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Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Abstract

El silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) es una herramienta rápida y eficiente para la caracterización funcional de microARN (miARN) en plantas. El sistema VbMS se ha desarrollado y aplicado para varias especies de plantas, incluyendo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodón y plantas monocotiledóneas como el trigo y el maíz. Aquí, describimos un protocolo detallado que utiliza vectores VbMS basados en PVX para silenciar los miRNAs endógenos en la papa. Para derribar la expresión de un miRNA específico, se diseñan moléculas mímicas (TM) objetivo de miRNA de interés, integradas en vectores de virus vegetales, y expresadas en papa por infiltración de Agrobacterium para unirse directamente al miRNA endógeno de interés y bloquear su función.

Introduction

Los microARN de las plantas (miRNAs) se caracterizan por ser ARN reguladores de 20 a 24 nucleótidos de longitud, codificados nuclearmente1 y desempeñan un papel fundamental en casi todos los aspectos de los procesos biológicos de las plantas, incluidos el crecimiento y el desarrollo2,3, la fotosíntesis y el metabolismo4,5,6,7, la síntesis y señalización hormonal8,9, las respuestas bióticas y abióticas10, 11,12,13, y regulación de nutrientes y energía14,15. Las funciones reguladoras de los miRNAs de las plantas están bien programadas y se cumplen típicamente a niveles post-transcripcionales mediante la escisión o la represión traslacional de los ARNm objetivo.

Se han logrado enormes avances hacia la identificación, el perfil transcripcional y la predicción de objetivos de miRNAs en papa16,17,18,19,20,21. Sin embargo, la caracterización funcional de los miRNAs en plantas, incluida la papa, se ha quedado atrás de otros organismos debido a la falta de enfoques genéticos eficientes y de alto rendimiento. Es difícil realizar análisis funcionales de miRNA individual mediante análisis estándar de pérdida de función, porque la mayoría de los miRNAs pertenecen a familias con redundancia genética considerable22. Además, un solo miRNA puede controlar múltiples genes diana23 y varios miRNAs diferentes pueden modular la misma vía molecular de forma colaborativa24,25. Estas propiedades dificultan la caracterización de la función de un miRNA específico o una familia de miRNA.

Gran parte del análisis funcional de los miRNAs se ha basado en gran medida en enfoques de ganancia de función que tienen limitaciones obvias. El método de miRNA artificial (amiRNA) explota las transcripciones primarias endógenas (pri-miRNAs) para producir miRNAs a un alto nivel, lo que lleva a la inhibición de la expresión génica diana26,27,28,29. Sin embargo, el etiquetado de activación y la sobreexpresión de miRNA utilizando un fuerte promotor constitutivo de 35S a menudo conducen a una mayor expresión de miRNAs que no son representativos de condiciones in vivo y, por lo tanto, pueden no reflejar la función endógena de miRNAs30. Se ha desarrollado un enfoque alternativo que involucra la expresión de formas resistentes a miRNA de genes diana que contienen mutaciones evitables en los sitios de unión y/o escisión31,32,33. Pero este enfoque también puede causar una mala interpretación del fenotipo derivado del transgén objetivo resistente al miRNA debido a artefactos transgénicos. Por lo tanto, las conclusiones de estos estudios de ganancia de función deben extraerse con precaución34. Otra limitación importante de los enfoques descritos anteriormente es que requieren transformación, que requiere mucha mano de obra y requiere mucho tiempo. Además, los enfoques dependientes de transgenes son difícilmente aplicables para las especies de plantas transformadas-recalcitrantes. Por lo tanto, es esencial desarrollar un enfoque rápido y eficiente de pérdida de función para desentrañar la función de los miRNAs.

Para eludir el requisito previo del procedimiento de transformación, se ha establecido el silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) mediante la combinación de las estrategias de imitación objetivo (TM) con vectores derivados de virus. En el sistema VbMS, las moléculas tm diseñadas artificialmente se expresan transitoriamente desde una columna vertebral del virus, ofreciendo una herramienta potente, de alto rendimiento y ahorro de tiempo para diseccionar la función de los miRNAs endógenos de las plantas35,36. VbMS se desarrolló inicialmente en N. benthamiana y tomate con el virus del sonajero del tabaco (TRV)35,36,37 y se ha extendido a Arabidopsis, algodón, trigo y maíz utilizando varios otros sistemas de expresión de virus, incluido el virus de la papa X (PVX)38, el virus de la arruga de la hoja de algodón (ClCrV)39, el virus del mosaico del pepino (CMV)40,41,42, el virus del mosaico del trigo chino (CWMV)43 , y el virus del mosaico de la raya de cebada (BSMV)44,45.

