlerde uzamsal transkripsiyonu analiz etmek için kullanılan diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında güvenilir ve düşükfiyatlıdır 15. Genetiği değiştirilmiş fare tümörü modellerinde veya LMD kullanılarak intrakranial implante edilebilen modellerde glioma heterojeniteve invazyonu analiz ettik. Bu modeller glioma heterojenite ve invazyon10,,12çalışma sağlayan, insan gliomas belirgin özellikleri recapitulate .
Yüksek kaliteli tümör doku morfolojisi ve RNA bütünlüğünün korunması LMD için sınırlamalardan biridir. Doku morfolojisini iyileştirmek için fareleri 5 dakika boyunca Tyrode'un solüsyonuyla perfüzyon yaptık ve ardından %30 sakaroz aynı çözeltide çözünmüştü. Beyin parçalandıktan sonra, bir gecede veya beyin deponun dibine ulaşana kadar RNase/DNase içermeyen suda çözünmüş %30 sakarozda sakladık. Bu adımlar önemli ölçüde doku morfolojisi geliştirmek ve kriyo-koruma sırasında dokuda buz kristalleri oluşumunu azalttı. Bu protokol için insan glioma dokusu kullanılmamış olsa da, bir gecede %30 sakaroz çözeltisinde insan örneklerinin kuluçkaya yatması kriyokesiler morfolojisini geliştirmek için uygulanabilir bir metodoloji olabilir. LMD için bir diğer olası sınırlama rna bütünlüğünün korunması sonrası boyama8. Diğer araştırma ekipleri glioma doku üzerinde lazer mikrodisze yapmış olmasına rağmen RNA-seq analizi takip onlar herhangi bir RNA ve / veya morfoloji göstermek yok ne de morfolojik kalite hakkında yorum yok, ya da glioma dondurulmuş bölümler için özel kontroller16. Bu protokolde gliomlar içindeki hassas makrohücresel yapıların lazer mikrodissect için doğru morfolojik tanımlama gerekliydi. Glioma dokusunun etanol solüsyonu ile sabitlenmesi ve etanol bakımından korunan RNA kalitesinde çözünmüş %4 Krem menekşe ve %0.5 eozin Y ile boyanması ve tek hücre ve çok hücreli yapıların mikroskobik olarak tanımlanmasını sağladık. Glioma bölümlerinin montaj solüsyonu ile montajın dokuda çatlama ve çatlak oluşumunu önleyen kritik bir adım olduğunu gösterdik. Montaj ortamının suda hazırlanması gerektiğini, çünkü etanoliçinde çözünmüş montaj ortamının kullanılması nın doku morfolojisinin zayıf olacağına neden olacağını lütfen unutmayın. Lazer mikrodisseksi, RNase içermeyen bir ortamda mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Ayrıca rna kalite kontrolü ve transkripsiyon analizi için uygun miktarda RNA elde etmek için 2.5 x 106 μm2 toplam tümör/doku bölgesine kadar bölüm lemenizi öneririz.
LMD glioma heterojenitesini ve invazyonunu düzenleyen moleküler sinyal yollarının analizini sağlar. Bu analiz, preklinik glioma modellerinde tanı, prognoz ve gelecekteki çevirisel gelişim için yeni potansiyel hedefleri ortaya çıkarabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu makalenin tüm yazarları herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmez.
Acknowledgments
Çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NINDS) Hibeleri tarafından desteklendi: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 to M.G.C.; (NIH/NINDS) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311'den P.R.L.'ye hibeler; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Nöroşirürji Bölümü, Michigan Üniversitesi Rogel Kanser Merkezi, ChadTough Vakfı ve Leah's Happy Hearts Vakfı M.G.C. ve P.R.L. RNA Biyotıp Hibe F046166 M.G.C. Ulusal Sağlık Enstitüleri, UL1 TR002240 Michigan Klinik ve Sağlık Araştırma Enstitüsü (MICHR), Doktora Sonrası Çeviri Akademisyenler Programı (PTSP) hibe, hibe Proje F049768 Michigan Üniversitesi Forbes Kanser Araştırma Enstitüsü, Körlük Önlemek Için Araştırma bir Hekim-Bilim Adamı Ödülü, Inc (RPB), NIH (AK) NEI R01 EY022633 hibe ve RPB oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü için sınırsız hibe. Bu araştırmada Görme Araştırma Çekirdeği (P30 EY007003) ve Kanser Merkezi Araştırma Çekirdeği (P30 CA046592) kullanılmıştır. AK, A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden Bayan William Davidson Emerging Scholar Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
