Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61122
Automatic Translation
1,
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

L’objectif du test des substances réactives à l’acide thiobarbiturique est d’évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques en mesurant la production de produits de peroxydation lipidique, principalement du malondialdéhyde, en utilisant la spectrophotométrie de longueur d’onde visible à 532 nm. La méthode décrite ici peut être appliquée au sérum humain, aux lysats cellulaires et aux lipoprotéines de basse densité.

Abstract

Malgré sa spécificité analytique et sa robustesse limitées, le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été largement utilisé comme mesure générique de la peroxydation lipidique dans les fluides biologiques. Il est souvent considéré comme un bon indicateur des niveaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique, à condition que l’échantillon ait été correctement manipulé et stocké. Le test implique la réaction de produits de peroxydation lipidique, principalement le malondialdéhyde (MDA), avec l’acide thiobarbiturique (TBA), ce qui conduit à la formation d’adduits MDA-TBA2 appelés TBARS. TBARS donne une couleur rouge-rose qui peut être mesurée spectrophotométriquement à 532 nm. Le test TBARS est effectué dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C. Le MDA pur est instable, mais ces conditions permettent la libération de MDA à partir du MDA bis(diméthylacétal), qui est utilisé comme norme analytique dans cette méthode. Le test TBARS est une méthode simple qui peut être complétée en environ 2 h. La préparation des réactifs d’essai est décrite en détail ici. Les chercheurs soucieux de leur budget peuvent utiliser ces réactifs pour plusieurs expériences à faible coût plutôt que d’acheter un kit de test TBARS coûteux qui ne permet la construction que d’une seule courbe standard (et ne peut donc être utilisé que pour une seule expérience). L’applicabilité de ce test TBARS est démontrée dans le sérum humain, les lipoprotéines de basse densité et les lysats cellulaires. Le test est cohérent et reproductible, et des limites de détection de 1,1 μM peuvent être atteintes. Des recommandations pour l’utilisation et l’interprétation du test spectrophotométrique TBARS sont fournies.

Introduction

La peroxydation lipidique est un processus dans lequel les radicaux libres, tels que les espèces réactives de l’oxygène et les espèces réactives de l’azote, attaquent les doubles liaisons carbone-carbone dans les lipides, un processus qui implique l’extraction d’un hydrogène à partir d’un carbone et l’insertion d’une molécule d’oxygène. Ce processus conduit à un mélange de produits complexes, y compris les radicaux peroxyles lipidiques et les hydroperoxydes comme produits primaires, ainsi que le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal comme produits secondaires prédominants1.

Le MDA a été largement utilisé dans la recherche biomédicale comme marqueur de la peroxydation lipidique en raison de sa réaction facile avec l’acide thiobarbiturique (TBA). La réaction conduit à la formation de MDA-TBA2, un conjugué qui absorbe dans le spectre visible à 532 nm et produit une couleur rouge-rose2. D’autres molécules dérivées de la peroxydation lipidique en plus du MDA peuvent également réagir avec le TBA et absorber la lumière à 532 nm, contribuant ainsi au signal d’absorption global mesuré. De même, la MDA peut réagir avec la plupart des autres grandes classes de biomolécules, ce qui pourrait limiter son accessibilité à la réaction avec TBA3,4. En tant que tel, ce test traditionnel est simplement considéré comme mesurant les « substances réactives de l’acide thiobarbiturique » ou TBARS5.

Lorsqu’il est correctement appliqué et interprété, le test TBARS est généralement considéré comme un bon indicateur des niveaux globaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique6. Malheureusement, comme l’ont documenté Khoubnasabjafari et d’autres, le test TBARS est souvent mené et interprété de manière à faciliter les conclusions douteuses3,4,7,8,9,10,11. Les causes en sont principalement enracinées dans les variables pré-analytiques liées à l’échantillon et un manque de robustesse du test qui interdit des variations apparemment mineures dans le protocole d’essai sans changements substantiels dans les résultats du test1,7,12,13.

Les variables préanalytiques liées à la manipulation et au stockage des échantillons biologiques (p. ex., plasma sanguin conservé temporairement à -20 °C)14,15 peuvent avoir un impact majeur sur les résultats des essais TBARS16,17; à tel point que les résultats des tests TBARS ne devraient pas être comparés entre différents laboratoires à moins que des données explicites de validation analytique interlaboratoire ne le justifient. Cette recommandation s’apparente à la façon dont les transferts de Western sont couramment utilisés et interprétés. Les comparaisons des densités de bande sont valables pour les études à l’intérieur du transfert et peut-être à l’intérieur du laboratoire, mais la comparaison des densités de bande entre laboratoires est généralement considérée comme une pratique invalide.

Certains chercheurs ont suggéré que la MDA telle que mesurée par le test TBARS ne répond tout simplement pas aux critères analytiques ou cliniques requis pour un biomarqueur acceptable3,9,10,18,19. En effet, si le test n’avait pas été développé il y a plus de 50 ans, il n’aurait probablement pas acquis l’utilisation généralisée et l’acceptabilité tacite qu’il a aujourd’hui. Bien qu’il existe d’autres tests avec une sensibilité analytique, une spécificité et une robustesse plus élevées utilisés pour déterminer le stress oxydatif, le test TBARS basé sur l’absorbance à 532 nm reste de loin l’un des tests les plus couramment utilisés pour la détermination de la peroxydation lipidique20, et donc l’évaluation du stress oxydatif.