La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto cultivo alimentario más importante y el cultivo no aéreo más cultivado en el mundo, principalmente debido a su alto valor nutricional, alta producción de energía y requerimientos de insumos relativamente bajos46. Varias características de la papa la convierten en una atractiva planta modelo dicotiledónea. Es un cultivo poliploide propagado vegetativamente con alta tasa de cruce, heterocigosidad y diversidad genética. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe que caracterice la función de los miRNAs en papa utilizando VbMS. Aquí, presentamos un enfoque VbMS basado en VbMS basado en PVX de papa adaptado a la clonación independiente de la ligadura (LIC) para evaluar la función de los miRNAs en plantas de papa38. Seleccionamos la familia miR165/166 para ilustrar el ensayo VbMS porque la familia miR165/166 y sus ARNm objetivo y los factores de transcripción homeodominio/cremallera Leu clase III (HD-ZIP III) se han caracterizado ampliamente22,47,48. Los genes HD-ZIP III son reguladores clave del desarrollo del meristemo y la polaridad de los órganos, y la supresión de la función miR165/166 conduce a una mayor expresión de los genes HD-ZIP III, lo que resulta en defectos de desarrollo pleotrópicos como la reducción de la dominancia apical y los patrones aberrantes de polaridad de la hoja22,35,38,41 . Los fenotipos de desarrollo fácilmente puntuables correlacionados con el silenciamiento de miRNA165/166 permiten una evaluación precisa de la efectividad del ensayo VbMS basado en PVX.

En este estudio, demostramos que el sistema VbMS basado en PVX puede bloquear efectivamente la función de los miRNAs en la papa. Debido a que el sistema de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) basado en PVX se ha establecido en varias variedades de papa49,50,51,52, este enfoque VbMS basado en PVX probablemente se puede aplicar a una amplia gama de especies de papa diploide y tetraploide.

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Protocol

1. Cultiva plantas de papa.

  1. Propagar plantas de papa in vitro en tubos de cultivo (25 x 150 mm) con medios Murashige y Skoog (MS) más vitamina de Gamborg (mezcla de sal basal de MS, vitamina de Gamborg, sacarosa de 30 g/L, 3,5 g/L de agar, pH = 5,7). Coloque los tubos en la sala de crecimiento por debajo de 20–22 °C, fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: Los nuevos brotes y raíces normalmente se desarrollan en 1-2 semanas a partir de las plantas. Propague plantas con medios vitamínicos frescos de MS / Gamborg cada mes.
  2. Cuatro semanas después, trasplante plantas in vitro al suelo y cultivarlas en un invernadero a menos de 20-22 °C, fotoperíodo claro de 16 h/8 h de luz y de intensidad de luz de 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: Las plantas con raíces y hojas recién desarrolladas son adecuadas para el trasplante. Mantenga la humedad para las plantas recién trasplantadas durante los primeros 3-4 días.

