Summary
Het doel van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test is om oxidatieve stress in biologische monsters te beoordelen door de productie van lipide peroxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde, te meten met behulp van zichtbare golflengtespectrofotometrie bij 532 nm. De hier beschreven methode kan worden toegepast op menselijk serum, cellysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid.
Abstract
Ondanks zijn beperkte analytische specificiteit en robuustheid, is de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen (TBARS) -test op grote schaal gebruikt als een generieke metriek voor lipideperoxidatie in biologische vloeistoffen. Het wordt vaak beschouwd als een goede indicator van de niveaus van oxidatieve stress in een biologisch monster, op voorwaarde dat het monster op de juiste manier is behandeld en opgeslagen. De test omvat de reactie van lipideperoxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde (MDA), met thiobarbiturinezuur (TBA), wat leidt tot de vorming van MDA-TBA2-adducten genaamd TBARS. TBARS levert een rood-roze kleur op die spectrofotometrisch gemeten kan worden bij 532 nm. De TBARS-test wordt uitgevoerd onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C. Zuivere MDA is onstabiel, maar deze omstandigheden maken het mogelijk om MDA vrij te maken uit MDA bis (dimethylacetaal), dat in deze methode als analytische standaard wordt gebruikt. De TBARS-test is een eenvoudige methode die in ongeveer 2 uur kan worden voltooid. De bereiding van assay-reagentia wordt hier in detail beschreven. Prijsbewuste onderzoekers kunnen deze reagentia voor meerdere experimenten tegen lage kosten gebruiken in plaats van een dure TBARS-testkit te kopen die alleen de constructie van een enkele standaardcurve mogelijk maakt (en dus slechts voor één experiment kan worden gebruikt). De toepasbaarheid van deze TBARS-test wordt aangetoond in menselijk serum, lipoproteïnen met lage dichtheid en cellysaten. De test is consistent en reproduceerbaar en detectiegrenzen van 1,1 μM kunnen worden bereikt. Aanbevelingen voor het gebruik en de interpretatie van de spectrofotometrische TBARS-test worden gegeven.
Introduction
Lipideperoxidatie is een proces waarbij vrije radicalen, zoals reactieve zuurstofsoorten en reactieve stikstofsoorten, koolstof-koolstof dubbele bindingen in lipiden aanvallen, een proces waarbij een waterstof uit een koolstof wordt gewonnen en een zuurstofmolecuul wordt ingebracht. Dit proces leidt tot een mengsel van complexe producten, waaronder lipide peroxylradicalen en hydroperoxiden als primaire producten, evenals malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenaal als overheersende secundaire producten1.
MDA is veel gebruikt in biomedisch onderzoek als een marker van lipideperoxidatie vanwege de gemakkelijke reactie met thiobarbiturinezuur (TBA). De reactie leidt tot de vorming van MDA-TBA2, een conjugaat dat absorbeert in het zichtbare spectrum bij 532 nm en een rood-roze kleur produceert2. Andere moleculen afgeleid van lipideperoxidatie naast MDA kunnen ook reageren met TBA en licht absorberen bij 532 nm, wat bijdraagt aan het totale absorptiesignaal dat wordt gemeten. Evenzo kan MDA reageren met de meeste andere belangrijke klassen van biomoleculen, waardoor de toegankelijkheid voor reactie met TBA3,4 mogelijk wordt beperkt. Als zodanig wordt deze traditionele test eenvoudigweg beschouwd als het meten van "thiobarbiturinezuur reactieve stoffen" of TBARS5.
Wanneer de TBARS-test correct wordt toegepast en geïnterpreteerd, wordt deze over het algemeen beschouwd als een goede indicator van de totale niveaus van oxidatieve stress in een biologisch monster6. Helaas, zoals gedocumenteerd door Khoubnasabjafari en anderen, wordt de TBARS-test vaak uitgevoerd en geïnterpreteerd op manieren die dubieuze conclusies mogelijk maken3,4,7,8,9,10,11. De oorzaken hiervoor zijn voornamelijk geworteld in steekproefgerelateerde pre-analytische variabelen en een gebrek aan assay-robuustheid die schijnbaar kleine variaties in het assayprotocol verbiedt zonder substantiële veranderingen in assayresultaten1,7,12,13.
Preanalytische variabelen met betrekking tot de hantering en opslag van biospecimenen (bv. bloedplasma dat tijdelijk op -20 °C wordt gehouden)14,15 kunnen een grote invloed hebben op de resultaten van de TBARS-test16,17; zozeer zelfs dat de resultaten van TBARS-assays niet tussen verschillende laboratoria mogen worden vergeleken, tenzij dit wordt gerechtvaardigd door expliciete interlaboratoriumanalyseve validatiegegevens. Deze aanbeveling is vergelijkbaar met hoe western blots vaak worden gebruikt en geïnterpreteerd. Vergelijkingen van banddichtheden zijn geldig voor binnen-blot en misschien binnen-laboratoriumstudies, maar het vergelijken van banddichtheden tussen laboratoria wordt over het algemeen als een ongeldige praktijk beschouwd.
Sommige onderzoekers hebben gesuggereerd dat MDA zoals gemeten door de TBARS-test eenvoudigweg niet voldoet aan de analytische of klinische criteria die vereist zijn voor een aanvaardbare biomarker3,9,10,18,19. Inderdaad, als de test niet meer dan 50 jaar geleden was ontwikkeld, zou het waarschijnlijk niet het wijdverspreide gebruik en de stilzwijgende aanvaardbaarheid hebben gekregen die het vandaag heeft. Hoewel er andere assays zijn met een grotere analytische gevoeligheid, specificiteit en robuustheid die worden gebruikt voor het bepalen van oxidatieve stress, blijft de TBARS-assay op basis van absorptie bij 532 nm veruit een van de meest gebruikte assays voor de bepaling van lipideperoxidatie20, en daarmee beoordeling van oxidatieve stress.