Le test TBARS ne peut être trouvé que sous la forme d’un kit coûteux (plus de 400 dollars américains), dans lequel les instructions ne fournissent pas d’informations détaillées sur la plupart des concentrations des réactifs utilisés. De plus, les réactifs fournis ne peuvent être utilisés que pour une seule expérience, car une seule courbe standard colorimétrique peut être réalisée par kit. Cela peut être problématique pour les chercheurs qui ont l’intention de déterminer les niveaux d’oxydation dans quelques échantillons à différents moments, car la même courbe standard ne peut pas être utilisée à plusieurs reprises. Par conséquent, plusieurs kits doivent être achetés pour plusieurs expériences. Actuellement, à moins qu’un kit coûteux ne soit acheté, il n’existe pas de protocole détaillé sur la façon d’effectuer un test TBARS. Certains chercheurs dans le passé ont vaguement décrit comment effectuer un test TBARS21,22, mais ni un protocole entièrement détaillé ni une vidéo complète sur la façon de mener le test TBARS sans un kit coûteux n’est disponible dans la littérature.

Nous rapportons ici une méthodologie détaillée, validée analytiquement et à cet effet sur la façon d’effectuer un test TBARS de manière simple, reproductible et peu coûteuse. Les changements dans la peroxydation lipidique du sérum humain, des lysats d’HepG2 et des lipoprotéines de basse densité lors du traitement par des ions Cu(II) sont démontrés à titre d’applications illustratives pour le test TBARS. Les résultats démontrent que ce test TBARS est cohérent et reproductible au quotidien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Des échantillons de sérum humain ont été obtenus auprès de volontaires consentants sous l’approbation de la CISR et conformément aux principes exprimés dans la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons ont été codés et anonymisés avant d’être transférés au laboratoire d’analyse.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Lysats de cellules HepG2
    1. Ensemencez environ 10 x 106 cellules HepG2 par fiole dans 16 fioles T75 avec 14 mL de milieu EMEM complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et cultivez des cellules pendant 2 jours.
    2. Préparer le tampon RIPA : dans un tube de 50 mL, ajouter 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de réactif NP-40, puis porter le volume final à 50 mL avec de l’eau DI.
    3. Préparer le tampon de lyse : aliquote 20 mL de tampon RIPA dans un tube de 50 mL et ajouter 200 μL d’une solution inhibitrice de protéase 100x pour inhiber la dégradation des protéines et des lipides. Conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Le tampon de lyse est compatible avec les réactifs TBARS et n’interfère pas avec l’absorbance à 532 nm. Si vous envisagez d’utiliser un tampon de lyse différent ou d’ajouter des ingrédients supplémentaires au tampon de lyse, des études de validation préliminaires doivent être effectuées pour vérifier que les composants du tampon de lyse sont compatibles avec le test TBARS.
    4. Retirer les supports contenant 10% de FBS et laver les cellules 2x avec 5 mL de PBS froid et stérile.
    5. Ajouter 1 mL de tampon de lyse aux flacons T75 contenant les cellules et les incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) avec un tourbillon constant pour s’assurer que le tampon est bien réparti.
    6. Recueillir les lysats dans des tubes en polypropylène de 2 mL à capuchon encliquetage correctement étiquetés et incuber sur de la glace pendant 10 min.
    7. Faire tourner les lysats à 5 000 x g pendant 10 min à TA pour recueillir les débris cellulaires et aspirer les surnageants dans un seul tube de 15 mL.
    8. Concentrer le lysat de cellules surnageant quatre fois à l’aide d’un Speed Vac à 50 °C et 3 mbar et fabriquer des aliquotes de 94 μL chacune dans des tubes en polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour l’oxydation in vitro et/ou le dosage TBARS.
      REMARQUE: Pour éviter de concentrer le surnageant de lysat cellulaire, les cellules peuvent également être détachées à l’aide de 3 mL de 1x trypsine, neutralisées avec 6 mL de milieu et lavées 2x avec 5 mL de PBS froid. Les pastilles cellulaires peuvent ensuite être reconstituées dans 250 μL de tampon de lyse, et les étapes 1.1.6 et 1.1.7 peuvent ensuite être effectuées.
    9. Préparer une solution mère de CuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4).
      1. Préparer une solution d’acide acétique (pH = 4) : Diluer 1 μL d’acide acétique glacial dans 100 mL d’eau DI (le pH doit être d’environ 4 mais confirmez cela avec un pH-mètre). Ajouter plus d’eau ou d’acide acétique pour ajuster le pH à 4.
      2. Pondérer environ 0,1936 g de chlorure de cuivre II et dissoudre dans 10 mL de la solution d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir un stock de CuCl2 de 144 mM. Aliquoter 490 μL de cette solution et ajouter à 1 510 μL d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir une solution de CuCl2 de 35 mM.
    10. Aliquote 6 μL de la solution mère de CuCl2 de 35 mM et ajoutez-la à six échantillons contenant 94 μL de lysat cellulaire pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 2 mM. Ajouter 6 μL d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 94 μL de lysats cellulaires à utiliser comme témoins. Le volume final de lysat cellulaire devrait être de 100 μL, ce qui sera utilisé pour le test TBARS.
      REMARQUE: La fabrication de la solution mère cuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4) est nécessaire pour empêcher la précipitation de l’hydroxyde de cuivre.
    11. Incuber des échantillons dans un four à 37 °C pendant 24 h et effectuer un dosage TBARS sur chaque échantillon contenant un volume final de 100 μL.
    12. Répétez les étapes 1.1.9 et 1.1.11 2x sur des jours distincts pour vérifier la reproductibilité du test TBARS pour les lysats de cellules HepG2.
  2. Lipoprotéines de basse densité
    REMARQUE: En règle générale, les lipoprotéines de basse densité (LDL) pré-purifiées contiennent une certaine quantité d’EDTA. Les échantillons de LDL utilisés ici contiennent 0,01% d’EDTA. L’EDTA peut inhiber l’oxydation in vitro du LDL médiée par le Cu(II). Par conséquent, il peut être nécessaire de retirer l’EDTA des échantillons de LDL avant les expériences ou les analyses. Les étapes 1.2.1 à 1.2.5 décrivent ce processus.
    ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est corrosif et provoque une irritation de la peau et des yeux. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié.
    1. Aliquote 24 μL à partir d’un stock de LDL de 5,51 mg/mL (concentration en protéines déterminée par la méthode de Lowry modifiée en utilisant la BSA comme norme) dans des tubes en polypropylène à capuchon encliquetable de 1 mL correctement étiquetés. Faire autant d’aliquotes que nécessaire et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans l’oxydation et/ou le dosage TBARS.
    2. Préparer un tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl ajusté au pH = 7 avec des billes de NaOH : dissoudre 4,39 g de NaCl dans 0,49 L d’eau, puis ajouter 1,19 g de HEPES. Bien dissoudre avec une barre de remuage. Ajouter les billes d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que le pH soit de 7. Diluer à 0,5 L avec de l’eau. Conserver le tampon à 4 °C et l’utiliser dans les 3 mois.
    3. Ajouter 476 μL du tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7) aux échantillons de LDL aliquotes pour porter le volume final à 500 μL. Ajouter un échantillon de LDL dilué à un dispositif de filtre à spin centrifuge de 0,5 mL avec une limite de poids moléculaire de 100 K.
    4. Spin des échantillons à 14 000 x g pendant 10 min à TA, laissant un volume de rétentat final d’environ 30 μL. Reconstituer des échantillons dans 480 μL du tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7) et tourner à nouveau à 14 000 x g pendant 10 min à RT. Effectuez cette étape 2x pour un total de quatre spin-throughs.
    5. Placez le dispositif filtrant à l’envers dans un nouveau tube en polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL et centrifugez à 1000 x g pendant 2 min pour prélever un échantillon de LDL (volume final = environ 30 μL).
    6. Échantillon aliquote dans un tube de 1 mL correctement étiqueté et ajouter 20 μL d’eau à chaque échantillon pour obtenir un volume final de 50 μL.
    7. Préparation de 200 μM de solution mère de CuCl2 dans de l’acide acétique (pH = 4)
      1. Préparer une solution d’acide acétique (pH = 4): voir étape 1.1.9.1.
      2. Préparer une solution mère de CuCl2 de 144 mM (voir étape 1.1.9.2), puis aliquoter 5,5 μL du bouillon de CuCl2 de 144 mM et dissoudre dans un volume final de 4 mL d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir la solution de 200 μM.
    8. Aliquote 2,7 μL de la solution mère de CuCl2 de 200 μM et ajoutez-la à six échantillons contenant 50 μL de LDL pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 10 μM. Ajouter 2,7 μL provenant d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 50 μL de LDL à utiliser pour les témoins.
    9. Incuber des échantillons de LDL pendant 2 h dans un four à 37 °C. Après 2 h, porter le volume final à 100 μL pour chaque échantillon avec un tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7). Effectuez immédiatement un test TBARS.
    10. Répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.9 2x deux jours différents pour tester la reproductivité du test TBARS.
  3. Sérum humain
    1. À partir d’un échantillon de sérum humain, fabriquer des aliquotes de 94 μL chacune dans des tubes de polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL et conserver les échantillons à -80 °C.
    2. Préparer une solution mère de CuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4) : voir étape 1.1.9.
    3. Aliquote 6 μL de la solution mère de CuCl2 et ajoutez-la à six échantillons contenant 94 μL de sérum humain pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 2 mM. Ajouter 6 μL d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 94 μL de sérum humain à utiliser comme témoins.
    4. Incuber des échantillons de sérum humain pendant 24 h dans un four à 37 °C et déterminer les niveaux d’oxydation avec le test TBARS (section 4).
    5. Répétez les étapes 1.3.2 à 1.3.4 2x sur deux jours distincts pour déterminer la reproductibilité du test TBARS.

2. Préparation du réactif

ATTENTION: L’acide thiobarbiturique provoque une irritation de la peau et des yeux et peut être nocif par inhalation ou absorption cutanée. L’acide acétique peut endommager les organes internes s’il est inhalé. Préparer toutes les solutions acides dans une hotte.