2. Construir los vectores VbMS.

  1. Diseñar y clonar las moléculas TM en tándem corto (STTM, Figura 1)22,53 para el miRNA de interés.
    NOTA: Adquiera secuencias de miRNA basadas en datos experimentales o de la base de datos miRbase54,55,56,57,58,59. La secuencia miR166 utilizada en este estudio ha sido descrita anteriormente60.
    1. Diseñe el módulo TM insertando una secuencia de desajuste, normalmente 5'-CTA-3', en la secuencia inversa del complemento de miRNA en el sitio correspondiente a los nucleótidos 10-11 del miRNA.
      NOTA: Por ejemplo, la secuencia Stu-miR160 es 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, donde los nucleótidos 10º-11º están en negrita. La secuencia inversa del complemento (en desoxinucleótidos) es 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' y el sitio de inserción de la protuberancia de desajuste se muestra en negrita. La secuencia de la molécula TM (desoxinucleótido) debe ser 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Imprimaciones de diseño para clonar el fragmento STTM (Figura 1). Utilice oligonucleótidos de ADN con la secuencia espaciadora de 48-nt como plantilla para la clonación por PCR. El cebador delantero consiste en un enlazador LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), la secuencia delantera de la molécula TM diseñada anteriormente y la secuencia parcial de 5' del espaciador 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). El cebador inverso consiste en un enlazador LIC2 (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), la secuencia inversa del complemento de la molécula TM, y un complemento inverso parcial a la secuencia 3' del espaciador 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      NOTA: La secuencia del espaciador de 48 NT es 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Por ejemplo, para STTM-miR160, el cebador delantero debe ser 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; el cebador inverso debe ser 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figura 1).
    3. Amplificar el fragmento STTM en un volumen de 50 μL mediante PCR utilizando el espaciador universal sintetizado de 48-nt como plantilla y una ADN polimerasa de alta fidelidad.
      1. Configure la reacción de PCR mezclando 0,5 μL de cada cebador (40 μM), 0,5 μL de oligo espaciador de 48 nt (40 μM), 5 μL de tampón de PCR 10x, 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 0,1 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad (10 U/μL) y 43 μL de ddH2O a un volumen total de 50 μL. Realice la amplificación de PCR estándar de la siguiente manera: 94 °C durante 3 min, 32 ciclos de 94 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s y 72 °C durante 60 s.
    4. Purificar el fragmento STTM por precipitación de etanol. Añadir 2,5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio (pH = 4,0) a los productos de PCR. Mezclar vigorosamente y centrifugar a 14.000 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y enjuague el pellet con 1 ml de etanol al 70%. Secar el pellet y disolverlo en 20 μL de ddH2O.
      NOTA: Utilice la electroforesis de ADN para comprobar la amplificación de los productos sttm PCR.
    5. Configure la reacción de la ADN polimerasa T4 en hielo mezclando 2,5 μL de producto purificado de PCR STTM, 0,5 μL de tampón de ADN polimerasa T4 10x, 0,05 μL de 1 M de ditiotreitol (TDT), 0,25 μL de 100 mM de dATP, 0,1 μL de ADN polimerasa T4 (3 U/μL) y 1,6 μL de ddH2O a un volumen total de 5 μL. Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min, y tratar los productos a 75 °C durante 20 min para inactivar la ADN polimerasa T4.
  2. Prepare la construcción de VbMS basada en PVX.
    1. Digerir 5 μg de plásmido PVX-LIC38 con 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) en un volumen de 100 μL.
    2. Agregue un volumen igual de fenol: cloroformo: isopropanol (25: 24: 1, pH = 6.7 / 8.0) a los productos PVX-LIC digeridos y mezcle vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Agregue un volumen igual de cloroformo: isopropanol (24: 1) y vórtice vigorosamente. Centrifugadora a 14.000 x g durante 10 min.
      NOTA: El vector PVX-LIC alberga el casete LIC para la clonación. El casete LIC del vector PVX-LIC contiene un gen ccdB y un gen resistente al cloranfenicol y necesita ser mantenido/propagado en la cepa DB3.1 de E. coli utilizando medio LB que contiene kanamicina (50 μg/L) y cloranfenicol (15 μg/L).
    3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Agregue 2.5 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (pH = 4.0) y mezcle vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
    4. Enjuague el pellet con 1 ml de etanol al 70% y vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante. Seque el pellet y disuelva el plásmido PVX-LIC digerido con 100 μL de ddH2O.
    5. Configure la reacción de la ADN polimerasa T4 en hielo mezclando 2,5 μL de ADN vectorial PVX-LIC digerido, 0,5 μL de tampón de ADN polimerasa T4 10x, 0,05 μL de 1 M TDT, 0,25 μL de 100 mM dTTP y 0,1 μL de ADN polimerasa T4 (3 U/μL) en un volumen total de 5 μL. Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 min y tratar los productos a 75 °C durante 20 min hasta 20 min inactivar la ADN polimerasa T4.
  3. Clonar la secuencia STTM en el vector PVX-LIC utilizando una reacción LIC. Mezcle los productos de PCR STTM tratados con ADN polimerasa T4 (5 μL) y los plásmidos PVX-LIC tratados con ADN polimerasa T4 (5 μL). Incubar a 70 °C durante 5 min, enfriar a 22 °C en una rampa de 0,1 °C/s y mantener a 22 °C durante 30 min utilizando una máquina PCR.
    NOTA: Extender el tiempo de incubación hasta la noche a 4 °C para lograr una mayor eficiencia de la clonación LIC.
  4. Transformar 5 μL de los productos de reacción LIC en E. coli DH5α y crecer en una placa LB que contenga 50 μg/ml de kanamicina62,63. Recoger y verificar colonias positivas por PCR con los cebadores de clonación y cebador universal para el vector PVX-LIC seguido de secuenciación.
    1. Realizar PCR de colonias con el cebador delantero para PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') en combinación con el cebador inverso para clonación STTM para identificar clones positivos. El tamaño de la banda de PCR debe ser de ~ 300 pb.
      NOTA: Verifique las secuencias de fragmentos STTM mediante secuenciación del ciclo terminador64,65.
  5. Aislar los plásmidos PVX-STTM de los clones validados y transformarlos en cepas de Agrobacterium GV3101, GV2260 o EHA10562,63. Verificar colonias de Agrobacterium mediante PCR.
    NOTA: Confirme las colonias de Agrobacterium mediante PCR utilizando el cebador delantero para PVX-LIC y el cebador inverso para la clonación STTM.

3. Realice el ensayo VbMS basado en PVX en plantas de papa.

  1. Trasplante plantas de papa in vitro de 4 semanas de edad al suelo. Las plantas trasplantadas serán sometidas a un ensayo VbMS 3-4 días después.
  2. Inocular plantas de papa con Agrobacterium que contiene los plásmidos PVX-STTM.
    NOTA: Para el ensayo VbMS en papa, la infiltración mediada por Agrobacterium y la inoculación de rascado de dientes se realizan simultáneamente.
    1. Recoger e inocular transformadores positivos que contengan vectores PVX-STTM en 50 ml de LB líquido que contenga 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de rifampicina. Crecer en una incubadora de 28 °C a 220 rpm durante 16 h hasta OD600 = 1.0.
    2. Al mismo tiempo, rayar las colonias positivas de Agrobacterium en al menos dos nuevas placas LB que contengan 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de rifampicina y crecer a 28 °C durante 1 día. Incluye el vector PVX-LIC38,66 como control y PVX-GFP67,68 para monitorear la propagación del virus.
    3. Recoger el cultivo líquido de Agrobacterium por centrifugación a 3.400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Resuspend Agrobacterium células con un volumen igual de tampón de infiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES y 200 μM acetosyringone, pH = 5.6) y ajustar a OD600 = 1.0. Incubar a temperatura ambiente durante 6 h.
    4. Infiltrar el cultivo de Agrobacterium en el lado abaxial de las hojas completamente expandidas con una jeringa sin aguja de 1 ml.
      1. Voltee y sostenga una hoja con una mano, luego use un dedo para apoyar la lámina de la hoja desde el lado adaxial en el sitio de infiltración. Mantenga la jeringa vertical a la superficie de la hoja con la otra mano e infiltre el cultivo de Agrobacterium en el lado abaxial de la lámina.
    5. Raspe el cultivo de Agrobacterium de las placas LB y rasque la superficie del tallo de los primeros uno o dos entrenudos de las plantas de papa infiltradas con un palillo de dientes. Rasca suavemente la epidermis del tallo. Evite perforar a través del tallo, que puede causar daños graves a las plantas.
  3. Cultive las plantas infiltradas a 22 °C con un fotoperíodo de luz de 16 h/8 h de luz oscura e intensidad de luz de 120 μmol/m2∙ s1 en un invernadero.
    NOTA: Los fenotipos causados por el silenciamiento de miRNA generalmente aparecen en 2-4 semanas después de la perinoculación (Figura 2, Figura 3). Por lo general, el fenotipo VbMS tarda de 10 a 20 días en aparecer después de la infiltración. El fenotipo VbMS depende de las propiedades de los genes específicos de miRNA y diana, las condiciones de crecimiento y las variedades de papa.

4. Realizar análisis de expresión.

  1. Cuando los fenotipos aparecen a las 2-4 semanas después de la perinoculación, recolecte tejidos como brotes, hojas, flores o raíces con fenotipos de las plantas VbMS y tejidos de las plantas de control con tijeras. Aislar los ARN totales de los tejidos recolectados.
  2. Comprobar la calidad del ARN por electroforesis62,63 y cuantificar la concentración de ARN midiendo la absorbancia OD260 con un espectrofotómetro.
  3. Utilice pcrr de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) con bucle de tallo para analizar la expresión de miRNA.
    1. Para miRNAs específicos, diseñe un cebador de transcripción inversa de bucle de tallo. Los cebadores RT de bucle de tallo contienen una columna vertebral universal de 5' y una extensión de 3' 6-nt de un miRNA específico. Diseñar una columna vertebral universal de 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') que forme una estructura stem-loop. (La mayúscula corresponde a una secuencia inversamente repetida y la minúscula a la región del bucle).
    2. Parte de la secuencia de backbone de 5' que forma un bucle sirve como imprimación inversa para la posterior amplificación de PCR (secuencia negrita-cursiva en la secuencia de backbone). Agregue una secuencia de extensión de 6-nt que sea complementaria inversa al extremo 3' del miRNA de interés para el cebador de bucle del tallo para proporcionar especificidad para la transcripción inversa (Figura suplementaria 1A).
      NOTA: Diseñar el cebador de transcripción inversa stem-loop descrito por Chen et al.69 y Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Por ejemplo, el cebador de transcripción inversa stem-loop para Stu-miR160 está diseñado como 5'-GTCTCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. El cebador de transcripción inversa stem-loop para la familia miR165/166 de patata está diseñado como 5'-GTCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAGGGGGGG(A/G)A-3'. (Las secuencias en mayúsculas en negrita proporcionan la especificidad de la transcripción inversa para miRNAs específicos).
    3. Configure la reacción de transcripción inversa mezclando 50–200 ng de ARN total, 1 μL del cebador de transcripción inversa del bucle del tallo (100 μM), 2 μL de tampón 10x, 0,2 μL de inhibidor de la RNasa (40 U/μL), 0,25 μL de dNTP (10 mM cada uno) y 1 μL de transcriptasa inversa (200 U/μL) en hielo. Añadir ddH2O libre de nucleasas a un volumen total de 20 μL.
    4. Realice la transcripción inversa utilizando el procedimiento de transcripción inversa pulsada. Incubar la mezcla de reacción de transcripción inversa a 16 °C durante 30 min, realizar un ciclo de temperatura de 30 °C durante 30 s, 42 °C durante 30 s y 50 °C durante 1 s, durante un total de 60 ciclos, e inactivar la transcriptasa inversa por incubación a 85 °C durante 5 min.
    5. Para el análisis de PCR en tiempo real de la expresión de miRNA, diseñe el cebador delantero basado en la secuencia de miRNA, pero no incluya secuencias que se superpongan con el cebador de transcripción inversa de bucle de tallo diseñado anteriormente. Agregue una extensión de 3 a 7 nt a los 5' de la imprimación delantera para optimizar la longitud, la temperatura de fusión y el contenido de GC (Figura suplementaria 1).
      NOTA: La imprimación inversa universal es 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Por ejemplo, el cebador de transcripción inversa stem-loop para Stu-miR160 está diseñado como 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. El cebador de transcripción inversa de asa del tallo para la familia miR165/166 es 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Las secuencias en negrita sirven como extensiones de 5' para la optimización de la imprimación. Los cebadores de transcripción inversa de bucle de vástago y los cebadores de PCR en tiempo real para miRNA se pueden diseñar utilizando la herramienta de diseño de imprimación de miRNA73.
  4. Sintetizar los ADNc de los ARNm objetivo mediante PCR de transcripción inversa estándar (RT-PCR). Incubar la mezcla de reacción de transcripción inversa a 37 °C durante 60 min e inactivar la transcriptasa inversa calentando a 85 °C durante 5 min.
    NOTA: (1) Predecir los ARNm de destino mediante el programa psRNATarget74 si no se conocen los ARNm de destino. (2) El cebador universal de transcripción inversa para ARNm es un cebador anclado 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Configure la reacción de PCR en tiempo real tanto para el miRNA de interés como para los ARNm objetivo. Mezcle 0,5 μL de cDNA de plantilla, 5 μL de 2x tampón de PCR en tiempo real con verde SYBR, 0,05 μL de cada imprimación hacia adelante y hacia atrás (40 μM) y 4,4 μL de ddH2O en un volumen total de 5 μL sobre hielo.
  6. Incubar a 95 °C durante 3 min, 40 ciclos de 95 °C durante 3 s y 60 °C durante 30 s. Realice un análisis posterior de la curva de fusión de la siguiente manera: Incube a 95 °C durante 15 s, enfríe a 60 °C en una rampa de 20 °C/s, manténgase a 60 °C durante 60 s, caliente a 95 °C en una rampa de 0,2 °C/s y manténgase a 95 °C durante 15 s. Analizar los valores de Ct utilizando los métodos ΔΔCt76,77 y trazar las medias con errores estándar.
    NOTA: (1) Los cebadores de PCR en tiempo real para los ARNm objetivo se pueden diseñar como se describe75. (2) El gen de la poliubiquitina 10 de la papa puede servir como un control interno para la normalización en la papa. El cebador delantero para el gen de la poliubiquitina 10 de la patata es 5'-ATGTTGCCTTTCTGTGTGGTTG-3' y el cebador inverso 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Para el análisis de PCR en tiempo real, la contaminación y la formación de dímeros de imprimación pueden generar resultados falsos positivos. Para monitorear la amplificación inespecífica y aumentar la responsabilidad del análisis de PCR en tiempo real, se recomienda incluir controles sin plantilla y transcriptasa inversa para ensayos de PCR en tiempo real.

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Representative Results

La Figura 2 muestra las plantas de papa PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crecimiento ectópico de los tejidos de las hojas desde el lado abaxial de la lámina de la hoja a lo largo de las venas. También se han observado fenotipos más severos, como la formación de hojas en forma de trompeta. Por el contrario, no se observó ninguna anomalía fenotípica en las plantas de control de PVX. Estos resultados muestran que el sistema VbMS fue efectivo para suprimir la función endógena del miRNA en plantas de papa tetraploides y el sistema PVX-VbMS fue una herramienta genética robusta para determinar la función de miRNAs específicos o familias de miRNA.

La Figura 3 muestra las plantas de papa PVX-STTM165/166 (Russet Burbank) con crecimiento ectópico del tejido foliar desde el lado abaxial de la lámina foliar a lo largo de las venas. Estos resultados muestran que el sistema PVX-VbMS podría aplicarse a otras especies de papa, incluido un importante cultivar de papa.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático de vectores VbMS basados en PVX y la estructura PVX-STTM165/166. LB = borde izquierdo de T-DNA; RB = borde derecho de T-DNA; 35S = promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S; NOST = terminador de nopalina sintasa; RdRP = ARN polimerasa dependiente de ARN; TGB1 = proteína de bloqueo de triple gen 1; TGB2 = proteína de triple bloque genético 2; TGB3 = proteína de bloqueo de triple gen 3; sgP = promotor de ARN subgenómico PVX; CP = proteína de la capa; LIC Cassette = casete de clonación independiente de la ligadura; 48 nt = 48 nucleótido enlazador imperfecto del bucle del tallo. STTM165/166 consiste en secuencias TM en tándem de miR165/166 separadas por una secuencia enlazadora de bucle de vástago imperfecta de 48 nt. La punta de flecha verde en el vector PVX-LIC indica el sitio de inicio del ARN subgenómico PVX que alberga la secuencia STTM. Los guiones triples menos en las secuencias de miRNA indican los sitios de escisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: VbMS de miR165/166 en la variedad tetraploide de patata Katahdin. Fenotipos de las plantas de patata (Katahdin) que expresan el vector PVX control o PVX-STTM165/166. Las flechas magenta denotan estructuras foliares generadas ectópicamente en las venas de las hojas. La punta de flecha naranja denota estructuras de hojas en forma de trompeta. Barras = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: VbMS de miR165/166 en la variedad de papa tetraploide Russet Burbank. Fenotipos de las plantas de papa (Russet Burbank) que expresan el vector PVX como control o PVX-STTM165/166. Las flechas magenta denotan estructuras foliares generadas ectópicamente en las venas de las hojas. Barras = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Diagramas esquemáticos del análisis rt-PCR de bucle de vástago de miRNAs y diseño de cebadores de PCR en tiempo real. (A) Análisis de RT-PCR de bucle madre de miRNAs. Durante la transcripción inversa, la unión del cebador de asa del tallo al miRNA 3' inició la transcripción inversa y se sintetizó el ADNc. Los productos de PCR se amplificaron con un cebador delantero específico del miRNA de interés y el cebador inverso universal. (B) Diseño de imprimación PCR en tiempo real. Se muestran las imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para Stu-miR160 y Stu-miR165/166. El cebador delantero se diseñó en base a la secuencia de miRNA, pero no incluyó secuencias que se superpusieran con el cebador de transcripción inversa de bucle de tallo diseñado. Se agregó una extensión de 3-7 nt a los 5 'de la imprimación delantera para ajustar la longitud, la temperatura de fusión y el contenido de GC. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Presentamos un sistema de silenciamiento de miRNA basado en PVX para caracterizar la función de los miRNAs endógenos en papa mediante la integración del diseño STTM en el vector PVX. El sistema VbMS demostró ser eficaz en el silenciamiento de miRNA165/166 en papa, una familia de miRNA altamente conservada en todas las especies de plantas.

El enfoque de MT se ha desarrollado para interferir con la expresión de miRNAs basado en un imitador artificial del objetivo de miRNA que está diseñado para crear un bucle de desajuste en el sitio de escisión esperado dentro de la secuencia de complementación de miRNA que resulta en el secuestro de miRNA dirigido y la detención de su actividad22,35,78,79 . El emparejamiento entre las moléculas de MT y los miRNAs objetivo bloquea la función de los miRNAs al derribar los niveles de un miRNA específico o una familia de miRNA, lo que conduce a la regulación al alza de los ARNm objetivo. Se han desarrollado varias tecnologías de MT para el silenciamiento de miRNAs, incluyendo mimetismo endógeno de miRNA target (eTM)79,80, miRNA mimics (MIMs) basados en eTM35,78, imitaciones de objetivo en tándem corto (STTMs)22,53, un enfoque de señuelo de miRNA con TM integrados en el UTR de 3' de transcripciones codificantes de proteínas81, y esponges de miRNA que contienen sitios de unión de miRNA con dos desajustes centrales para apuntar a miRNAs (cmSP) 82. STTM consiste en dos sitios de unión de miARN con una protuberancia de desajuste de 3 nt, unidas por un espaciador de 48 nt que fue optimizado empíricamente. STTM desencadena la inhibición eficiente de los miRNAs objetivo22,53. La tecnología STTM se ha aplicado recientemente con éxito a un análisis funcional a gran escala de miRNAs de la planta modelo Arabidopsis y los principales cultivos como el arroz y el maíz. Esto llevó al descubrimiento de roles sin precedentes de varios miRNAs endógenos involucrados en el rendimiento y el control hormonal, lo que es muy prometedor para mejorar el mejoramiento de cultivos47. Basándonos en estas ventajas del diseño STTM, elegimos STTM y lo integramos en el vector PVX para la caracterización funcional de miRNAs en papa. Vale la pena señalar que los diversos diseños de moléculas de MT, como cmSP, MIM y STTM, tienen eficacias variables en el bloqueo de la función de diferentes miRNAs82. Por lo tanto, el uso de varias estrategias de diseño de MT puede ayudar a lograr una supresión de miRNA más efectiva. La longitud y el contexto de secuencia de la protuberancia no igualada, así como las alteraciones de nucleótidos adyacentes a los sitios de unión de miRNA también pueden necesitar ser optimizados para un resultado específico de silenciamiento de miRNA22,36,38,78,83. Además, el diseño de moléculas de MT bajo la guía de predicciones computacionales junto con el análisis experimental probablemente conducirá a una inhibición más confiable de miRNAs84.

Se demostró que el sistema VIGS basado en PVX es efectivo para desencadenar el silenciamiento de ARN tanto en especies de Solanum diploides como cultivadas. El silenciamiento sistémico basado en PVX se induce y mantiene en todos los tejidos foliares de plantas de papa propagadas in vitro durante varios ciclos y en microtuberculos generados in vitro85. Recientemente hemos informado que el sistema VIGS basado en PVX puede silenciar genes de interés en varios cultivares de papa tetraploide, como Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard y Serrana86. Queda por determinar si el efecto VbMS basado en PVX puede transmitirse y mantenerse durante varias generaciones a través de la propagación vegetativa en la papa. Los enfoques transgénicos para introducir moléculas de MT de manera estable en las plantas de papa todavía se recomiendan cuando los efectos silenciadores de los miRNAs de interés deben mantenerse en las generaciones posteriores.

Se han identificado numerosos miRNAs involucrados en el crecimiento y desarrollo de la papa. El ARN-seq, la secuenciación del genoma y la predicción bioinformática han facilitado en gran medida la identificación de miRNAs y sus dianas17,19,20,21. Hasta el momento, se han secuenciado tres genomas de papa, incluyendo un clon monoploide doble de S. tuberosum Phureja del grupo Phureja DM1-3, una especie diploide silvestre S. commersonii y un clon consanguíneo diploide M6 de S. chacoense87,88,89. Hasta la fecha, solo se ha caracterizado funcionalmente un número limitado de miRNAs de papa, en la mayoría de los casos utilizando tecnología TM. Por ejemplo, el homólogo FLOWERING LOCUS T (FT) SP6A actúa como una señal móvil para controlar la tuberización en la papa y es dirigido por un miRNA, suprimiendo la expresión de SP6A (SES), que media la escisión inducida por calor de la transcripción SP6A90,91. La sobreexpresión de SES mediada por STTM bloquea la actividad del miRNA de SES y facilita la tuberización incluso en condiciones de calor continuo91. La eliminación de miR160, un miRNA involucrado en la respuesta inmune, por el enfoque eTM mostró que miR160 es necesario tanto en la resistencia adquirida local como sistémica contra Phytophthora infestans en papa92.

Utilizando un enfoque bioinformático, se identificaron ocho familias únicas de miRNAs que se dirigen a los receptores inmunes de repetición rica en leucina (NLR) del sitio de unión a nucleótidos en papa y tomate93. Una de las familias de miRNA, miR482/2118, se dirige a varios NLR que confieren resistencia a diversos patógenos y la supresión de los miRNAs de la familia miR482/2118 mediada por la expresión transgénica de constructos STTM conduce a una mayor resistencia en el tomate contra P. infestans y Pseudomonas syringae13. La creciente evidencia sugiere que los pequeños ARN producidos en patógenos y huéspedes pueden viajar entre los dos organismos y suprimir la expresión génica del otro mediada por la interferencia de ARN entre reinos94,95,96,97. Por ejemplo, los imitadores objetivo de un ARSN derivado de patógenos de ovocitos pueden eliminar estos ARNs invasores y reducir la infección por patógenos61. Sería interesante examinar si el actual sistema VbMS se puede emplear para atacar los ARNs derivados de patógenos para mejorar la resistencia en las plantas.

En resumen, el sistema de silenciamiento de miRNA basado en virus es rápido y rentable y se puede realizar en un formato de alto rendimiento. El sistema VbMS basado en PVX proporciona una herramienta genética eficiente y robusta para determinar la función de familias específicas de miRNAs o miRNA y los genes diana.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Yule Liu de la Universidad de Tsinghua por proporcionar el vector PVX-LIC. Este trabajo fue apoyado por un fondo de puesta en marcha de Texas A&M AgriLife Research y el Proyecto Hatch TEX0-1-9675 del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA a JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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Ciencias Ambientales Número 159 silenciamiento de microARN basado en virus (VbMS) virus de la papa X (PVX) microARN (miRNA) imitación de diana (TM) imitación de diana en tándem corto (STTM) Solanum tuberosum
Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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