De TBARS-test is alleen te vinden als een dure kit (meer dan 400 Amerikaanse dollars), waarin de instructies geen gedetailleerde informatie geven over de meeste concentraties van de gebruikte reagentia. Bovendien kunnen de meegeleverde reagentia slechts voor één experiment worden gebruikt, omdat er slechts één colorimetrische standaardcurve per kit kan worden gemaakt. Dit kan problematisch zijn voor onderzoekers die van plan zijn om niveaus van oxidatie te bepalen binnen een paar monsters op verschillende tijdstippen, omdat dezelfde standaardcurve niet op meerdere tijdstippen kan worden gebruikt. Daarom moeten meerdere kits worden gekocht voor meerdere experimenten. Momenteel is er, tenzij een dure kit wordt gekocht, geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor het uitvoeren van een TBARS-test. Sommige onderzoekers hebben in het verleden vaag beschreven hoe een TBARS-assay21,22 moet worden uitgevoerd, maar noch een volledig gedetailleerd protocol of uitgebreide video over het uitvoeren van de TBARS-test zonder een dure kit is beschikbaar in de literatuur.
Hier rapporteren we een gedetailleerde, analytisch gevalideerde methodologie voor doeleinden over het uitvoeren van een TBARS-test op een eenvoudige, reproduceerbare en goedkope manier. Veranderingen in de lipideperoxidatie van menselijk serum, HepG2-lysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid bij behandeling met Cu(II)-ionen worden aangetoond als illustratieve toepassingen voor de TBARS-test. De resultaten tonen aan dat deze TBARS-test consistent en reproduceerbaar is op een dagelijkse basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke serummonsters werden verkregen van instemmende vrijwilligers onder IRB-goedkeuring en volgens de principes die zijn uitgedrukt in de Verklaring van Helsinki. Monsters werden gecodeerd en gedeïdentificeerd voordat ze naar het analytisch laboratorium werden overgebracht.
1. Monstervoorbereiding
- HepG2-cellysaten
- Zaai ongeveer 10 x 106 HepG2-cellen per kolf in 16 T75-kolven met 14 ml EMEM-media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en kweekcellen gedurende 2 dagen.
- Bereid RIPA-buffer voor: voeg in een buis van 50 ml 1,5 ml 5 m NaCl, 2,5 ml 1 m Tris-HCl (pH = 7), 500 μl NP-40-reagens toe en breng het uiteindelijke volume vervolgens op 50 ml met DI-water.
- Bereid lysisbuffer voor: aliquot 20 ml RIPA-buffer in een buis van 50 ml en voeg 200 μl van een 100x proteaseremmeroplossing toe om eiwit- en lipideafbraak te remmen. Bewaren bij 4 °C.
OPMERKING: Lysisbuffer is compatibel met TBARS-reagentia en interfereert niet met de absorptie bij 532 nm. Als u van plan bent een andere lysisbuffer te gebruiken of extra ingrediënten aan de lysisbuffer toe te voegen, moeten voorbereidende validatiestudies worden uitgevoerd om te verifiëren of lysisbuffercomponenten compatibel zijn met de TBARS-test. - Verwijder media met 10% FBS en was de cellen 2x met 5 ml koude, steriele 1x PBS.
- Voeg 1 ml lysisbuffer toe aan de T75-kolven die de cellen bevatten en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) met constant wervelen om ervoor te zorgen dat de buffer goed wordt verdeeld.
- Verzamel lysaten in de juiste geëtiketteerde 2 ml snap-cap polypropyleen buizen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Draai de lysaten op 5.000 x g gedurende 10 minuten bij RT om celresten te verzamelen en zuig supernatanten op in een enkele buis van 15 ml.
- Concentraat cellysaat supernatant viervoudig met behulp van een Speed Vac bij 50 °C en 3 mbar en maak aliquots van 94 μL elk in 2 ml snap-cap polypropyleen buizen. Bewaar monsters bij -80 °C totdat ze worden gebruikt voor in vitro oxidatie en/of TBARS-assay.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de cel lysaat supernatant wordt geconcentreerd, kunnen cellen ook worden losgemaakt met behulp van 3 ml 1x trypsine, geneutraliseerd met 6 ml media en 2x gewassen met 5 ml koude PBS. Celkorrels kunnen vervolgens worden gereconstitueerd in 250 μL lysisbuffer en vervolgens kunnen stappen 1.1.6 en 1.1.7 worden uitgevoerd. - Bereid een 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4).
- Bereid azijnzuuroplossing (pH = 4): Verdun 1 μL ijsazijn in 100 ml DI-water (pH moet ongeveer 4 zijn, maar bevestig dit met een pH-meter). Voeg meer water of azijnzuur toe om de pH op 4 te zetten.
- Gewicht ongeveer 0,1936 g koper II-chloride en los op in 10 ml van de azijnzuuroplossing (pH = 4) om een CuCl2-kolf van 144 mM te maken. Vul 490 μL uit deze oplossing en voeg toe aan 1.510 μL azijnzuur (pH = 4) om een CuCl2-oplossing van 35 mM te maken.
- Aliquot 6 μL uit de 35 mM CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 94 μL cellysaat bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ongeveer 2 mM te maken. Voeg 6 μL van een azijnzuuroplossing (pH = 4) zonder CuCl2 toe aan zes monsters met 94 μL cellysaten om als controle te gebruiken. Het uiteindelijke volume cellysaat moet 100 μL zijn, wat zal worden gebruikt voor de TBARS-test.
OPMERKING: Het maken van de 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4) is noodzakelijk om precipitatie van koperhydroxide te voorkomen. - Incubeer monsters in een oven bij 37 °C gedurende 24 uur en voer een TBARS-test uit op elk monster met een eindvolume van 100 μL.
- Herhaal stap 1.1.9 en 1.1.11 2x op afzonderlijke dagen om de reproduceerbaarheid van de TBARS-test voor HepG2-cellysaten te controleren.
- Lipoproteïnen met lage dichtheid
OPMERKING: Typisch, voorgezuiverd lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) bevat een bepaalde hoeveelheid EDTA. LDL-monsters die hier worden gebruikt, bevatten 0,01% EDTA. EDTA kan de in vitro Cu(II)-gemedieerde oxidatie van LDL remmen. Daarom kan het nodig zijn om EDTA uit LDL-monsters te verwijderen voorafgaand aan experimenten of analyse. Stappen 1.2.1–1.2.5 beschrijven dit proces.
LET OP: Natriumhydroxide is corrosief en veroorzaakt irritatie in huid en ogen. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.- Aliquot 24 μL uit een 5,51 mg / ml LDL-voorraad (eiwitconcentratie bepaald door gemodificeerde Lowry-methode met BSA als standaard) in correct gelabelde 1 ml snap-cap polypropyleenbuizen. Maak zoveel aliquots als nodig is en bewaar bij 4 °C tot gebruik in oxidatie en/of TBARS-assay.
- Bereid een HEPES-buffer van 10 mM in 0,15 M NaCl, aangepast tot pH = 7 met NaOH-kralen: los 4,39 g NaCl op in 0,49 l water en voeg vervolgens 1,19 g HEPES toe. Los goed op met een roerstaaf. Voeg natriumhydroxideparels toe tot de pH 7 is. Verdun tot 0,5 L met water. Buffer bewaren bij 4 °C en binnen 3 maanden gebruiken.
- Voeg 476 μL van de 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) toe aan de aliquoted LDL-monsters om het uiteindelijke volume op 500 μL te brengen. Voeg verdund LDL-monster toe aan een centrifugaal spinfilterapparaat van 0,5 ml met een afsnijding van het molecuulgewicht van 100 K.
- Spin monsters bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij RT, waardoor een eindretentaatvolume van ongeveer 30 μL overblijft. Reconstitueer monsters in 480 μL van de 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) en draai opnieuw bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij RT. Voer deze stap 2x uit voor een totaal van vier spin-throughs.
- Plaats het filterapparaat ondersteboven in een nieuwe polypropyleen buis met snap-cap van 2 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 x g om LDL-monster te verzamelen (eindvolume = ongeveer 30 μL).
- Aliquot monster in de juiste gelabelde buis van 1 ml en voeg 20 μL water toe aan elk monster om een eindvolume van 50 μL te bereiken.
- Bereiding van 200 μM CuCl2 stamoplossing in azijnzuur (pH = 4)
- Azijnzuuroplossing bereiden (pH = 4): zie stap 1.1.9.1.
- Bereid een CuCl2-stamoplossing van 144 mM (zie stap 1.1.9.2), vervolgens 5,5 μL uit de CuCl2-voorraad van 144 mM en los op in een eindvolume van 4 ml azijnzuur (pH = 4) om de 200 μM-oplossing te maken.
- Aliquot 2,7 μL uit de 200 μM CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 50 μL LDL bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ~ 10 μM te bereiken. Voeg 2,7 μL uit een azijnzuuroplossing (pH = 4) die geen CuCl2 bevat toe aan zes monsters met 50 μL LDL die voor de controles moeten worden gebruikt.
- Incubeer LDL-monsters gedurende 2 uur in een oven bij 37 °C. Breng na 2 uur het uiteindelijke volume op 100 μL voor elk monster met 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7). Voer onmiddellijk een TBARS-test uit.
- Herhaal stap 1.2.3–1.2.9 2x op twee verschillende dagen om de reproductiviteit van de TBARS-test te testen.
- Menselijk serum
- Maak van een menselijk serummonster aliquots van elk 94 μL in 2 ml karapropyleenbuizen met snap-cap en bewaar monsters bij -80 °C.
- Bereid een 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4): zie stap 1.1.9.
- Aliquot 6 μL uit de CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 94 μL menselijk serum bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ongeveer 2 mM te maken. Voeg 6 μL van een azijnzuuroplossing (pH = 4) zonder CuCl2 toe aan zes monsters met 94 μL menselijk serum om als controle te gebruiken.
- Incubeer menselijke serummonsters gedurende 24 uur in een oven bij 37 °C en bepaal de oxidatieniveaus met de TBARS-test (rubriek 4).
- Herhaal stap 1.3.2–1.3.4 2x op twee afzonderlijke dagen om de reproduceerbaarheid van de TBARS-test te bepalen.
2. Reagensvoorbereiding
LET OP: Thiobarbiturinezuur veroorzaakt huid- en oogirritatie en kan schadelijk zijn bij inademing of huidabsorptie. Azijnzuur kan bij inademing inwendige organen beschadigen. Bereid alle zure oplossingen in een zuurkast.
- Bereiding van 8,1% (m/v) natriumdodecylssulfaat (SDS)-oplossing
- Weeg 32,4 g SDS uit en los op in 350 ml DI-water in een bekerglas. Gebruik een magnetische roerstaaf om SDS voorzichtig op te lossen en te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Breng het uiteindelijke volume op 400 ml met di-water en bewaar de SDS-oplossing bij RT.
OPMERKING: Hier wordt overtollige 8,1% SDS-oplossing bereid; voor 96 monsters is echter slechts ongeveer 20 ml van de 8,1% SDS-oplossing nodig. Bereid deze oplossing voor op basis van het aantal monsters dat wordt geanalyseerd.
- Weeg 32,4 g SDS uit en los op in 350 ml DI-water in een bekerglas. Gebruik een magnetische roerstaaf om SDS voorzichtig op te lossen en te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Breng het uiteindelijke volume op 400 ml met di-water en bewaar de SDS-oplossing bij RT.
- Bereiding van 3,5 M natriumacetaatbuffer (pH = 4)
- Verdun 100 ml ijsazijn in 350 ml DI-water in een bekerglas. Gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.
- Bereid een 6,5 M NaOH-oplossing met natriumhydroxideparels in water. Los 13 g NaOH-kralen op in 40 ml DI-water en breng tot een eindvolume van 50 ml met DI-water.
- Voeg langzaam ongeveer 46 ml van de 6,5 M NaOH-oplossing toe aan de azijnzuuroplossing terwijl u mengt met de roerstaaf (dit zou de pH tot 4 moeten verhogen, maar bevestig door langzaam de NaOH-oplossing toe te voegen tijdens het meten met behulp van een pH-meter).
- Breng het uiteindelijke volume op 500 ml met DI-water en bewaar natriumacetaatbuffer bij RT.
- Bereiding van 0,8% waterige oplossing van thiobarbiturinezuur (aangepast aan pH = 4)
OPMERKING: In deze stap is de bereiding van thiobarbiturinezuur geoptimaliseerd voor grote volumes, omdat een groot aantal monsters zal worden geanalyseerd (108 monsters, exclusief de normen). Bereid deze oplossing voor afhankelijk van het aantal monsters dat voor analyse is gepland.- Bereid een natriumhydroxideoplossing van 5 M met natriumhydroxideparels en water: los 4 g natriumhydroxideparels op in een eindvolume van 20 ml water. Bewaren in een plastic bakje. Deze oplossing moet voor elke batch vers worden bereid.
- Gewicht 4 g thiobarbiturinezuur en voeg 450 ml DI-water toe. Gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.
OPMERKING: Deze oplossing zal uiteindelijk worden gebracht tot een totaal volume van 500 ml. - Voeg tijdens het oplossen van thiobarbiturinezuur met een roerstaaf (langzaam en druppelsgewijs) ongeveer 3 ml van de 5 M NaOH-oplossing toe in stappen van 100 μL. Na toevoeging van de NaOH-oplossing zullen de thiobarbiturinezuurdeeltjes beginnen op te lossen.
- Als de thiobarbiturinezuurdeeltjes nog steeds niet volledig zijn opgelost, voeg dan meer van de 5 M NaOH-oplossing toe in stappen van 100 μL totdat alle thiobarbiturinezuurdeeltjes volledig zijn opgelost. Voor dit specifieke volume oplossing wordt in totaal 4 ml van de 5 M NaOH-oplossing toegevoegd om de thiobarbiturinezuurdeeltjes volledig op te lossen.
OPMERKING: Bij deze concentratie zal thiobarbiturinezuur niet volledig oplossen tenzij de pH bijna 4 is. - Stop met het toevoegen van NaOH nadat al het thiobarbiturinezuur volledig is opgelost. Vermijd het overschrijden van een pH van 4. De uiteindelijke pH kan worden gecontroleerd door 1 μL uit de mengoplossing thiobarbiturinezuur te nemen en deze op pH-papier te plaatsen.
- Breng het uiteindelijke volume op 500 ml met di-water en bewaar waterige 0,8% thiobarbiturinezuuroplossing bij RT.
3. Malondialdehyde bis(dimethylacetaal) standaard monstervoorbereiding
OPMERKING: Malondialdehyde (MDA) is onstabiel en niet in de handel verkrijgbaar. Er zijn echter verschillende chemische vormen van MDA die in de handel verkrijgbaar zijn, zoals MDA tetrabutylammoniumzout, MDA bis (dimethylacetaal) en MDA bis (diethylacetaal). Van deze drie chemische vormen wordt hier MDA bis (dimethylacetaal) gebruikt, omdat een meerderheid van de studies dezelfde standaard gebruikt21,22. Als u ervoor kiest om de andere twee chemische vormen van MDA te gebruiken, moet vooraf worden gevalideerd of ze geschikt zijn.
- Bereid een 550 μM MDA bis(dimethylacetaal)stamoplossing door 92 μL zuivere MDA bis(dimethylacetaal) te verdunnen in 1 L DI-water. Gebruik een magnetische roerstaaf om de oplossing gedurende 10 minuten grondig te mengen. Bewaar de oplossing bij 4 °C en gebruik deze binnen 1 maand.
- Bereid een 200 μM MDA bis(dimethylacetaal) door 726 μL uit de 550 μM MDA bis(dimethylacetaal)voorraad te verdunnen in 1274 μL DI-water. Deze 200 μM MDA bis(dimethylacetaal)oplossing moet vers worden bereid telkens wanneer een TBARS-test wordt uitgevoerd.
- Standaardcurvevoorbereiding: neem acht polypropyleenbuizen van 2 ml met snap-cap en label ze met de letters A tot en met H. Voeg MDA bis (dimethylacetaal) toe uit de voorraad van 200 μM en verdun in water zoals beschreven in tabel 1.
- Neem acht glazen buizen (13 mm x 100 mm) en label ze A-H en voeg vervolgens 100 μL standaard toe aan de overeenkomstige buizen. Voer zes replicaties uit voor de blanco standaard (monster A) om de detectiegrenzen van de TBARS-test te berekenen.
OPMERKING: Het protocol kan hier niet langer dan 1 uur worden gepauzeerd.
4. TBARS-test
OPMERKING: Zodra de TBARS-test is gestart, moet deze worden voltooid zonder te stoppen.
- Neem zoveel glazen buizen als nodig is voor het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd en label ze met de namen van de monsters. Voeg vervolgens 100 μL van elk voorbereid monster (zoals hierboven beschreven) toe aan elke glazen buis.
- Voeg 200 μL van 8,1% SDS toe aan elk monster en standaard en draai de glazen buis voorzichtig in een cirkelvormige beweging om het monster te mengen.
- Voeg 1,5 ml van de 3,5 M natriumacetaatbuffer (pH = 4) toe aan elk monster en elke standaard.
- Voeg 1,5 ml van de waterige 0,8% thiobarbiturinezuuroplossing (pH = 4) toe aan elk monster en standaard.
- Breng het uiteindelijke volume op 4 ml voor elk monster en standaard door 700 μL DI-water toe te voegen.
- Sluit elke glazen buis goed af en incubeer in een verwarmingsblok dat gedurende 1 uur op 95 °C is ingesteld. Bedek de glazen buizen met aluminiumfolie om condensatie aan de bovenkant van de buizen te voorkomen.
- Verwijder de glazen buizen uit het verwarmingsblok en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer monsters en normen bij 1500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar na het centrifugeren de glazen buizen met de monsters en normen bij RT.
OPMERKING: Als u de monsters op ijs of bij 4 °C bewaart, zal het gehele monster of de standaard neerslaan. - Onmiddellijk na het centrifugeren, aliquot 150 μL supernatant uit elke buis en plaats in een aparte put van een 96 putplaat.
- Verwijder eventuele bubbels uit elke put met behulp van een pipetpunt.
OPMERKING: De aanwezigheid van bubbels zal inconsistente absorptiemetingen opleveren, wat leidt tot een hoge onnauwkeurigheid van de test. - Lees absorpties af bij 532 nm. Trek de gemiddelde absorptiewaarde van de blancomonsters af van alle andere absorptiemetingen.
- Maak een standaardcurve door de blanco-afgetrokken absorptiemetingen uit te zetten op 532 nm versus de bekende concentratie van elke standaard. Pas de gegevenspunten aan met lineaire regressie. Bereken onbekende monsterconcentraties met behulp van de vergelijking van de lineaire regressielijn die wordt verkregen uit de standaardcurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C levert malondialdehyde (MDA) bis(dimethylacetaal) MDA23 op. MDA en nauw verwante chemische congeneren reageren met twee moleculen thiobarbiturinezuur (TBA) om verbindingen te produceren die thiobarbiturinezuurreactieve stoffen (TBARS) worden genoemd, die een roodroze kleur geven en een absorptie λmax hebben bij 532 nm (figuur 1, figuur 2). Met MDA bis (dimethylacetaal) als standaard werden standaardcurven gegenereerd (figuur 3, tabel 1) om de detectie- en gevoeligheidsgrenzen van de test en oxidatieniveaus in drie verschillende biologische monsters te bepalen. In totaal werden negen TBARS-assays uitgevoerd om de niveaus van oxidatie in de drie verschillende monsters op verschillende dagen te bepalen. Daarom werden in totaal negen standaardcurven gegenereerd, zoals weergegeven in figuur 3. De kleinste kwadratenprocedure24 werd gebruikt om de standaardafwijkingen van de helling en de y-intercept te bepalen, die respectievelijk 8,67 x 10-6 en 5,66 x 10-4 waren.
De detectiegrenzen van de TBARS-test werden bepaald volgens standaard analyseprocedures25 door de absorptie van de blancomonsters (zes experimentele replicaties met twee technische replicaties per experimentele replicaat) op drie verschillende dagen te meten. Het minimaal te onderscheiden analytische signaal (Sm) werd bepaald door het gemiddelde van het blancosignaal (S̄bl) op te tellen plus een veelvoud k van de standaarddeviatie van de blanco (ksbl), waarbij k = 3. Dat wil zeggen, Sm = S̄bl+ ksbl. Met behulp van Sm en de helling van de standaardcurve (m) werd de detectiegrens (cm) berekend als cm = (Sm - S̄bl)/m. Uit de resulterende gegevens van de blancomonsters op drie verschillende dagen blijkt dat de minimale concentratie TBARS-stof die nodig is om een detecteerbaar niet-ruisabsorptiesignaal te geven, 1,1 μM is (tabel 2). De gevoeligheid van de TBARS-test is ongeveer 0,00160 absorptie-eenheden/μM, wat het vermogen van de test is om verschillen in analytconcentratie te onderscheiden (tabel 2).
Om de toepasbaarheid van de TBARS-test te illustreren bij het detecteren van veranderingen in lipideperoxidatie in verschillende biologische matrices, werd CuCl2 gebruikt om de in vitro oxidatie van menselijk serum, HepG2-cellysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid te induceren. Deze biologische monsters die hier worden gebruikt, zijn prototypes van biologische matrices. Op basis van de hier gepresenteerde resultaten voor HepG2-cellysaten is het bijvoorbeeld redelijk om te verwachten dat deze test zal werken met andere soorten cellysaat; het zou echter analytisch moeten worden gevalideerd voor dit doel. Van de drie biologische matrices die hier worden gebruikt, is het ook gebruikelijk dat bepaalde soorten monsters lage endogene concentraties TBARS vertonen. TBARS voor HepG2-cellysaten die niet met CuCl2 werden behandeld, lagen bijvoorbeeld net boven de detectiegrens van de test (ongeveer 2 μM; Figuur 4). Zoals te verwachten is bij lage signaal-ruisverhoudingen, is de standaardafwijking en variatiecoëfficiënt voor dit specifieke monster relatief hoog (tabel 3). Naarmate het signaal echter toeneemt als gevolg van Cu(II) gemedieerde oxidatie, wordt de variatiecoëfficiënt lager. In het algemeen, naarmate de absorptie boven de detectiegrens toeneemt, verbetert de reproduceerbaarheid van de test (tabel 3).
Voor de toepassing van dit protocol was er geen wens om antioxidanten te gebruiken om de in vitro Cu (II) -gemedieerde oxidatie van biologische monsters te maskeren. Commercieel bereid lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) kan 0,01% EDTA bevatten. EDTA voorkomt Cu(II)-gemedieerde oxidatie van LDL, maar niet noodzakelijkerwijs andere metaalgemedieerde oxidatiereacties26,27. Een TBARS-test werd uitgevoerd op LDL-monsters die EDTA bevatten en de niveaus van TBARS veranderden niet tussen de met Cu (II) behandelde en onbehandelde LDL-monsters (figuur 5A). Nadat EDTA echter was verwijderd door spinfiltratie (zie stap 1.2.3-1.2.5), onderging LDL Cu(II)-gemedieerde oxidatie, zoals gedetecteerd door de TBARS-test (figuur 5B).
Het normale bereik van lipideperoxidatieproducten in het menselijke serum van gezonde donoren, uitgedrukt in termen van MDA, ligt tussen 1,80-3,94 μM28. Om het dynamisch bereik van de TBARS-test in menselijk serum te illustreren, werd een concentratie van 2 mM Cu(II)-ionen aan de monsters toegevoegd, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur bij 37 °C. Dit resulteerde in een toename van 6x-7x in TBARS (figuur 6).
Figuur 1: Thiobarbiturinezuur reactieve stoffen testschema.
Honderd microliters monster of standaard worden toegevoegd aan een glazen buis van 13 mm x 100 mm, gevolgd door toevoeging van thiobarbiturinezuurreactieve stoffen (TBARS) reagentia. Na incubatie bij 95 °C gedurende 1 uur worden monsters en normen gedurende 30 minuten in ijs geïncubeerd en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1.500 x g gecentrifugeerd. Honderdvijftig microliter monster of standaard supernatant wordt op een 96-putplaat geladen en de absorptie wordt gemeten bij 532 nm. Onbekende monsterconcentratie wordt berekend met behulp van de vergelijking van de standaardcurve. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Archetype thiobarbiturinezuur reactieve stoffen reactie.
Malondialdehyde bis(dimethylacetaal) levert malondialdehyde op onder zuurgekatalyseerde hydrolyse1. Vrijgegeven Malondialdehyde (MDA) reageert vervolgens met twee moleculen van 2-thiobarbiturinezuur (TBA) (pH = 4 en 95 °C) om MDA-TBA2-adducten te vormen die een rood-roze kleur geven en spectrofotometrisch kunnen worden gemeten bij 532 nm. Omdat andere moleculen naast MDA die zijn afgeleid van geoxideerde lipiden ook kunnen reageren met TBA, wordt de absorptiemeting bij 532 nm eenvoudigweg een meting van thiobarbiturinezuurreactieve stoffen of TBARS genoemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Malondialdehyde bis(dimethylacetaal) colorimetrische standaardcurven.
Figuur toont negen standaardcurven zoals gemaakt op verschillende dagen. Sommige punten overlappen elkaar en zijn niet van elkaar te onderscheiden. Malondialdehyde bis (dimethylacetaal) werd versterkt in kalibratormonsters op 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 en 160 μM (zoals weergegeven in tabel 1; n = 1 per concentratiepunt per dag). De absorptie werd gemeten bij 532 nm, waarbij de gemiddelde absorptie van de blancomonsters werd afgetrokken van alle metingen in die batch, inclusief onbekenden. Elke dag werd de vergelijking gegenereerd door de kleinste kwadraten lineaire regressie gebruikt om TBARS in biologische monsters te bepalen. Voor alle negen standaardcurven samen was de standaarddeviatie van de helling 8,67 x 10-6 en de standaarddeviatie van de y-intercept 5,66 x 10-4. Standaardafwijkingen van de helling en y-intercept werden berekend met behulp van de kleinste kwadratenprocedure24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Oxidatie in HepG2-lysaten gedetecteerd door TBARS.
Zes HepG2-cellysaatmonsters werden geïncubeerd met 2 mM CuCl2 [HepG2-cellysaat + 2 mM Cu(II)] en zes monsters werden geïncubeerd in een oplossing zonder CuCl2 (HepG2-cellysaat) gedurende 24 uur bij 37 °C. Na incubatie werd de TBARS-test uitgevoerd op de 12 monsters. Deze procedure werd 2x herhaald gedurende in totaal drie verschillende dagen. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Asterisk geeft statistisch significante verschillen aan tussen controle en cu(II)-behandelde lysaten (p < 0,001). Statistische significantie werd bepaald met behulp van een Mann Whitney U-test in GraphPad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Oxidatie in lipoproteïne met lage dichtheid gedetecteerd door TBARS.
(A) TBARS-test uitgevoerd in LDL-monsters die 0,01% EDTA bevatten. Zes LDL-monsters werden geïncubeerd met 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], en zes monsters werden geïncubeerd met een controleoplossing zonder CuCl2 toegevoegd (Native LDL) gedurende 2 uur bij 37 °C. Vervolgens werd een TBARS-test uitgevoerd op de 12 monsters. "ns" vertegenwoordigt geen statistische significantie. (B) LDL werd gespleten met behulp van een centrifugaal spinfilterapparaat om EDTA te verwijderen. Vervolgens werd incubatie met en zonder toegevoegde Cu(II) opnieuw uitgevoerd zoals beschreven voor (A). De TBARS-test werd onmiddellijk daarna uitgevoerd. Dezelfde procedure werd 2x herhaald gedurende in totaal 3 dagen. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Asterisk geeft statistisch significante verschillen aan tussen controle- en Cu(II)-behandelde LDL-monsters (p < 0,001). Statistische significantie werd bepaald met behulp van de Mann Whitney U-test in GraphPad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Lipideperoxidatie in menselijke serummonsters gedetecteerd door TBARS.
Zes menselijke serummonsters werden geïncubeerd met 2 mM CuCl2 [serum + 2 mM Cu(II)], en zes monsters werden geïncubeerd met een oplossing waaraan gedurende 24 uur bij 37 °C geen CuCl2 (normaal serum) was toegevoegd. Na incubatie werd de TBARS-test uitgevoerd op de 12 monsters. Deze procedure werd op nog eens twee dagen herhaald. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Asterisk geeft statistisch significante verschillen aan tussen controle- en met Cu(II) behandelde serummonsters (p < 0,001). Statistische significantie werd bepaald met behulp van de Mann Whitney U-test in GraphPad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Glazen buis | 200 μM MDA bis (dimethylacetaal) (μL) | Water (μL) | MDA bis (dimethylacetaal) Eindconcentratie (μM) |
| Aa | 0 | 1000 | 0 |
| B | 12.5 | 987.5 | 2.5 |
| C | 25 | 975 | 5 |
| D | 50 | 950 | 10 |
| E | 100 | 900 | 20 |
| F | 200 | 800 | 40 |
| G | 400 | 600 | 80 |
| H | 800 | 200 | 160 |
Tabel 1: Malondialdehyde bis(dimethylacetaal) standaard monstervoorbereiding. Uit de vers bereide 200 μM malondialdehyde bis(dimethylacetaal) worden de voorgestelde volumes aliquoteerd om de uiteindelijke concentratie voor de standaardcurve te bereiken. Het wordt aanbevolen om ten minste zes replicaties van het blancomonster (A) per dag uit te voeren om de detectiegrenzen van de methode te bepalen.
| Dag | Absorptie | Sblb | Smc | Gevoeligheid (absorptie-eenheden/μM)d | cm (μM)e |
| 1 (n = 6) | 0.0412 | 0.000612 | 0.0430 | 0.00160 | 1.14 |
| 2 (n = 6) | 0.0415 | 0.000632 | 0.0433 | 0.00160 | 1.18 |
| 3 (n = 6) | 0.0413 | 0.000605 | 0.0431 | 0.00160 | 1.13 |
| Alle drie de dagen (n = 18) | 0.0413 | 0.000589 | 0.0431 | 0.00160 | 1.10 |
| een Absorptie van de blancomonsters op drie verschillende dagen met 6 herhalingen per dag. | |||||
| bSbl = standaardafwijking van de absorptie van de blancomonsters. | |||||
| cSm = Minimaal te onderscheiden analytisch signaal, dat werd bepaald door het gemiddelde van het blancosignaal (S̄bl) op te tellen plus een veelvoud k van de standaarddeviatie van de blanco (ksbl), waarbij k = 3. Dat wil zeggen; Sm = S̄bl + ksbl. | |||||
| d Gevoeligheid van de TBARS-assay, de helling van de standaardcurve. | |||||
| ecm = Detectiegrenzen, die werd berekend als cm = (Sm - S̄bl)⁄m, waarbij m = de helling van de standaardcurve. | |||||
Tabel 2: Detectiegrenzen van de TBARS-test.
| Lipoproteïne met lage dichtheid | Menselijk Serum | HepG2 Cell Lysate | |||
| Dag | % CV | Dag | % CV | Dag | % CV |
| 1 (n = 6) | 5.6 | 1 (n = 6) | 7.9 | 1 (n = 6) | 12.6 |
| 2 (n = 6) | 5.4 | 2 (n = 6) | 7.2 | 2 (n = 6) | 15.8 |
| 3 (n = 6) | 3.9 | 3 (n = 6) | 7.0 | 3 (n = 6) | 17.7 |
| Alle drie de dagen (n = 18)a | 7.4 | Alle drie de dagen (n = 18) | 9.8 | Alle drie de dagen (n = 18) | 15,5b |
| Met 10 μM CuCl2 | Met 2 mM CuCl2 | Met 2 mM CuCl2 | |||
| 1 (n = 6) | 4.5 | 1 (n = 6) | 6.0 | 1 (n = 6) | 5.8 |
| 2 (n = 6) | 6.5 | 2 (n = 6) | 4.3 | 2 (n = 6) | 6.0 |
| 3 (n = 6) | 6.7 | 3 (n = 6) | 6.2 | 3 (n = 6) | 8.0 |
| Alle drie de dagen (n = 18) | 6.1 | Alle drie de dagen (n = 18) | 5.6 | Alle drie de dagen (n = 18) | 7.3 |
| een Interday-precisie werd berekend door gegevens van alle drie de dagen te bundelen. | |||||
| b De precisie was beperkt omdat de resultaten in de buurt van de assay LOD lagen. | |||||
Tabel 3: Analytische reproduceerbaarheid van TBARS in drie verschillende biologische monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks zijn beperkingen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 en een gebrek aan geschiktheid voor vergelijking tussen laboratoria, is de TBARS-test een van de oudste29,30 maar de meest gebruikte assays om oxidatieve stress in biologische monsters te meten. De TBARS-test is een eenvoudige methode die slechts ongeveer 2 uur nodig heeft om uit te voeren, nadat alle vereiste reagentia zijn voorbereid. Hier hebben we in detail beschreven hoe deze test, inclusief standaardcurve, vele malen op een economische manier kan worden uitgevoerd (ongeveer $ 3,50 USD voor 96 monsters), zonder een dure kit te hoeven kopen voor elke batch monsters.
Alle stappen van de test zijn van cruciaal belang, maar er zijn enkele stappen die extra aandacht vereisen. De pH van het thiobarbiturinezuur mag bijvoorbeeld niet hoger zijn dan 4. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het toevoegen van de natriumhydroxideoplossing aan het thiobarbiturinezuur en voorkomen dat een pH van meer dan 4 wordt verkregen. Een zure omgeving is vereist om de reactie tussen MDA en TBA te laten optreden, en de MDA-standaard wordt vrijgegeven uit MDA bis (dimethylacetaal) door zuurgekatalyseerde hydrolyse. Daarom kan een hoge pH leiden tot onvoorspelbare en zeer variabele resultaten31.
Hoewel dit voor sommige lezers duidelijk kan zijn, is het ook van cruciaal belang om eventuele bubbels in de 96-putplaat te verwijderen voordat de absorptie wordt gemeten. De aanwezigheid van bubbels zal hoge absorptiewaarden en verschillen tussen replicaties opleveren, wat leidt tot een hoog percentage cv's. Bovendien mogen monsters na de incubatie van 1 uur bij 95 °C niet langer dan 30 minuten op ijs worden geïncubeerd, omdat dit het hele monster zal neerslaan en het verzamelen van een neerslagvrij supernatant moeilijk te bereiken zal zijn. Met name zijn er geen goede stoppunten zodra de TBARS-test is gestart. Het moet worden voltooid zodra het is gestart. Ten slotte zijn er veel mogelijke methodologische variaties die op deze test kunnen worden toegepast. Het hier beschreven algemene protocol kan verder worden aangepast (en gevalideerd) voor specifieke toepassingen, waaronder die waarbij de toevoeging van radicale aaseters of andere soorten antioxidanten voorafgaand aan de analyse vereist is.
Hoewel de TBARS-test populair is, is het belangrijk om te beseffen dat het geen moleculair specifieke test is. Talrijke chemisch reactieve carbonylbevattende organische moleculen, waaronder die afgeleid van andere geoxideerde biomoleculen dan lipiden, kunnen reageren met TBA en worden dus geteld als TBARS1,32,33,34. Bovendien worden de detectiegrenzen van de op absorptie gebaseerde TBARS-test niet veel beter dan ongeveer 1,1 μM, zoals bepaald door deze methode. De detectiegrenzen kunnen echter worden verbeterd door andere detectiemethoden te gebruiken. Spectrofluorometrie met excitatie bij 520 nm en emissie bij 550 nm bieden bijvoorbeeld een hogere gevoeligheid en betere detectiegrenzen, zoals eerder gesuggereerd door Jo en Ahn35. Op massaspectrometrie gebaseerde methoden kunnen zowel de specificiteit als de detectielimieten drastisch verbeteren. Zo is een GC-MS/MS met electron-capture negative-ion chemical ionization (ECNICI) methode gebruikt om het pentafluorbutarfoutivaat van MDA in humaan serum en urinemonsters te detecteren, met detectiegrenzen van 2 x 10-18 mol MDA op kolom36. Hier verbetert de chromatografische scheiding, in combinatie met tandem massaspectrometrie, ook de moleculaire specificiteit van de test dramatisch.
Niettemin is, net als bij andere metingen van oxidatieve processen in biologische monsters37,38, preanalytische monsterbehandeling van cruciaal belang voor de uitkomst van TBARS-metingen. Bloedplasmaopslag bij -20 °C resulteert bijvoorbeeld in langzame maar dramatische stijgingen van de MDA-concentraties39,40. Dus, blootstelling van biologische monsters aan ontdooide of zelfs gedeeltelijk ontdooide omstandigheden gedurende alles behalve een minimale hoeveelheid tijd moet worden verondersteld artefactuele verhoging van TBARS-niveaus te veroorzaken. Dit betekent dat zelfs bescheiden variabiliteit in de preanalytische behandeling en opslag van biospecimens die moeten worden vergeleken met behulp van de TBARS-test moet worden vermeden.
Gezien deze kanttekeningen met betrekking tot preanalytische variabiliteit en beperkte gevoeligheid en specificiteit, wordt aanbevolen dat de op absorptie gebaseerde TBARS-test alleen wordt gebruikt voor intralaboratorium algemene beoordeling of bereikbepalingsexperimenten. Deze toepassingen omvatten studies waarin relatieve TBARS-niveaus direct worden vergeleken tussen een of meer groepen biologisch vergelijkbare monsters die samen worden verwerkt of opgeslagen en gescheiden door slechts één variabele die volledig wordt gecontroleerd door onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Het hier gerapporteerde onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award no. R33 CA217702 en het Initiative for Maximizing Student Development (IMSD) programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