  1. Préparation d’une solution de dodécylsulfate de sodium (FDS) à 8,1 % (p/v)
    1. Poids 32,4 g de FDS et dissoudre dans 350 mL d’eau DI dans un bécher. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour dissoudre doucement les FDS et éviter de faire des bulles. Porter le volume final à 400 mL avec de l’eau DI et stocker la solution SDS à RT.
      REMARQUE: Ici, une solution de FDS excédentaire à 8,1% est préparée; toutefois, pour 96 échantillons, seulement environ 20 mL de la solution de FDS à 8,1 % sont nécessaires. Préparez cette solution en fonction du nombre d’échantillons analysés.
  2. Préparation d’un tampon d’acétate de sodium de 3,5 M (pH = 4)
    1. Diluer 100 mL d’acide acétique glacial dans 350 mL d’eau DI dans un bécher. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour le dissoudre doucement.
    2. Préparer une solution de NaOH de 6,5 M à l’aide de billes d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Dissoudre 13 g de billes de NaOH dans 40 mL d’eau DI et porter à un volume final de 50 mL avec de l’eau DI.
    3. Ajouter lentement environ 46 mL de la solution de NaOH de 6,5 M à la solution d’acide acétique tout en mélangeant avec la barre d’agitation (cela devrait augmenter le pH à 4, mais confirmer en ajoutant lentement la solution de NaOH tout en mesurant à l’aide d’un pH-mètre).
    4. Porter le volume final à 500 mL avec de l’eau DI et conserver le tampon d’acétate de sodium à TA.
  3. Préparation d’une solution aqueuse à 0,8% d’acide thiobarbiturique (ajustée au pH = 4)
    REMARQUE: Dans cette étape, la préparation de l’acide thiobarbiturique est optimisée pour de grands volumes, car un grand nombre d’échantillons vont être analysés (108 échantillons, sans compter les normes). Préparez cette solution en fonction du nombre d’échantillons prévus pour l’analyse.
    1. Préparer une solution d’hydroxyde de sodium de 5 M à l’aide de billes d’hydroxyde de sodium et d’eau : dissoudre 4 g de billes d’hydroxyde de sodium dans un volume final de 20 mL d’eau. Conserver dans un récipient en plastique. Cette solution doit être fraîchement préparée pour chaque lot.
    2. Poids 4 g d’acide thiobarbiturique et ajouter 450 mL d’eau DI. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour le dissoudre doucement.
      REMARQUE: Cette solution sera finalement portée à un volume total de 500 mL.
    3. Lors de la dissolution de l’acide thiobarbiturique avec une barre d’agitation, ajouter (lentement et goutte à goutte) environ 3 mL de la solution de NaOH 5 M par incréments de 100 μL. Après avoir ajouté la solution de NaOH, les particules d’acide thiobarbiturique commenceront à se dissoudre.
    4. Si les particules d’acide thiobarbiturique ne sont toujours pas complètement dissoutes, ajouter plus de la solution de NaOH 5 M par incréments de 100 μL jusqu’à ce que toutes les particules d’acide thiobarbiturique soient complètement dissoutes. Pour ce volume particulier de solution, un total de 4 mL de la solution de NaOH 5 M est ajouté pour dissoudre complètement les particules d’acide thiobarbiturique.
      REMARQUE: À cette concentration, l’acide thiobarbiturique ne se dissoudra pas complètement à moins que le pH ne soit proche de 4.
    5. Arrêtez d’ajouter du NaOH une fois que tout l’acide thiobarbiturique s’est complètement dissous. Évitez de dépasser un pH de 4. Le pH final peut être vérifié en prenant 1 μL de la solution d’acide thiobarbiturique mélangée et en la plaçant sur du papier pH.
    6. Porter le volume final à 500 mL avec de l’eau DI et conserver une solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 % à TA.

3. Préparation de l’échantillon étalon de malondialdéhyde bis(diméthylacétal)

REMARQUE: Le malondialdéhyde (MDA) est instable et n’est pas disponible dans le commerce. Cependant, il existe différentes formes chimiques de MDA qui sont disponibles dans le commerce, telles que le sel de tétrabutylammonium MDA, le MDA bis (diméthylacétal) et le MDA bis (diéthyl acétal). De ces trois formes chimiques, MDA bis(diméthyl acétal) est utilisé ici, car la majorité des études utilisent cette même norme21,22. Si vous choisissez d’utiliser les deux autres formes chimiques de MDA, une validation préalable de leur adéquation doit être effectuée.

  1. Préparer une solution mère de MDA bis(diméthylacétal) de 550 μM en diluant 92 μL de MDA bis(diméthylacétal) pur dans 1 L d’eau DI. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour bien mélanger la solution pendant 10 min. Conserver la solution à 4 °C et l’utiliser dans un délai de 1 mois.
  2. Préparer un bis(diméthylacétal) MDA de 200 μM en diluant 726 μL du bouillon de 550 μM de MDA bis(diméthylacétal) dans 1274 μL d’eau DI. Cette solution de MDA bis(diméthylacétal) de 200 μM doit être préparée fraîche chaque fois qu’un test TBARS est effectué.
  3. Préparation de courbe standard : prendre huit tubes en polypropylène à capuchon de 2 mL et les étiqueter avec les lettres A à H. Ajouter du MDA bis(diméthylacétal) à partir du stock de 200 μM et diluer dans l’eau comme décrit dans le tableau 1.
  4. Prenez huit tubes en verre (13 mm x 100 mm) et étiquetez-les de A à H, puis ajoutez 100 μL de norme aux tubes correspondants. Effectuer six répétitions pour l’étalon vierge (échantillon A) afin de calculer les limites de détection du test TBARS.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici pendant 1 h maximum.

4. Dosage TBARS

REMARQUE: Une fois que le test TBARS est démarré, il doit être terminé sans s’arrêter.

  1. Prenez autant de tubes de verre que nécessaire pour le nombre d’échantillons à analyser et étiquetez-les avec les noms des échantillons. Ensuite, ajoutez 100 μL de chaque échantillon préparé (comme décrit ci-dessus) à chaque tube de verre.
  2. Ajouter 200 μL de FDS à 8,1 % à chaque échantillon et étalon et faire tourbillonner doucement le tube de verre dans un mouvement circulaire pour mélanger l’échantillon.
  3. Ajouter 1,5 mL du tampon d’acétate de sodium de 3,5 M (pH = 4) à chaque échantillon et étalon.
  4. Ajouter 1,5 mL de solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 % (pH = 4) à chaque échantillon et étalon.
  5. Porter le volume final à 4 mL pour chaque échantillon et étalon en ajoutant 700 μL d’eau DI.
  6. Boucher hermétiquement chaque tube de verre et incuber dans un bloc chauffant réglé à 95 °C pendant 1 h. Couvrez les tubes de verre avec du papier d’aluminium pour éviter la condensation au sommet des tubes.
  7. Retirez les tubes de verre du bloc chauffant et incubez sur de la glace pendant 30 min.
  8. Échantillons et étalons de centrifugeuse à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C. Après centrifugation, maintenir les tubes de verre contenant les échantillons et les étalons à RT.
    REMARQUE : Le fait de garder les échantillons sur de la glace ou à 4 °C entraînera la précipitation de l’échantillon entier ou de l’étalon.
  9. Immédiatement après la centrifugation, aliquoter 150 μL de surnageant de chaque tube et placer dans un puits séparé d’une plaque de 96 puits.
  10. Retirez les bulles de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette.
    REMARQUE: La présence de bulles donnera des lectures d’absorbance incohérentes, ce qui entraînera une imprécision élevée du test.
  11. Lire les absorbances à 532 nm. Soustrayez la lecture moyenne de l’absorbance des échantillons vierges de toutes les autres lectures d’absorbance.
  12. Créez une courbe standard en traçant les lectures d’absorbance soustraites à blanc à 532 nm par rapport à la concentration connue de chaque étalon. Ajuster les points de données à l’aide de la régression linéaire. Calculer les concentrations inconnues de l’échantillon en utilisant l’équation de la droite de régression linéaire obtenue à partir de la courbe standard.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C, le malondialdéhyde (MDA) bis(diméthylacétal) donne du MDA23. Le MDA et les congénères chimiques étroitement apparentés réagissent avec deux molécules d’acide thiobarbiturique (TBA) pour produire des composés appelés substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS), qui donnent une couleur rouge-rose et ont une absorbance λmax à 532 nm (Figure 1, Figure 2). En utilisant MDA bis (diméthylacétal) comme norme, des courbes standard ont été générées (figure 3, tableau 1) pour déterminer les limites de détection et de sensibilité du test et les niveaux d’oxydation dans trois échantillons biologiques différents. Au total, neuf tests TBARS ont été effectués pour déterminer les niveaux d’oxydation dans les trois échantillons différents à des jours différents. Par conséquent, un total de neuf courbes standard ont été générées, comme le montre la figure 3. La procédure des moindres carrés24 a été utilisée pour déterminer les écarts-types de la pente et de l’interception y, qui étaient respectivement de 8,67 x 10-6 et 5,66 x 10-4.

Les limites de détection du test TBARS ont été déterminées selon des procédures analytiques standard25 en mesurant les absorbances des échantillons vierges (six répliques expérimentales avec deux répétitions techniques par réplique expérimentale) sur trois jours différents. Le signal analytique minimal distinguable (Sm) a été déterminé en additionnant la moyenne du signal vide (S̄bl) plus un multiple k de l’écart-type du blanc (ksbl), où k = 3. C’est-à-dire Sm = S̄bl+ ksbl. En utilisant Sm et la pente de la courbe standard (m), la limite de détection (cm) a été calculée comme cm = (Sm - S̄bl)/m. Les données résultantes des échantillons vierges sur trois jours différents montrent que la concentration minimale de substance TBARS nécessaire pour donner un signal d’absorbance non sonore détectable est de 1,1 μM (tableau 2). La sensibilité du test TBARS est d’environ 0,00160 unités d’absorbance/μM, ce qui est la capacité du test à distinguer les différences de concentration en analyte (tableau 2).

Pour illustrer l’applicabilité du test TBARS dans la détection de changements dans la peroxydation lipidique dans diverses matrices biologiques, CuCl2 a été utilisé pour induire l’oxydation in vitro du sérum humain, des lysats de cellules HepG2 et des lipoprotéines de basse densité. Ces échantillons biologiques utilisés ici sont des prototypes de matrices biologiques. Par exemple, sur la base des résultats présentés ici pour les lysats cellulaires HepG2, il est raisonnable de s’attendre à ce que ce test fonctionne avec d’autres types de lysat cellulaire; toutefois, il faudrait le valider analytiquement à cette fin. De plus, des trois matrices biologiques utilisées ici, il est courant que certains types d’échantillons présentent de faibles concentrations endogènes de TBARS. Par exemple, les TBARS pour les lysats cellulaires HepG2 qui n’ont pas été traités avec CuCl2 étaient juste au-dessus de la limite de détection du test (environ 2 μM; Graphique 4). Comme on pouvait s’y attendre en présence de faibles rapports signal/bruit, l’écart-type et le coefficient de variation pour cet échantillon particulier sont relativement élevés (tableau 3). Cependant, à mesure que le signal augmente à la suite de l’oxydation médiée par le Cu(II), le coefficient de variation diminue. En général, à mesure que l’absorbance augmente au-delà de la limite de détection, la reproductibilité du test s’améliore (tableau 3).

Aux fins de ce protocole, il n’y avait aucune volonté d’utiliser des antioxydants pour masquer l’oxydation in vitro médiée par le Cu(II) des échantillons biologiques. Les lipoprotéines de basse densité (LDL) préparées commercialement peuvent contenir 0,01 % d’EDTA. L’EDTA empêchera l’oxydation des LDL médiée par le Cu(II), mais pas nécessairement d’autres réactions d’oxydation à médiation métallique26,27. Un test TBARS a été effectué sur des échantillons de LDL contenant de l’EDTA, et les niveaux de TBARS n’ont pas changé entre les échantillons de LDL traités au Cu(II) et ceux non traités (Figure 5A). Cependant, après l’élimination de l’EDTA par filtration par spin (voir l’étape 1.2.3–1.2.5), le LDL a subi une oxydation médiée par le Cu(II), comme l’a détecté le test TBARS (Figure 5B).

La gamme normale de produits de peroxydation lipidique dans le sérum humain provenant de donneurs sains exprimée en termes de MDA se situe entre 1,80 et 3,94 μM28. Pour illustrer la plage dynamique du test TBARS dans le sérum humain, une concentration de 2 mM d’ions Cu(II) a été ajoutée aux échantillons, suivie d’une incubation de 24 h à 37 °C. Cela s’est traduit par une augmentation de 6 à 7 fois du TBARS (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Schéma des substances réactives de l’acide thiobarbiturique.
Cent microlitres d’échantillon ou d’étalon sont ajoutés à un tube de verre de 13 mm x 100 mm, suivis de l’ajout de réactifs de l’acide thiobarbiturique (TBARS). Après incubation à 95 °C pendant 1 h, les échantillons et les étalons sont incubés dans de la glace pendant 30 min, puis centrifugés à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Cent cinquante microlitres d’échantillon ou de surnageant standard sont chargés sur une plaque de 96 puits et l’absorbance est mesurée à 532 nm. La concentration inconnue de l’échantillon est calculée à l’aide de l’équation de la courbe standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Archétype de la réaction des substances réactives de l’acide thiobarbiturique.
Le malondialdéhyde bis(diméthylacétal) produit du malondialdéhyde sous hydrolyse catalysée par l’acide1. Le malondialdéhyde libéré (MDA) réagit ensuite avec deux molécules d’acide 2-thiobarbiturique (TBA) (pH = 4 et 95 °C) pour former des adduits MDA-TBA2 qui donnent une couleur rouge-rose et peuvent être mesurés spectrophotométriquement à 532 nm. Parce que d’autres molécules que MDA qui sont dérivées de lipides oxydés peuvent également réagir avec TBA, la mesure d’absorbance à 532 nm est simplement appelée une mesure de substances réactives de l’acide thiobarbiturique, ou TBARS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbes standard colorimétriques du malondialdéhyde bis(diméthylacétal).
La figure montre neuf courbes standard créées à différents jours. Certains points se chevauchent et ne peuvent être distingués les uns des autres. Le malondialdéhyde bis(diméthylacétal) a été enrichi en échantillons d’étalonnage à 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 μM (comme le montre le tableau 1; n = 1 par point de concentration par jour). L’absorbance a été mesurée à 532 nm, l’absorbance moyenne des échantillons vierges étant soustraite de toutes les mesures de ce lot, y compris les inconnues. Chaque jour, l’équation générée par la régression linéaire des moindres carrés a été utilisée pour déterminer le TBARS dans des échantillons biologiques. Pour les neuf courbes standard combinées, l’écart-type de la pente était de 8,67 x 10-6, et l’écart-type de l’interception y était de 5,66 x 10-4. Les écarts-types de la pente et de l’interception y ont été calculés à l’aide de la procédure des moindres carrés24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Oxydation dans les lysats d’hepG2 détectée par TBARS.
Six échantillons de lysat cellulaire HepG2 ont été incubés avec 2 mM cuCl2 [lysat cellulaire HepG2 + 2 mM Cu(II)] et six échantillons ont été incubés dans une solution sans CuCl2 (lysat cellulaire HepG2) pendant 24 h à 37 °C. Après l’incubation, le test TBARS a été effectué sur les 12 échantillons. Cette procédure a été répétée 2x pour un total de trois jours différents. Les barres d’erreur représentent la DS. L’astérisque indique des différences statistiquement significatives entre les lysats témoins et les lysats traités au Cu(II) (p < 0,001). La signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test Mann Whitney U dans GraphPad. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Oxydation dans les lipoprotéines de basse densité détectée par TBARS.
(A) Dosage TBARS effectué dans des échantillons de LDL contenant 0,01 % d’EDTA. Six échantillons de LDL ont été incubés avec 10 μM cuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)], et six échantillons ont été incubés avec une solution témoin sans Ajout de CuCl2 (LDL natif) pendant 2 h à 37 °C. Ensuite, un test TBARS a été effectué sur les 12 échantillons. « ns » ne représente aucune signification statistique. (B) Le LDL a été filtré à l’aide d’un dispositif de filtre à spin centrifuge pour éliminer l’EDTA. Ensuite, l’incubation avec et sans Ajout de Cu(II) a été effectuée à nouveau comme décrit pour (A). Le test TBARS a été effectué immédiatement après. Cette même procédure a été répétée 2x pour un total de 3 jours. Les barres d’erreur représentent la DS. Asterisk indique des différences statistiquement significatives entre les échantillons de LDL contrôlés et traités au Cu(II) (p < 0,001). La signification statistique a été déterminée à l’aide du test Mann Whitney U dans GraphPad. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Peroxydation lipidique dans des échantillons de sérum humain détectée par TBARS.
Six échantillons de sérum humain ont été incubés avec 2 mM de CuCl2 [sérum + 2 mM Cu(II)], et six échantillons ont été incubés avec une solution qui n’a pas ajouté de CuCl2 (sérum normal) pendant 24 h à 37 °C. Après l’incubation, le test TBARS a été effectué sur les 12 échantillons. Cette procédure a été répétée deux jours supplémentaires. Les barres d’erreur représentent la DS. Asterisk indique des différences statistiquement significatives entre les échantillons de sérum témoins et traités au Cu(II) (p < 0,001). La signification statistique a été déterminée à l’aide du test Mann Whitney U dans GraphPad. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tube de verre 200 μM MDA bis (diméthylacétal) (μL) Eau (μL) Concentration finale de MDA bis (diméthylacétal) (μM)
Aa 0 1000 0
B 12.5 987.5 2.5
C 25 975 5
D 50 950 10
E 100 900 20
F 200 800 40
G 400 600 80
H 800 200 160

Tableau 1 : Préparation de l’échantillon étalon de malondialdéhyde bis(diméthylacétal). À partir du malondialdéhyde bis(diméthylacétal) de 200 μM fraîchement préparé, aliquote les volumes suggérés pour atteindre la concentration finale pour la courbe standard. Il est recommandé d’effectuer au moins six répétitions de l’échantillon vierge (A) par jour pour déterminer les limites de détection de la méthode.

Jour Absorbancea Sblb Smc Sensibilité (unités d’absorbance/μM)d cm (μM)e
1 (n = 6) 0.0412 0.000612 0.0430 0.00160 1.14
2 (n = 6) 0.0415 0.000632 0.0433 0.00160 1.18
3 (n = 6) 0.0413 0.000605 0.0431 0.00160 1.13
Les trois jours (n = 18) 0.0413 0.000589 0.0431 0.00160 1.10
un Absorbance des échantillons vierges sur trois jours différents avec 6 répétitions par jour.
bSbl = Écart-type de l’absorbance des échantillons vierges.
cSm = Signal analytique minimal distinguable, qui a été déterminé en additionnant la moyenne du signal vide (S̄bl) plus un multiple k de l’écart-type du blanc (ksbl), où k = 3. C’est-à-dire; Sm = S̄bl + ksbl.
d Sensibilité du test TBARS, qui est la pente de la courbe standard.
ecm = Limites de détection, qui a été calculée comme cm = (Sm - S̄bl)⁄m, où m = la pente de la courbe standard.

Tableau 2 : Limites de détection du test TBARS.

Lipoprotéines de basse densité Sérum humain Lysat de cellules HepG2
Jour % CV Jour % CV Jour % CV
1 (n = 6) 5.6 1 (n = 6) 7.9 1 (n = 6) 12.6
2 (n = 6) 5.4 2 (n = 6) 7.2 2 (n = 6) 15.8
3 (n = 6) 3.9 3 (n = 6) 7.0 3 (n = 6) 17.7
Les trois jours (n = 18)a 7.4 Les trois jours (n = 18) 9.8 Les trois jours (n = 18) 15,5 ter
Avec 10 μM CuCl2 Avec 2 mM CuCl2 Avec 2 mM CuCl2
1 (n = 6) 4.5 1 (n = 6) 6.0 1 (n = 6) 5.8
2 (n = 6) 6.5 2 (n = 6) 4.3 2 (n = 6) 6.0
3 (n = 6) 6.7 3 (n = 6) 6.2 3 (n = 6) 8.0
Les trois jours (n = 18) 6.1 Les trois jours (n = 18) 5.6 Les trois jours (n = 18) 7.3
un La précision interjournalière a été calculée en regroupant les données des trois jours.
b La précision était limitée en raison de résultats proches de la LOD du test.

Tableau 3 : Reproductibilité analytique du TBARS dans trois échantillons biologiques différents.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Malgré ses limites1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 et un manque d’aptitude à la comparaison entre laboratoires, le test TBARS est l’un des plus anciens29,30 mais les tests les plus largement utilisés pour mesurer le stress oxydatif dans les échantillons biologiques. Le test TBARS est une méthode simple qui ne prend qu’environ 2 heures à effectuer, une fois que tous les réactifs requis ont été préparés. Ici, nous avons décrit en détail comment ce test, y compris la courbe standard, peut être effectué plusieurs fois de manière économique (environ 3,50 USD pour 96 échantillons), sans avoir à acheter un kit coûteux pour chaque lot d’échantillons.

Toutes les étapes du test sont critiques, mais certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le pH de l’acide thiobarbiturique ne doit pas être supérieur à 4. Des précautions doivent être prises lors de l’ajout de la solution d’hydroxyde de sodium à l’acide thiobarbiturique et éviter d’obtenir un pH supérieur à 4. Un environnement acide est nécessaire pour que la réaction entre MDA et TBA se produise, et la norme MDA est libérée par MDA bis (diméthylacétal) par hydrolyse catalysée par l’acide. Par conséquent, un pH élevé peut conduire à des résultats imprévisibles et très variables31.

En outre, bien que cela puisse être évident pour certains lecteurs, il est également essentiel d’éliminer les bulles dans la plaque de 96 puits avant de mesurer l’absorbance. La présence de bulles produira des valeurs d’absorbance élevées et des différences entre les réplicats, ce qui entraînera un pourcentage élevé de CV. De plus, après 1 h d’incubation à 95 °C, les échantillons ne doivent pas être incubés plus de 30 minutes sur de la glace, car cela précipitera l’échantillon entier et la collecte d’un surnageant sans précipité sera difficile à réaliser. Notamment, il n’y a pas de bons points d’arrêt une fois que le test TBARS a été commencé. Il devrait être complété une fois initié. Enfin, il existe de nombreuses variations méthodologiques possibles qui peuvent être appliquées à ce test. Le protocole général décrit ici peut être adapté (et validé) pour des applications spécifiques, y compris celles dans lesquelles l’ajout de piégeurs de radicaux ou d’autres types d’antioxydants avant l’analyse est nécessaire.

Bien que le test TBARS soit populaire, il est important de réaliser qu’il ne s’agit pas d’un test moléculairement spécifique. De nombreuses molécules organiques contenant du carbonyle chimiquement réactives, y compris celles dérivées de biomolécules oxydées autres que les lipides, peuvent réagir avec le TBA et sont donc comptées comme TBARS1,32,33,34. En outre, les limites de détection du test TBARS basé sur l’absorbance ne sont pas beaucoup mieux qu’environ 1,1 μM, telles que déterminées par cette méthode. Cependant, les limites de la détection peuvent être améliorées en utilisant d’autres méthodes de détection. Par exemple, la spectrofluorométrie avec excitation à 520 nm et émission à 550 nm offre une sensibilité plus élevée et de meilleures limites de détection, comme suggéré précédemment par Jo et Ahn35. Les méthodes basées sur la spectrométrie de masse peuvent améliorer considérablement la spécificité et les limites de détection. Par exemple, une méthode GC-MS/MS avec ionisation chimique à ions négatifs par capture d’électrons (ECNICI) a été utilisée pour détecter le dérivé pentafluorobenzyle de MDA dans des échantillons de sérum et d’urine humains, avec des limites de détection de 2 x 10-18 mol MDA sur colonne36. Ici, la séparation chromatographique, en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem, améliore considérablement la spécificité moléculaire du test.

Néanmoins, comme pour d’autres mesures des processus oxydatifs dans les échantillons biologiques37,38, la manipulation préanalytique des échantillons est essentielle aux résultats des mesures TBARS. Par exemple, le stockage du plasma sanguin à -20 °C entraîne une augmentation lente mais spectaculaire des concentrations de MDA39,40. Ainsi, l’exposition d’échantillons biologiques à des conditions décongelées ou même partiellement décongelées pendant tout sauf un minimum de temps devrait être supposée entraîner une élévation artificielle des niveaux de TBARS. Cela signifie que même une variabilité modeste dans la manipulation et le stockage préanalytiques des échantillons biologiques qui doivent être comparés à l’aide du test TBARS doit être évitée.

Compte tenu de ces mises en garde liées à la variabilité préanalytique ainsi qu’à la sensibilité et à la spécificité limitées, il est recommandé que le test TBARS basé sur l’absorbance ne soit utilisé que pour des expériences d’évaluation générale ou de recherche de portée intra-laboratoire. Ces applications comprennent des études dans lesquelles les niveaux relatifs de TBARS sont directement comparés entre un ou plusieurs groupes d’échantillons biologiquement similaires qui sont traités ou stockés ensemble et séparés par une seule variable entièrement contrôlée par les chercheurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

La recherche rapportée ici a été soutenue en partie par l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de bourse. R33 CA217702 et le programme Initiative pour maximiser le développement des élèves (IMSD). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642--262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Tags

Chimie numéro 159 substances réactives de l’acide thiobarbiturique TBARS oxydation peroxydation lipidique malondialdéhyde MDA acide thiobarbiturique TBA stress oxydatif
Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. … More

Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter