Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Evaluering av oksidativt stress i biologiske prøver ved bruk av tiobarbitursyre reaktive stoffer analyse

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

Målet med tiobarbitursyre reaktive stoffer analysen er å vurdere oksidativt stress i biologiske prøver ved å måle produksjonen av lipid peroksidasjonsprodukter, primært malondialdehyd, ved hjelp av synlig bølgelengdespektrofotometri ved 532 nm. Metoden som er beskrevet her, kan brukes på humant serum, cellelysater og lipoproteiner med lav tetthet.

Abstract

Til tross for sin begrensede analytiske spesifisitet og robusthet, har den tiobarbiturinsyre reaktive stoffer (TBARS) analysen blitt mye brukt som en generisk beregning av lipidperoksidasjon i biologiske væsker. Det regnes ofte som en god indikator på nivåene av oksidativt stress i en biologisk prøve, forutsatt at prøven er riktig håndtert og lagret. Analysen innebærer reaksjon av lipidperoksidasjonsprodukter, hovedsakelig malondialdehyd (MDA), med tiobarbitursyre (TBA), noe som fører til dannelsen av MDA-TBA2-addukter kalt TBARS. TBARS gir en rød-rosa farge som kan måles spektrofotometrisk ved 532 nm. TBARS-analysen utføres under sure forhold (pH = 4) og ved 95 °C. Ren MDA er ustabil, men disse forholdene tillater frigjøring av MDA fra MDA bis (dimetylacetal), som brukes som analytisk standard i denne metoden. TBARS-analysen er en enkel metode som kan fullføres i ca. 2 timer. Utarbeidelse av analysereagenser er beskrevet i detalj her. Budsjettbevisste forskere kan bruke disse reagensene til flere eksperimenter til en lav pris i stedet for å kjøpe et dyrt TBARS-analysesett som bare tillater bygging av en enkelt standardkurve (og dermed bare kan brukes til ett eksperiment). Anvendelsen av denne TBARS-analysen er vist i humant serum, lipoproteiner med lav tetthet og cellelysater. Analysen er konsistent og reproduserbar, og grenser for påvisning av 1,1 μM kan nås. Anbefalinger for bruk og tolkning av den spektrofotometriske TBARS-analysen er gitt.

Introduction

Lipidperoksidasjon er en prosess der frie radikaler, som reaktive oksygenarter og reaktive nitrogenarter, angriper karbonkarbon doble bindinger i lipider, en prosess som innebærer abstraksjon av et hydrogen fra et karbon og innsetting av et oksygenmolekyl. Denne prosessen fører til en blanding av komplekse produkter, inkludert lipidperoksylradikaler og hydroperoksider som primærprodukter, samt malondialdehyd (MDA) og 4-hydroksynonenal som dominerende sekundære produkter1.

MDA har blitt mye brukt i biomedisinsk forskning som en markør for lipidperoksidasjon på grunn av sin facile reaksjon med tiobarbitursyre (TBA). Reaksjonen fører til dannelsen av MDA-TBA2, en konjugat som absorberer i det synlige spekteret ved 532 nm og produserer en rød-rosa farge2. Andre molekyler avledet fra lipidperoksidasjon i tillegg til MDA kan også reagere med TBA og absorbere lys ved 532 nm, noe som bidrar til det totale absorpsjonssignalet som måles. På samme måte kan MDA reagere med de fleste andre store klasser av biomolekyler, noe som potensielt begrenser tilgjengeligheten for reaksjon med TBA3,4. Som sådan anses denne tradisjonelle analysen ganske enkelt å måle "tiobarbiturinsyre reaktive stoffer" eller TBARS5.

Når den brukes og tolkes riktig, anses TBARS-analysen generelt som en god indikator på de generelle nivåene av oksidativt stress i en biologisk prøve6. Dessverre, som dokumentert av Khoubnasabjafari og andre, blir TBARS-analysen ofte utført og tolket på måter som letter tvilsomme konklusjoner3,4,7,8,9,10,11. Årsakene til dette er først og fremst forankret i prøverelaterte preanalytiske variabler og mangel på analyserosikkerhet som forbyr tilsynelatende små variasjoner i analyseprotokollen uten vesentlige endringer i analyseresultater1,7,12,13.

Preanalytiske variabler relatert til biospecimen håndtering og lagring (f.eks. blodplasma holdt midlertidig ved -20 °C)14,15 kan ha stor innvirkning på TBARS analyseresultater16,17; så mye at TBARS-analyseresultater ikke bør sammenlignes på tvers av forskjellige laboratorier, med mindre det er berettiget av eksplisitte interlaboratoriske analytiske valideringsdata. Denne anbefalingen er lik hvordan vestlige flekker ofte brukes og tolkes. Sammenligninger av båndtettheter er gyldige for innen-blot og kanskje innen laboratoriestudier, men sammenligning av båndtetthet mellom laboratorier anses generelt som en ugyldig praksis.

Noen forskere har antydet at MDA målt ved TBARS-analysen rett og slett ikke oppfyller de analytiske eller kliniske kriteriene som kreves av en akseptabel biomarkør3,9,10,18,19. Faktisk, hvis analysen ikke hadde blitt utviklet for over 50 år siden, ville den sannsynligvis ikke ha fått den utbredte bruken og stilltiende akseptabiliteten den har i dag. Selv om det finnes andre analyser med større analytisk følsomhet, spesifisitet og robusthet som brukes til å bestemme oksidativt stress, forblir TBARS-analysen basert på absorbans ved 532 nm langt en av de mest brukte analysene for bestemmelse av lipidperoksidasjon20, og dermed vurdering av oksidativt stress.

TBARS-analysen kan bare bli funnet som et dyrt sett (over 400 amerikanske dollar), der instruksjonene ikke gir detaljert informasjon om de fleste konsentrasjoner av reagensene som brukes. I tillegg kan reagensene som følger med bare brukes til ett eksperiment, fordi bare en kolorimetrisk standardkurve kan gjøres per sett. Dette kan være problematisk for forskere som har til hensikt å bestemme oksidasjonsnivåer innenfor noen få prøver på forskjellige tidspunkter, fordi den samme standardkurven ikke kan brukes flere ganger. Derfor må flere sett kjøpes for flere eksperimenter. For øyeblikket, med mindre et dyrt sett er kjøpt, er det ikke en detaljert protokoll tilgjengelig for hvordan du utfører en TBARS-analyse. Noen forskere tidligere har vagt beskrevet hvordan man utfører en TBARS-analyse21,22, men verken en fullstendig detaljert protokoll eller omfattende video om hvordan man utfører TBARS-analysen uten et dyrt sett er tilgjengelig i litteraturen.

Her rapporterer vi en detaljert, analytisk validert for-formål metodikk om hvordan du utfører en TBARS-analyse på en enkel, reproduserbar og billig måte. Endringer i lipidperoksidasjon av humant serum, HepG2-lysater og lipoproteiner med lav tetthet ved behandling med Cu(II)-ioner er demonstrert som illustrasjonsapplikasjoner for TBARS-analysen. Resultatene viser at denne TBARS-analysen er konsistent og reproduserbar fra dag til dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane serumprøver ble hentet fra samtykkende frivillige under IRB-godkjenning og i henhold til prinsippene uttrykt i Helsinkideklarasjonen. Prøvene ble kodet og av-identifisert før overføring til analyselaboratoriet.

1. Prøvepreparering

  1. HepG2 celle lysater
    1. Frø ca 10 x 106 HepG2 celler per kolbe i 16 T75 kolber med 14 ml EMEM media supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og vokse celler i 2 dager.
    2. Forbered RIPA buffer: i et 50 ml rør, tilsett 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40 reagens, og ta deretter det endelige volumet til 50 ml med DI-vann.
    3. Forbered lysisbuffer: Aliquot 20 ml RIPA-buffer i et 50 ml rør og tilsett 200 μL av en 100x proteasehemmerløsning for å hemme protein og lipidforringelse. Oppbevars ved 4 °C.
      MERK: Lysis buffer er kompatibel med TBARS reagenser og forstyrrer ikke absorbans ved 532 nm. Hvis du planlegger å bruke en annen lysisbuffer eller legge til flere ingredienser i lysisbufferen, må foreløpige valideringsstudier gjøres for å bekrefte at lysisbufferkomponenter er kompatible med TBARS-analysen.
    4. Fjern medier som inneholder 10% FBS og vask cellene 2x med 5 ml kaldt, sterilt 1x PBS.
    5. Tilsett 1 ml lysisbuffer i T75-kolber som inneholder cellene, og inkuber dem i 10 minutter ved romtemperatur (RT) med konstant virvlende for å sikre at bufferen er godt fordelt.
    6. Samle lysater i passende merket 2 ml snap-cap polypropylenrør og inkuber på is i 10 min.
    7. Snurr lysatene på 5000 x g i 10 minutter ved RT for å samle cellerester, og aspirer supernatanter i et enkelt 15 ml rør.
    8. Konsentrer cellelyse supernatant fire ganger ved hjelp av en Speed Vac ved 50 °C og 3 mbar og lag aliquots på 94 μL hver i 2 ml snap-cap polypropylenrør. Oppbevar prøver ved -80 °C til de brukes til in vitro oksidasjon og/eller TBARS-analyse.
      MERK: For å unngå å konsentrere cellelyset supernatant, kan celler også løsnes ved hjelp av 3 ml 1x trypsin, nøytralisert med 6 ml medier og vaskes 2x med 5 ml kald PBS. Cellepellets kan deretter rekonstitueres i 250 μL lysisbuffer, og trinn 1.1.6 og 1.1.7 kan deretter utføres.
    9. Forbered en 35 mM CuCl2 lagerløsning i eddiksyre (pH = 4).
      1. Forbered eddiksyreoppløsning (pH = 4): Fortynn 1 μL issyre i 100 ml DI-vann (pH skal være ca. 4, men bekreft dette med en pH-måler). Tilsett mer vann eller eddiksyre for å justere pH til 4.
      2. Vekt ut ca 0,1936 g kobber II klorid og oppløs i 10 ml eddiksyreoppløsning (pH = 4) for å lage en 144 mM CuCl2 lager. Aliquot 490 μL fra denne løsningen og tilsett 1510 μL eddiksyre (pH = 4) for å lage en 35 mM CuCl2-løsning .
    10. Aliquot 6 μL fra 35 mM CuCl2 lagerløsning og legg den til seks prøver som inneholder 94 μL cellelysat for å lage en endelig CuCl2-konsentrasjon på ca. 2 mM. Tilsett 6 μL eddiksyreoppløsning (pH = 4) som ikke har CuCl2 til seks prøver som inneholder 94 μL cellelysater som skal brukes som kontroller. Det endelige volumet av cellelysat skal være 100 μL, som er det som skal brukes til TBARS-analysen.
      MERK: Det er nødvendig å lage 35 mM CuCl2-lageroppløsningen i eddiksyre (pH = 4) for å forhindre utfelling av kobberhydroksid.
    11. Inkuber prøver i en ovn ved 37 °C i 24 timer og utfør en TBARS-analyse på hver prøve som inneholder et endelig volum på 100 μL.
    12. Gjenta trinn 1.1.9 og 1.1.11 2x på separate dager for å kontrollere reproduserbarheten til TBARS-analysen for HepG2-cellelysater.
  2. Lipoproteiner med lav tetthet
    MERK: Vanligvis inneholder pre-renset lipoprotein med lav tetthet (LDL) en viss mengde EDTA. LDL-prøver som brukes her inneholder 0,01% EDTA. EDTA kan hemme in vitro Cu(II)-mediert oksidasjon av LDL. Derfor kan det være nødvendig å fjerne EDTA fra LDL-prøver før eksperimenter eller analyser. Trinn 1.2.1–1.2.5 beskriver denne prosessen.
    FORSIKTIG: Natriumhydroksid er etsende og forårsaker irritasjon i hud og øyne. Bruk riktig personlig verneutstyr.
    1. Aliquot 24 μL fra en 5.51 mg / ml LDL lager (protein konsentrasjon bestemt av modifisert Lowry metode ved hjelp av BSA som standard) i riktig merket 1 ml snap-cap polypropylen rør. Lag så mange aliquots som nødvendig og oppbevar ved 4 °C til bruk i oksidasjons- og/eller TBARS-analyse.
    2. Forbered en 10 mM HEPES buffer i 0,15 M NaCl justert til pH = 7 med NaOH perler: oppløs 4,39 g NaCl i 0,49 L vann, og tilsett deretter 1,19 g HEPES. Oppløs godt med en rørestang. Tilsett natriumhydroksidperler til pH er 7. Fortynn til 0,5 L med vann. Oppbevar bufferen ved 4 °C og bruk innen 3 måneder.
    3. Tilsett 476 μL av HEPES-bufferen på 10 mM i 0,15 M NaCl (pH = 7) i de alisiterte LDL-prøvene for å bringe sluttvolumet til 500 μL. Tilsett fortynnet LDL-prøve til en 0,5 ml sentrifugal spinnfilterenhet med en 100K molekylvektavskjæring.
    4. Spinnprøver på 14 000 x g i 10 minutter ved RT, og etterlater et endelig retentate volum på ca. 30 μL. Rekonstituere prøver i 480 μL av 10 mM HEPES-bufferen i 0,15 M NaCl (pH = 7) og spinn igjen ved 14 000 x g i 10 minutter ved RT. Utfør dette trinnet 2x for totalt fire spin-throughs.
    5. Plasser filterenheten opp ned i et nytt 2 ml snap-cap polypropylenrør, og sentrifuge ved 1000 x g i 2 minutter for å samle LDL-prøve (sluttvolum = ca. 30 μL).
    6. Aliquot prøve i riktig merket 1 ml rør og tilsett 20 μL vann til hver prøve for å oppnå et endelig volum på 50 μL.
    7. Tilberedning av 200 μM CuCl2 lageroppløsning i eddiksyre (pH = 4)
      1. Forbered eddiksyreoppløsning (pH = 4): se trinn 1.1.9.1.
      2. Forbered en 144 mM CuCl2 lagerløsning (se trinn 1.1.9.2), deretter aliquot 5,5 μL fra 144 mM CuCl2-lageret og oppløs i et sluttvolum på 4 ml eddiksyre (pH = 4) for å lage 200 μM-løsningen.
    8. Aliquot 2,7 μL fra 200 μM CuCl2 lagerløsning og legg den til seks prøver som inneholder 50 μL LDL for å oppnå en endelig CuCl2-konsentrasjon på ~ 10 μM. Tilsett 2,7 μL fra en eddiksyreoppløsning (pH = 4) som ikke inneholder CuCl2 , til seks prøver som inneholder 50 μL LDL som skal brukes til kontrollene.
    9. Inkuber LDL-prøver i 2 timer i en ovn ved 37 °C. Etter 2 timer, ta det endelige volumet til 100 μL for hver prøve med 10 mM HEPES-buffer i 0,15 M NaCl (pH = 7). Utfør umiddelbart en TBARS-analyse.
    10. Gjenta trinn 1.2.3-1.2.9 2x på to forskjellige dager for å teste reproduktiviteten til TBARS-analysen.
  3. Menneskelig serum
    1. Fra en menneskelig serumprøve, lag aliquots på 94 μL hver til 2 ml snap-cap polypropylenrør og lagre prøver ved -80 °C.
    2. Forbered en 35 mM CuCl2 lagerløsning i eddiksyre (pH = 4): se trinn 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL fra CuCl2 lagerløsningen og legg den til seks prøver som inneholder 94 μL menneskelig serum for å lage en endelig CuCl2-konsentrasjon på ca. 2 mM. Tilsett 6 μL eddiksyreoppløsning (pH = 4) som ikke har CuCl2 til seks prøver som inneholder 94 μL humant serum som skal brukes som kontroller.
    4. Inkuber humane serumprøver i 24 timer i en ovn ved 37 °C og bestem oksidasjonsnivåer med TBARS-analyse (avsnitt 4).
    5. Gjenta trinn 1.3.2–1.3.4 2x på to separate dager for å fastslå reproduserbarheten til TBARS-analysen.

2. Reagens forberedelse

FORSIKTIG: Thiobarbituric acid forårsaker hud- og øyeirritasjon og kanskje skadelig ved innånding eller hudabsorpsjon. Eddiksyre kan skade indre organer ved innånding. Forbered alle syreløsninger i en avtrekkshette.

  1. Tilberedning av 8,1% (w/v) natriumdedylsulfat (SDS) oppløsning
    1. Vekt ut 32,4 g SDS og oppløs i 350 ml DI-vann i et beger. Bruk en magnetisk rørestang for å forsiktig oppløse SDS og unngå å lage bobler. Ta med endelig volum til 400 ml med DI-vann og lagre SDS-løsning hos RT.
      MERK: Her fremstilles overflødig 8,1% SDS-løsning; For 96 prøver er det imidlertid bare nødvendig med ca. 20 ml av 8,1 % SDS-løsningen. Forbered denne løsningen i henhold til antall prøver som analyseres.
  2. Tilberedning av 3,5 M natriumacetatbuffer (pH = 4)
    1. Fortynn 100 ml issyre i 350 ml DI-vann i et beger. Bruk en magnetisk rørestang for å forsiktig oppløse den.
    2. Forbered en 6,5 M NaOH-løsning ved hjelp av natriumhydroksidperler i vann. Løs opp 13 g NaOH perler i 40 ml DI-vann og ta med til et endelig volum på 50 ml med DI-vann.
    3. Tilsett langsomt ca. 46 ml av 6,5 M NaOH-oppløsningen til eddiksyreoppløsningen mens du blander med rørestangen (dette skal heve pH til 4, men bekreft ved å sakte legge til NaOH-løsningen mens du måler ved hjelp av en pH-måler).
    4. Ta det endelige volumet til 500 ml med DI-vann og lagre natriumacetatbuffer ved RT.
  3. Tilberedning av 0,8% vandig oppløsning av tiobarbitursyre (justert til pH = 4)
    MERK: I dette trinnet er forberedelse av tiobarbitursyre optimalisert for store volumer, siden et stort antall prøver kommer til å bli analysert (108 prøver, ikke inkludert standardene). Forbered denne løsningen avhengig av antall prøver som er planlagt for analyse.
    1. Forbered en 5 M natriumhydroksidoppløsning ved hjelp av natriumhydroksidperler og vann: oppløs 4 g natriumhydroksidperler i et sluttvolum på 20 ml vann. Oppbevars i en plastbeholder. Denne løsningen skal være ny forberedt for hvert parti.
    2. Vekt 4 g tiobarbitursyre og tilsett 450 ml DI-vann. Bruk en magnetisk rørestang for å forsiktig oppløse den.
      MERK: Denne løsningen vil etter hvert bli brakt til et totalt volum på 500 ml.
    3. Mens du oppløser tiobarbitursyre med en rørestang, tilsett (sakte og på en dråpevis måte) ca 3 ml av 5 M NaOH-løsningen i trinn på 100 μL. Etter å ha tilsendet NaOH-løsningen, vil de tiobarbiturinsyrepartiklene begynne å oppløse seg.
    4. Hvis de tiobarbiturinsyrepartiklene fortsatt ikke er fullstendig oppløst, tilsett mer av 5 M NaOH-løsningen i trinn på 100 μL til alle tiobarbitursyrepartikler er fullstendig oppløst. For dette spesielle volumet av løsning tilsetts totalt 4 ml av 5 M NaOH-løsningen for å fullstendig oppløse tiobarbitursyrepartiklene.
      MERK: Ved denne konsentrasjonen vil tiobarbitursyre ikke oppløses helt med mindre pH er nesten 4.
    5. Slutt å legge til NaOH etter at all den tiobarbiturinsyren er fullstendig oppløst. Unngå å overskride en pH på 4. Den endelige pH-en kan verifiseres ved å ta 1 μL fra den blandende tiobarbitursyreoppløsningen og plassere den på pH-papir.
    6. Ta det endelige volumet til 500 ml med DI-vann og oppbevar vandig 0,8% tiobarbiturinsyreoppløsning ved RT.

3. Malondialdehyd bis (dimetylacetal) standard prøvepreparering

MERK: Malondialdehyd (MDA) er ustabil og ikke kommersielt tilgjengelig. Imidlertid er det forskjellige kjemiske former for MDA som er kommersielt tilgjengelige, for eksempel MDA tetrabutylammonium salt, MDA bis (dimetylacetal) og MDA bis (dietylacetal). Av disse tre kjemiske formene brukes MDA bis(dimetylacetal) her, fordi et flertall av studiene bruker samme standard21,22. Hvis du velger å bruke de to andre kjemiske formene for MDA, bør det utføres forhåndsvalidering av egnetheten.

  1. Forbered en 550 μM MDA bis (dimetylacetal) lagerløsning ved å fortynne 92 μL ren MDA bis (dimetylacetal) i 1 liter DI-vann. Bruk en magnetisk rørestang for å blande løsningen grundig i 10 min. Oppbevar oppløsning ved 4 °C og bruk innen 1 måned.
  2. Forbered en 200 μM MDA bis (dimetylacetal) ved å fortynne 726 μL fra 550 μM MDA bis (dimetylacetal) lager i 1274 μL DI vann. Denne 200 μM MDA bis(dimetylacetal) oppløsningen skal tilberedes frisk hver gang en TBARS-analyse utføres.
  3. Standard kurveforberedelse: Ta åtte 2 ml snap-cap polypropylenrør og merk dem med bokstavene A til H. Tilsett MDA bis (dimetylacetal) fra 200 μM-lageret og fortynn i vann som beskrevet i tabell 1.
  4. Ta åtte glassrør (13 mm x 100 mm) og merk dem A-H, og tilsett deretter 100 μL standard til de tilsvarende rørene. Utfør seks replikeringer for den tomme standarden (prøve A) for å beregne grensene for deteksjon av TBARS-analysen.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her i ikke mer enn 1 time.

4. TBARS-analyse

MERK: Når TBARS-analysen er startet, bør den være ferdig uten å stoppe.

  1. Ta så mange glassrør som nødvendig for at antall prøver skal analyseres og merke dem med navnene på prøvene. Tilsett deretter 100 μL av hver tilberedte prøve (som beskrevet ovenfor) til hvert glassrør.
  2. Tilsett 200 μL 8,1% SDS til hver prøve og standard og virvle glassrøret forsiktig i en sirkulær bevegelse for å blande prøven.
  3. Tilsett 1,5 ml av 3,5 M natriumacetatbuffer (pH = 4) i hver prøve og standard.
  4. Tilsett 1,5 ml av den vandige 0,8% tiobarbitursyreoppløsningen (pH = 4) i hver prøve og standard.
  5. Ta det endelige volumet til 4 ml for hver prøve og standard ved å tilsette 700 μL DI-vann.
  6. Tett hette hvert glassrør og inkuber i en varmeblokk satt til 95 °C i 1 time. Dekk glassrørene med aluminiumsfolie for å forhindre kondens på toppen av rørene.
  7. Fjern glassrørene fra varmeblokken og inkuber på is i 30 min.
  8. Sentrifugeprøver og standarder ved 1500 x g i 10 min ved 4 °C. Etter sentrifugering, hold glassrørene som inneholder prøvene og standardene hos RT.
    MERK: Hvis du oppbevarer prøvene på is eller ved 4 °C, vil hele prøven eller standarden utløses.
  9. Umiddelbart etter sentrifugering, aliquot 150 μL supernatant fra hvert rør og plasser i en separat brønn på en 96 brønnplate.
  10. Fjern eventuelle bobler fra hver brønn ved hjelp av en pipettespiss.
    MERK: Tilstedeværelsen av bobler vil gi inkonsekvente absorbansavlesninger, noe som fører til høy analyse upresise.
  11. Les absorbanser ved 532 nm. Trekk den gjennomsnittlige absorbansavlesningen av de tomme prøvene fra alle andre absorbansavlesninger.
  12. Lag en standardkurve ved å tegne inn blanke absorberingsavlesninger ved 532 nm i forhold til den kjente konsentrasjonen av hver standard. Tilpass datapunktene ved hjelp av lineær regresjon. Beregn ukjente utvalgskonsentrasjoner ved hjelp av ligningen til den lineære regresjonslinjen hentet fra standardkurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under sure forhold (pH = 4) og ved 95 °C gir malondialdehyd (MDA) bis (dimetylacetal) MDA23. MDA og nært beslektede kjemiske kongenere reagerer med to molekyler av tiobarbitursyre (TBA) for å produsere forbindelser kalt tiobarbitursyre reaktive stoffer (TBARS), som gir en rød-rosa farge og har en absorbans λmax ved 532 nm (figur 1, figur 2). Ved hjelp av MDA bis (dimetylacetal) som standard ble det generert standardkurver (figur 3, tabell 1) for å bestemme grensene for deteksjon og følsomhet for analysen og nivåene av oksidasjon i tre forskjellige biologiske prøver. Totalt ni TBARS-analyser ble utført for å bestemme nivåene av oksidasjon i de tre forskjellige prøvene på forskjellige dager. Derfor ble det generert totalt ni standardkurver, som vist i figur 3. Minste kvadraters prosedyre24 ble brukt til å bestemme standardavvikene for skråningen og y-skjæringspunktet, som var henholdsvis 8,67 x 10-6 og 5,66 x 10-4.

Grensene for deteksjon av TBARS-analysen ble bestemt i henhold til standard analytiske prosedyrer25 ved å måle absorbanser av de tomme prøvene (seks eksperimentelle replikeringer med to tekniske repliker per eksperimentell replikering) på tre forskjellige dager. Minimum skille mellom analytisk signal (Sm) ble bestemt ved å summere gjennomsnittet av det tomme signalet (S̄ bl) pluss et multiplum k av standardavviket til det tomme (ksbl), hvor k = 3. Det vil si, Sm = S̄ bl+ ksbl. Ved hjelp av Sm og hellingen til standardkurven (m) ble deteksjonsgrensen (cm) beregnet som cm = (Sm - S̄ bl)/m. De resulterende dataene fra de tomme prøvene på tre forskjellige dager viser at minimumskonsentrasjonen av TBARS-substans som trengs for å gi et påviselig ikke-støyabsorberingssignal er 1,1 μM (tabell 2). Følsomheten til TBARS-analysen er ca. 0,00160 absorbansenheter/μM, som er analysens evne til å skille forskjeller i analyttkonsentrasjon (tabell 2).

For å illustrere anvendelsen av TBARS-analysen i å oppdage endringer i lipidperoksidasjon i ulike biologiske matriser, ble CuCl2 brukt til å indusere in vitro oksidasjon av humant serum, HepG2 cellelytter og lipoproteiner med lav tetthet. Disse biologiske prøvene som brukes her er prototyper av biologiske matriser. For eksempel, basert på resultatene som presenteres her for HepG2-cellelysater, er det rimelig å forvente at denne analysen vil fungere med andre typer cellelys; Det må imidlertid valideres analytisk for dette formålet. Også av de tre biologiske matrisene som brukes her, er det vanlig at visse typer prøver viser lave endogene konsentrasjoner av TBARS. For eksempel var TBARS for HepG2 cellelysater som ikke ble behandlet med CuCl2 like over grensen for deteksjon av analysen (ca. 2 μM; Figur 4). Som forventet i nærvær av lave signal-til-støy-forhold, er standardavviket og variasjonskoeffisienten for denne spesielle prøven relativt høy (tabell 3). Men etter hvert som signalet øker som følge av Cu(II) mediert oksidasjon, blir variasjonskoeffisienten lavere. Generelt, etter hvert som absorbansen øker utover deteksjonsgrensen, forbedres analysens reproduserbarhet (tabell 3).

I denne protokollen var det ikke noe ønske om å bruke antioksidanter til å maskere in vitro Cu(II)-mediert oksidasjon av biologiske prøver. Kommersielt tilberedt lipoprotein med lav tetthet (LDL) kan inneholde 0,01 % EDTA. EDTA vil forhindre Cu(II)-mediert oksidasjon av LDL, men ikke nødvendigvis andre metallmediert oksidasjonsreaksjoner26,27. En TBARS-analyse ble utført på LDL-prøver som inneholder EDTA, og nivåene av TBARS endret seg ikke mellom Cu(II)-behandlede og ubehandlede LDL-prøver (figur 5A). Men etter at EDTA ble fjernet ved spinnfiltrering (se trinn 1.2.3-1.2.5), gjennomgikk LDL Cu(II)-mediert oksidasjon, som detekteres av TBARS-analysen (figur 5B).

Det normale utvalget av lipidperoksidasjonsprodukter i det menneskelige serumet fra friske donorer uttrykt i form av MDA er mellom 1,80-3,94 μM28. For å illustrere det dynamiske spekteret av TBARS-analysen i humant serum, ble en konsentrasjon på 2 mM Cu(II) ioner lagt til prøvene, etterfulgt av inkubasjon i 24 timer ved 37 °C. Dette resulterte i en økning på 6x–7x i TBARS (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Thiobarbituric acid reaktive stoffer analyse skjematisk.
Hundre mikroliter av prøve eller standard legges til et 13 mm x 100 mm glassrør, etterfulgt av tilsetning av tiobarbiturinsyrereaktive stoffer (TBARS) reagenser. Etter inkubasjon ved 95 °C i 1 time inkuberes prøver og standarder i is i 30 minutter, deretter sentrifugeres ved 1500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Hundre femti mikroliter prøve eller standard supernatant lastes på en 96 brønnplate, og absorbans måles ved 532 nm. Ukjent prøvekonsentrasjon beregnes ved hjelp av ligningen til standardkurven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arketype tiobarbiturinsyre reaktive stoffer reaksjon.
Malondialdehydbis (dimetylacetal) gir malondialdehyd under syrekatalysert hydrolyse1. Frigjort Malondialdehyd (MDA) reagerer deretter med to molekyler av 2-tiobarbitursyre (TBA) (pH = 4 og 95 °C) for å danne MDA-TBA2-addukter som gir en rød-rosa farge og kan måles spektrofotometrisk ved 532 nm. Fordi andre molekyler i tillegg til MDA som er avledet fra oksiderte lipider også kan reagere med TBA, blir absorbansmålingen ved 532 nm ganske enkelt referert til som en måling av tiobarbiturinsyre reaktive stoffer, eller TBARS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Malondialdehydbis (dimetylacetal) kolorimetriske standardkurver.
Figur viser ni standardkurver som er opprettet på forskjellige dager. Noen punkter overlapper hverandre og kan ikke skilles fra hverandre. Malondialdehydbis(dimetylacetal) ble befestet i kalibratorprøver ved 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 μM (som vist i tabell 1; n = 1 per konsentrasjonspunkt per dag). Absorbans ble målt til 532 nm, med gjennomsnittlig absorbans av de tomme prøvene trukket fra alle målinger i den batchen, inkludert ukjente. Hver dag ble ligningen generert av minste kvadraters lineære regresjon brukt til å bestemme TBARS i biologiske prøver. For alle de ni standardkurvene til sammen var standardavviket for stigningstallet 8,67 x 10-6, og standardavviket for y-skjæringspunktet var 5,66 x 10-4. Standardavvikene for stigningstallet og y-skjæringspunktet ble beregnet ved hjelp av minste kvadraters prosedyre24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Oksidasjon i HepG2 lyser påvist av TBARS.
Seks HepG2 cellelysprøver ble inkubert med 2 mM CuCl2 [HepG2 cellelysat + 2 mM Cu(II)] og seks prøver ble inkubert i en løsning uten CuCl2 (HepG2 cellelysat) i 24 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon ble TBARS-analysen utført på de 12 prøvene. Denne prosedyren ble gjentatt 2x i totalt tre forskjellige dager. Feilfelt representerer SD. Stjernen indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom kontroll og Cu(II)-behandlede lysater (p < 0,001). Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av en Mann Whitney U-test i GraphPad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Oksidasjon i lipoprotein med lav tetthet oppdaget av TBARS.
(A) TBARS-analyse utført i LDL-prøver som inneholder 0,01 % EDTA. Seks LDL-prøver ble inkubert med 10 μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], og seks prøver ble inkubert med en kontrollløsning uten CuCl2 tilsatt (Native LDL) i 2 timer ved 37 °C. Deretter ble det utført en TBARS-analyse på de 12 prøvene. "ns" representerer ingen statistisk signifikans. (B) LDL ble spinnfiltrert ved hjelp av en sentrifugal spinnfilterenhet for å fjerne EDTA. Deretter ble inkubasjon med og uten ekstra Cu(II) utført igjen som beskrevet for (A). TBARS-analysen ble utført umiddelbart etterpå. Den samme prosedyren ble gjentatt 2x i totalt 3 dager. Feilfelt representerer SD. Stjernen indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom kontroll- og Cu(II)-behandlede LDL-prøver (p < 0,001). Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Mann Whitney U-testen i GraphPad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lipidperoksidasjon i humane serumprøver påvist av TBARS.
Seks humane serumprøver ble inkubert med 2 mM CuCl2 [serum + 2 mM Cu(II)], og seks prøver ble inkubert med en løsning som ikke hadde noen ekstra CuCl2 (normalt serum) i 24 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon ble TBARS-analysen utført på de 12 prøvene. Denne prosedyren ble gjentatt på to ekstra dager. Feilfelt representerer SD. Stjernen indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom kontroll og Cu(II)-behandlede serumprøver (p < 0,001). Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Mann Whitney U-testen i GraphPad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

GlassRør 200 μM MDA bis (dimetylacetal) (μL) Vann (μL) MDA bis (dimetylacetal) Endelig konsentrasjon (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tabell 1: Malondialdehydbis(dimetylacetal) standard prøvepreparering. Fra den nylagde 200 μM malondialdehyd bis (dimetylacetal), aliquot de foreslåtte volumene for å nå den endelige konsentrasjonen for standardkurven. Det anbefales å utføre minst seks replikeringer av den tomme prøven (A) per dag for å bestemme grensene for deteksjon av metoden.

Dag Absorbansering Sblb Smc Følsomhet (absorbansenheter/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Alle tre dagene (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
en Absorbans av de tomme prøvene på tre forskjellige dager med 6 replikerer per dag.
bSbl = Standardavvik for absorbansen av de tomme prøvene.
cSm = Minimum skille analytisk signal, som ble bestemt ved å summere gjennomsnittet av det tomme signalet (S̄ bl) pluss et multiplum k av standardavviket til det tomme (ksbl), der k = 3. Det er; Sm = S̄ bl + ksbl.
d Følsomhet for TBARS-analysen, som er hellingen til standardkurven.
ecm = Grenser for deteksjon, som ble beregnet som cm = (Sm - S̄ bl)⁄m, hvor m = skråningen av standardkurven.

Tabell 2: Deteksjonsgrenser for TBARS-analysen.

Lipoprotein med lav tetthet Menneskelig serum HepG2 Celle Lysate
Dag % CV Dag % CV Dag % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Alle tre dagene (n = 18)a 7.4 Alle tre dagene (n = 18) 9.8 Alle tre dagene (n = 18) 15.5b
Med 10 μM CuCl2 Med 2 mM CuCl2 Med 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Alle tre dagene (n = 18) 6.1 Alle tre dagene (n = 18) 5.6 Alle tre dagene (n = 18) 7.3
en Interday presisjon ble beregnet ved å samle data fra alle tre dagene.
b Presisjonen var begrenset på grunn av at resultatene var nær analysen LOD.

Tabell 3: Analytisk reproduserbarhet av TBARS i tre ulike biologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for begrensningene1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 og mangel på egnethet for sammenligning mellom laboratorier, er TBARS-analysen en av de eldste29,30 men mest brukte analyser for å måle oksidativt stress i biologiske prøver. TBARS-analysen er en enkel metode som bare tar omtrent 2 timer å utføre, når alle nødvendige reagenser er utarbeidet. Her har vi beskrevet i detalj hvordan denne analysen, inkludert standardkurve, kan utføres mange ganger på en økonomisk måte (omtrent $ 3.50 USD for 96 prøver), uten å måtte kjøpe et dyrt sett for hver batch av prøver.

Alle trinnene i analysen er kritiske, men det er noen trinn som krever ekstra oppmerksomhet. For eksempel bør pH i tiobarbitursyren ikke være høyere enn 4. Forholdsregler bør tas ved tilsetning av natriumhydroksidoppløsningen til tiobarbitursyren og unngå å oppnå en pH på mer enn 4. Et surt miljø er nødvendig for at reaksjonen mellom MDA og TBA skal oppstå, og MDA-standarden frigjøres fra MDA bis (dimetylacetal) ved syrekatalysert hydrolyse. Derfor kan en høy pH føre til uforutsigbare og svært variable resultater31.

Selv om dette kan være åpenbart for noen lesere, er det også viktig å fjerne eventuelle bobler i 96 brønnplaten før du måler absorbansen. Tilstedeværelsen av bobler vil gi høye absorberingsverdier og forskjeller mellom replikeringer, noe som fører til høy prosentandel av CV-er. I tillegg, etter 1 h inkubasjon ved 95 °C, bør prøver ikke inkuberes lenger enn 30 minutter på is, siden dette vil utløse hele prøven, og det vil være vanskelig å oppnå å samle en bunnfri supernatant. Spesielt er det ingen gode stoppepunkter når TBARS-analysen er startet. Den bør fullføres når den er startet. Til slutt er det mange mulige metodiske variasjoner som kan brukes på denne analysen. Den generelle protokollen som er beskrevet her, kan tilpasses (og valideres) ytterligere for spesifikke applikasjoner, inkludert de der det kreves tilsetning av radikale scavengers eller andre typer antioksidanter før analyse.

Selv om TBARS-analysen er populær, er det viktig å innse at det ikke er en molekylært spesifikk analyse. Tallrike kjemisk reaktive karbonylholdige organiske molekyler, inkludert de som er avledet fra oksiderte biomolekyler annet enn lipider, kan reagere med TBA og regnes dermed som TBARS1,32,33,34. I tillegg blir grensene for deteksjon av den absorbansbaserte TBARS-analysen ikke mye bedre enn ca. 1,1 μM, som bestemt av denne metoden. Grensene for gjenkjenning kan imidlertid forbedres ved hjelp av andre gjenkjenningsmetoder. For eksempel tilbyr spektrofluoremetri med eksitasjon ved 520 nm og utslipp ved 550 nm høyere følsomhet og bedre deteksjonsgrenser, som tidligere foreslått av Jo og Ahn35. Massespektrometribaserte metoder kan dramatisk forbedre både spesifisiteten og grensene for deteksjon. For eksempel har en GC-MS/MS med elektronfangst kjemisk ionisering (ECNICI) blitt brukt til å oppdage pentafluorobenzyl-derivatet av MDA i humane serum- og urinprøver, med grenser for påvisning av 2 x 10-18 mol MDA på kolonne36. Her forbedrer den kromatografiske separasjonen, i kombinasjon med tandemmassespektrometri, også analysens molekylære spesifisitet dramatisk.

Likevel, som med andre målinger av oksidative prosesser innen biologiske prøver37,38, er preanalytisk prøvehåndtering avgjørende for utfallet av TBARS-målinger. For eksempel resulterer blodplasmalagring ved -20 °C i langsomme, men dramatiske økninger i MDA-konsentrasjoner39,40. Dermed bør eksponering av biologiske prøver for tining eller til og med delvis opptinte forhold for noe annet enn en minimal tid antas å forårsake artefaktuell høyde av TBARS-nivåer. Dette betyr at selv beskjeden variasjon i preanalytisk håndtering og lagring av biospecimens som skal sammenlignes ved hjelp av TBARS-analysen, må unngås.

Gitt disse forbeholdene knyttet til preanalytisk variasjon samt begrenset følsomhet og spesifisitet, anbefales det at den absorbansbaserte TBARS-analysen bare brukes til generell vurdering av intralaboratoriet eller områdesøkende eksperimenter. Disse søknadene inkluderer studier der relative TBARS-nivåer sammenlignes direkte mellom en eller flere grupper av biologisk lignende prøver som behandles eller lagres sammen og separeres med bare en enkelt variabel som er fullstendig kontrollert av forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forskningen som ble rapportert her ble delvis støttet av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildeling nr. R33 CA217702 og programmet Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet på National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

Kjemi Utgave 159 tiobarbitursyre reaktive stoffer TBARS oksidasjon lipidperoksidasjon malondialdehyd MDA tiobarbitursyre TBA oksidativt stress
Evaluering av oksidativt stress i biologiske prøver ved bruk av tiobarbitursyre reaktive stoffer analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter