Summary
티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.
Abstract
제한된 분석 특이성과 견고함에도 불구하고 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석법은 생물학적 유체의 지질 과산화의 일반적인 지표로 널리 사용되고 있습니다. 시료가 적절히 처리되고 저장되었다는 경우 생물학적 시료 내에서 산화 스트레스 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 분석은 지질 과산화 제품의 반응을 포함, 주로 말론 다이얼데히드 (MDA), 티오 바르비투산 (TBA),TBAR라는 MDA-TBA2 어덕트의 형성에 이르게. TBARS는 532 nm에서 분광측정으로 측정할 수 있는 빨간색 분홍색 색상을 생성합니다. TBARS 분석법은 산성 조건(pH = 4) 및 95°C에서 수행됩니다. 순수 MDA는 불안정하지만 이러한 조건은 MDA 비스 (디메틸 아세탈)에서 MDA의 방출을 허용하며, 이는이 방법의 분석 표준으로 사용됩니다. TBARS 분석법은 약 2시간 안에 완료할 수 있는 간단한 방법입니다. 분석 시약의 준비는 여기에서 자세히 설명되어 있습니다. 예산에 민감한 연구원은 단일 표준 곡선의 시공을 허용하는 고가의 TBARS 분석 키트를 구입하는 대신 저렴한 비용으로 여러 실험에 이러한 시약을 사용할 수 있습니다 (따라서 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다). 이 TBARS 분석법의 적용성은 인간 혈청, 저밀도 지단백 및 세포 용해에서 나타난다. 분석은 일관되고 재현 가능하며 1.1 μM의 검출 한계에 도달 할 수 있습니다. 분광성 TBARS 분석기의 사용 및 해석에 대한 권장 사항이 제공됩니다.
Introduction
지질 과산화는 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종과 같은 자유 라디칼이 지질의 탄소 탄소 이중 결합을 공격하는 과정으로, 탄소로부터의 수소의 추상화와 산소 분자의 삽입을 수반하는 과정입니다. 이 과정은 주요 제품으로 지질 페록실 라디칼, 하이드로퍼산화물, 말론다이얼데히드(MDA) 및 4-하이드록시논날을 주요 이차 제품으로 포함하는 복잡한 제품의 혼합물로 이어집니다1.
MDA는 티오바르비투릭 산 (TBA)과의 촉진 반응으로 인해 지질 과산화의 마커로 생물 의학 연구에서 널리 사용되었습니다. 반응은 MDA-TBA2의 형성으로 이끌어 냅니다, 532 nm에서 가시 스펙트럼에서 흡수하고 빨간 분홍색 색깔2를 생성하는 합자. MDA 외에 지질 과산화에서 파생 된 다른 분자는 또한 TBA와 반응하고 532 nm에서 빛을 흡수 할 수 있으며, 측정되는 전반적인 흡수 신호에 기여합니다. 유사하게, MDA는 생체 분자의 대부분의 그밖 주요 종류와 반응할 수 있습니다, 잠재적으로 TBA3,4를 가진 반응에 대한 그것의 접근성을 제한합니다. 이와 같이, 이 전통적인 분석은 단순히 측정 하는 것으로 간주 됩니다 "티오 바르 비 투 릭 산 반응 물질" 또는 TBARS5.
올바르게 적용되고 해석될 때, TBARS 분석법은 일반적으로 생물학적 샘플6에서 산화 스트레스의 전반적인 수준을 나타내는 좋은 지표로 간주됩니다. 불행하게도, Khoubnasabjafari 와 다른 사람에 의해 문서화 된 바와 같이, TBARS 분석은 종종 수행되고 모호한 결론을 용이하게하는 방법으로 해석3,4,7,8,9,10,11. 이에 대한 원인은 주로 샘플 관련 사전 분석 변수와 분석 결과에 상당한 변화없이 분석 프로토콜의 겉보기 사소한 변화를 금지하는 분석 견고성의 부족에 뿌리를 두고 있습니다11,7,12,13.
바이오시메시 처리 및 저장과 관련된 사전 분석 변수(예를 들어, 혈장은 일시적으로 -20°C)14,15에 TBARS 분석 결과 16,17에 큰 영향을 미칠 수 있다; 따라서 TBARS 분석 결과는 명시적 실험실 간 분석 유효성 검사 데이터에 의해 보증되지 않는 한 다른 실험실에서 비교해서는 안 됩니다. 이 권장 사항은 서양 얼룩이 일반적으로 사용되고 해석되는 방식과 비슷합니다. 밴드 밀도의 비교는 내부 블롯과 아마도 실험실 내 연구에 유효하지만 실험실 간의 대역 밀도비교는 일반적으로 잘못된 관행으로 간주됩니다.
몇몇 연구원은 TBARS 분석에 의해 측정된 MDA가 단순히 허용가능한 biomarker3,9,10,18,19의 요구된 분석 또는 임상 기준을 충족하지 않는다는 것을 건의했습니다. 실제로, 분석이 50 년 전에 개발되지 않았다면, 그것은 아마 오늘날 널리 사용되고 암묵적 인 수용성을 얻지 못했을 것입니다. 산화 스트레스를 결정하는 데 사용되는 더 큰 분석 감도, 특이성 및 견고성을 가진 다른 분석이 있지만, 532 nm의 흡수도에 기초한 TBARS 분석법은 지질 과산화의 결정에 가장 일반적으로 사용되는 분석 중 하나까지 남아 있으며, 따라서 산화 스트레스의 평가.
TBARS 분석법은 고가의 키트(400달러 이상)로만 찾을 수 있으며, 지침은 사용되는 대부분의 시약 농도에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 또한 제공된 시약은 키트당 하나의 컬러메트릭 표준 곡선만 만들 수 있기 때문에 하나의 실험에만 사용할 수 있습니다. 동일한 표준 곡선을 여러 번 사용할 수 없기 때문에 이것은 다른 시점에서 몇 가지 샘플 내에서 산화 수준을 결정하려는 연구자에게 문제가 될 수 있습니다. 따라서 여러 실험을 위해 여러 키트를 구입해야 합니다. 현재 고가의 키트를 구입하지 않는 한 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 사용할 수 있는 자세한 프로토콜이 없습니다. 과거에 일부 연구자들은 TBARS 분석21,22를 수행하는 방법을 모호하게 설명했지만, 고가의 키트없이 TBARS 분석법을 수행하는 방법에 대한 완전히 상세한 프로토콜이나 포괄적 인 비디오는 문헌에서 사용할 수 없습니다.
여기에서는 간단하고 재현 가능하며 저렴한 방법으로 TBARS 분석기를 수행하는 방법에 대한 자세한 분석 검증 방법론을 보고합니다. 인간 혈청의 지질 과산화의 변화, HepG2 용해, Cu(II) 이온을 치료할 때 저밀도 지단백은 TBARS 분석에 대한 예시적인 응용 프로그램으로 입증된다. 결과는 이 TBARS 분석이 매일 일관되고 재현가능한 것으로 보여 줍니다.
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Protocol
인간 혈청 표본은 IRB 승인에 따라 자원 봉사자의 동의와 헬싱키 선언에 표현 된 원칙에 따라 얻은. 표본은 분석 실험실로 이송되기 전에 코딩및 식별을 해제했습니다.
1. 샘플 준비
- HepG2 셀 용해
- 16T75 플라스크에서 플라스크 당 약 10 x 106 HepG2 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하고 2일 동안 세포를 성장시켰다.
- RIPA 버퍼 준비: 50 mL 튜브에서 5 M NaCl의 1.5 mL, 1 M Tris-HCl (pH = 7)의 2.5 mL, NP-40 시약의 500 μL을 추가 한 다음 DI 물로 최종 부피를 50 mL로 가져 올립니다.
- 리시스 버퍼 준비: ALIquot 20 mL의 RIPA 버퍼를 50 mL 튜브에 넣고 단백질과 지질 분해를 억제하기 위해 100x 프로테아제 억제제 용액의 200 μL을 추가합니다. 4 °C에 보관하십시오.
참고: 리시스 버퍼는 TBARS 시약과 호환되며 532 nm에서 흡광도를 방해하지 않습니다. 다른 리시스 버퍼를 사용하거나 리시스 버퍼에 추가 성분을 추가하려는 경우 리시스 버퍼 구성 요소가 TBARS 분석과 호환되는지 확인하기 위해 예비 유효성 검사 연구를 수행해야 합니다. - 10% FBS를 함유한 미디어를 제거하고 5mL의 냉멸 살균 1x PBS로 셀 2배 세척합니다.
- 세포를 포함하는 T75 플라스크에 1mL의 용해 버퍼를 추가하고 상온(RT)에서 10분 동안 배양하여 버퍼가 잘 분산되도록 합니다.
- lysates를 적절하게 라벨로 2 mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 수집하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 리스를 5,000 x g에서 10분 동안 회전하여 셀 이물질을 수집하고 슈퍼네티를 단일 15mL 튜브로 흡인합니다.
- 농축 셀은 50°C및 3mbar의 속도 진공을 사용하여 슈퍼쿼터를 4배 씩 분해하고 각각 94 μL의 알리쿼트를 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 만듭니다. 시험관 내 산화 및/또는 TBARS 분석에 사용될 때까지 샘플을 -80°C에 저장합니다.
참고: 세포 용해 체계를 집중하지 않으려면, 세포는 또한 1x 트립신3mL을 사용하여 분리될 수 있고, 6mL의 미디어로 중화되고, 감기 PBS5mL로 2x를 세척할 수 있다. 그런 다음 세포 펠릿을 250μL의 리시스 버퍼로 재구성할 수 있으며, 1.1.6 및 1.1.7 단계는 다음 수행될 수 있다. - 아세트산(pH =4)으로 35m CuCl2 스톡 용액을 준비한다.
- 아세트산 용액 준비(pH = 4): 100mL의 DI 수에서 빙하 아세트산 1μL을 희석하십시오(pH는 약 4이어야 하지만 pH 미터로 이를 확인). pH를 4로 조정하기 위해 물 이나 아세트산을 더 넣습니다.
- 구리 II 염화물의 약 0.1936 g의 무게를 내밀고 144mM CuCl2 재고를 만들기 위해 아세트산 용액(pH = 4)의 10mL에 용해한다. 이 용액에서 Aliquot 490 μL및 35mM CuCl2 용액을 만들기 위해 아세트산 (pH = 4)의 1,510 μL에 추가합니다.
- 35m CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 사용하여 세포 용액의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 CuCl2 농도를 만듭니다. 대조군으로 사용하기 위해 94 μL의 세포 용액을 포함하는 6개의 샘플에 CuCl2 가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다. 셀 리세이트의 최종 부피는 100 μL이어야 하며, 이는 TBARS 분석에 사용될 것입니다.
참고: 구리 수산화물의 침전을 방지하기 위해 아세트산(pH = 4)으로 35m MM CuCl2 스톡 용액을 만드는 것이 필요하다. - 24시간 동안 37°C의 오븐에서 샘플을 배양하고 100 μL의 최종 부피를 포함하는 각 샘플에 TBARS 분석작업을 수행한다.
- HepG2 세포 용해제에 대한 TBARS 분석의 재현성을 확인하기 위해 별도의 일에 1.1.9 및 1.1.11 2배를 반복합니다.
- 저밀도 지단백
참고: 전형적으로, 미리 정제된 저밀도 지단백(LDL)은 EDTA의 어느 양을 포함합니다. 여기서 사용되는 LDL 샘플에는 0.01% EDTA가 포함되어 있습니다. EDTA는 LDL의 체외 Cu(II)-매개 산화를 억제할 수 있다. 따라서 실험 또는 분석 전에 LDL 샘플에서 EDTA를 제거해야 할 수도 있습니다. 1.2.1-1.2.5 단계는 이 프로세스를 설명합니다.
주의: 수산화 나트륨은 부식성이며 피부와 눈에 자극을 일으킵니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.- Aliquot 24 μL은 5.51 mg/mL LDL 스톡(BSA를 표준으로 사용하여 수정된 Lowry 방법에 의해 결정된 단백질 농도)을 1mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브로 적절히 표지하였다. 필요에 따라 많은 알리코를 만들고 산화 및/또는 TBARS 분석에서 사용할 때까지 4 °C에 보관하십시오.
- NaOH 구슬을 사용하여 pH = 7으로 조정된 0.15 M NaCl에서 10mM HEPES 버퍼를 준비합니다: 0.49 L의 물에 NaCl 4.39 g를 용해한 다음 HEPES 1.19 g을 추가합니다. 교반 바에 잘 녹입니다. pH가 7이 될 때까지 수산화 나트륨 구슬을 추가합니다. 물로 0.5 L로 희석하십시오. 버퍼를 4°C로 저장하고 3개월 이내에 사용하십시오.
- 10m HEPES 버퍼의 476 μL을 0.15 M NaCl(pH = 7)에 알리인용 LDL 샘플에 추가하여 최종 부피를 500 μL로 가져옵니다. 희석된 LDL 샘플을 100K 분자량 차단 장치로 0.5mL 원심 스핀 필터 장치에 추가합니다.
- RT에서 10분 동안 14,000 x g의 샘플을 회전하여 약 30 μL의 최종 재보전 부피를 남깁니다. 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10m HEPES 버퍼의 480 μL에서 샘플을 재구성하고 RT에서 10분 동안 14,000xg에서 다시 회전합니다.
- 필터 장치를 새로운 2mL 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브에 거꾸로 놓고 원심분리기를 1000 x g에 2분 동안 배치하여 LDL 샘플을 수집합니다(최종 부피 = 약 30 μL).
- Aliquot 샘플을 적절하게 표지된 1mL 튜브로 샘플링하고 각 샘플에 20 μL의 물을 추가하여 최종 부피 50 μL을 달성합니다.
- 아세트산 내 200 μM CuCl2 스톡 용액 의 제제 (pH = 4)
- 아세트산 용액 준비(pH = 4): 1.1.9.1 단계를 참조하십시오.
- 144m CuCl2 스톡 용액(단계 1.1.9.2 참조), 144m CuCl2 스톡에서 알리쿼트 5.5 μL을 준비하고 200 μM 용액을 만들기 위해 4mL의 아세트산(pH= 4)의 최종 부피로 용해한다.
- 200 μM CuCl2 스톡 용액으로부터 2.7 μL을 알리쿼트 2.7 μL을 추가하고 LDL의 50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 ~10 μM의 최종 CuCl2 농도를 달성한다. 대조군에 사용될 LDL50 μL을 포함하는 6개의 샘플에 CuCl2 를 포함하지 않는 아세트산 용액(pH = 4)에서 2.7 μL을 추가합니다.
- 37°C에서 오븐에서 2h에 대한 LDL 샘플을 배양합니다. 2시간 후, 0.15 M NaCl(pH = 7)의 10mM HEPES 버퍼를 가진 각 샘플에 대해 최종 부피를 100 μL로 가져옵니다. 즉시 TBARS 분석체를 수행합니다.
- TBARS 분석의 재생산성을 테스트하기 위해 2일 동안 1.2.3-1.2.9 배의 단계를 반복합니다.
- 인간 혈청
- 인간 혈청 샘플에서, 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 각각 94 μL의 알리쿼트를 만들고 -80 °C에서 샘플을 저장합니다.
- 아세트산(pH = 4)으로 35m CuCl2 스톡 용액을 준비하십시오( 1.1.9단계 참조).
- CuCl2 스톡 용액으로부터 의 알리쿼트 6 μL을 인간 혈청 의 94 μL을 포함하는 6개의 샘플에 추가하여 약 2mM의 최종 CuCl2 농도를 만듭니다. 제어로 사용하기 위해 인간 혈청의 94 μL을 포함하는 6개의 견본에 CuCl2가 없는 아세트산 용액(pH = 4)의 6μL을 추가합니다.
- 37°C에서 오븐에서 24시간 동안 인간 혈청 샘플을 배양하고 TBARS 분석(섹션 4)을 사용하여 산화 수준을 결정합니다.
- TBARS 분석의 재현성을 결정하기 위해 2일 동안 1.3.2-1.3.4 2배를 반복합니다.
2. 시약 준비
주의: 티오바르비투릭 산은 피부와 눈 자극을 유발하며 흡입이나 피부 흡수로 인해 해를 끼칠 수 있습니다. 아세트산은 흡입하면 내부 장기를 손상시킬 수 있습니다. 연기 후드에 모든 산 성 솔루션을 준비합니다.
- 도데딜설페이트 나트륨(SDS) 용액 8.1% (w/v) 제제
- 32.4 g의 SDS를 무게로 빼내고 비커에 350mL의 DI 물에 용해하십시오. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 SDS를 부드럽게 녹이고 거품을 일으키지 마십시오. 최종 볼륨을 400mL에 DI 워터로 가져와 RT에 SDS 솔루션을 저장합니다.
참고: 여기에 초과 8.1% SDS 솔루션이 준비됩니다. 그러나, 96개의 견본을 위해, 8.1% SDS 용액의 대략 20 mL만 필요합니다. 분석되는 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.
- 32.4 g의 SDS를 무게로 빼내고 비커에 350mL의 DI 물에 용해하십시오. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 SDS를 부드럽게 녹이고 거품을 일으키지 마십시오. 최종 볼륨을 400mL에 DI 워터로 가져와 RT에 SDS 솔루션을 저장합니다.
- 3.5M 아세테이트 버퍼 준비(pH = 4)
- 비커에 DI 수의 350 mL에 빙하 아세트산 100 mL을 희석. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다.
- 물에 수산화 나트륨 구슬을 사용하여 6.5 M NaOH 솔루션을 준비하십시오. NAOH 구슬 13g을 디수 40mL에 녹여 DI 물로 50mL의 최종 부피를 가져옵니다.
- 교반 바와 혼합하는 동안 아세트산 용액에 6.5M NaOH 용액의 약 46mL를 천천히 추가하십시오(pH를 4로 높여야 하지만 pH 미터를 사용하여 측정하면서 NaOH 용액을 천천히 첨가하여 확인하십시오).
- DI 물로 최종 볼륨을 500mL로 가져와 RT에 아세테이트 버퍼를 보관하십시오.
- 티오바르비투릭산의 0.8% 수성 용액 제제(pH = 4로 조정)
참고: 이 단계에서, 티오바르비투릭 산의 제제는 대량에 최적화되어 있으며, 이는 많은 수의 시료가 분석될 것이기 때문에(표준을 포함하지 않는 108개의 시료). 분석을 위해 계획된 샘플 수에 따라 이 솔루션을 준비합니다.- 수산화 나트륨 구슬과 물을 사용하여 5M 나트륨 수산화 용액을 준비하십시오 : 수산화 나트륨 구슬 4 g을 20 mL의 최종 부피로 용해하십시오. 플라스틱 용기에 보관하십시오. 이 솔루션은 각 배치에 대해 새로 준비해야 합니다.
- 티오바르비투릭 산의 무게 4 g와 디 워터 450mL를 추가합니다. 마그네틱 스터디 바를 사용하여 부드럽게 녹입니다.
참고: 이 솔루션은 결국 500mL 총 부피로 가져올 것입니다. - 스티어 바와 티오바르비투릭 산을 용해하는 동안, 100 μL 증분에 5 M NaOH 용액의 약 3mL (천천히 그리고 드롭 와이즈 방식으로) 추가합니다. NaOH 용액을 추가한 후 티오바르비투르산 입자가 용해되기 시작합니다.
- 티오바르비투르산 입자가 여전히 완전히 용해되지 않은 경우, 모든 티오바르비투릭 산 입자가 완전히 용해될 때까지 100μL 증분에 5M NaOH 용액을 더 추가합니다. 이러한 특정 용액의 경우, 티오바르비투릭 산 입자를 완전히 용해시키기 위해 5M NaOH 용액의 총 4mL이 첨가된다.
참고: 이 농도에서, 티오바르비투릭 산은 pH가 거의 4인 경우가 아니면 완전히 녹지 않을 것입니다. - 모든 티오바르비투릭 산이 완전히 용해 된 후 NaOH를 추가 중지합니다. pH를 4를 초과하지 마십시오. 최종 pH는 혼합 티오바르비투릭 산 용액으로부터 1 μL을 복용하여 pH 용지에 배치하여 확인할 수 있습니다.
- 최종 부피를 DI 물로 500mL로 가져와 서서0.8% 티오바르비투릭 산 용액을 RT에 저장합니다.
3. 말론디알데히드 비스(디메틸 아세트탈) 표준 샘플 준비
참고: 말론다이얼데히드(MDA)는 불안정하며 시판할 수 없습니다. 그러나 MDA 테트라부틸람모늄 염, MDA 비스(디메틸 아세탈), MDA 비스(diethyl acetal)와 같이 상용화되는 다양한 화학적 형태가 있다. 이러한 세 가지 화학 형태 중 MDA 비스(dimethyl acetal)는 대부분의 연구가 동일한 표준을 사용하기 때문에 여기에서 사용됩니다21,22. MDA의 다른 두 가지 화학 적 형태를 사용하기로 선택한 경우 적합성에 대한 사전 검증이 수행되어야합니다.
- 순MDA 비스(디메틸 아세탈)의 92 μL을 DI 수의 1L에 희석하여 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡 솔루션을 준비한다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 10분 동안 용액을 완전히 혼합합니다. 용액을 4°C로 저장하고 1개월 이내에 사용하십시오.
- 디워터 1274μL의 550 μM MDA 비스(디메틸 아세탈) 스톡에서 726 μL을 희석하여 200 μM MDA 비스(디메틸 아세트탈)를 준비한다. 이 200 μM MDA 비스 (디메틸 아세트탈) 솔루션은 TBARS 분석이 수행 될 때마다 신선한 준비되어야한다.
- 표준 곡선 준비: 8 2mL 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브를 가지고 200 μM 스톡에서 MDA 비스 (디메틸 아세트탈)를 추가하고 표 1에 설명 된 대로 물에 희석 H를 통해 문자 A로 라벨을 부착하십시오.
- 8개의 유리 튜브(13mm x 100mm)를 가지고 A-H에 라벨을 붙인 다음 해당 튜브에 100 μL의 표준을 추가합니다. TBARS 분석기의 검출 한계를 계산하기 위해 빈 표준(샘플 A)에 대해 6개의 복제본을 수행합니다.
참고: 프로토콜을 1h 이하로 일시 중지할 수 있습니다.
4. TBARS 분석
참고: TBARS 분석이 시작되면 멈추지 않고 완료해야 합니다.
- 샘플 수를 분석하고 샘플의 이름으로 라벨을 붙일 수 있도록 필요한 만큼 유리 튜브를 가져 가라. 그런 다음, 각 유리 튜브에 각 준비된 샘플(위에서 설명한 대로)의 100 μL을 추가합니다.
- 각 샘플에 8.1% SDS의 200 μL을 추가하고 표준을 정하고 부드럽게 샘플을 혼합하기 위해 원형 모션으로 유리 튜브를 소용돌이.
- 각 샘플 및 표준에 3.5M 아세테이트 버퍼(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.
- 각 시료 및 표준에 수성 0.8% 티오바르비투릭 산 용액(pH = 4)의 1.5mL를 추가합니다.
- 700 μL의 DI 물을 추가하여 각 시료및 표준에 대해 최종 부피를 4mL로 가져옵니다.
- 각 유리 튜브를 단단히 캡하고 1 h에 대한 95 °C로 설정 된 가열 블록에서 배양하십시오. 유리 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 튜브 꼭대기에서 응축을 방지합니다.
- 가열 블록에서 유리 튜브를 제거하고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 원심분리기 샘플 및 표준은 4°C에서 10분 동안 1500 x g의 샘플및 표준입니다. 원심 분리 후, RT에서 샘플 및 표준을 포함하는 유리 튜브를 유지합니다.
참고: 샘플을 얼음 또는 4°C로 유지하면 전체 샘플 또는 표준이 침전됩니다. - 원심분리 직후, 각 튜브에서 150 μL의 상류체를 알리쿼트하여 96웰 플레이트의 별도의 우물에 넣습니다.
- 파이펫 팁을 사용하여 각 우물에서 거품을 제거합니다.
참고: 거품의 존재는 일관성없는 흡광도 판독값을 산출하여 높은 분석 부정확성으로 이어질 것입니다. - 532 nm에서 흡광도를 읽습니다. 다른 모든 흡광도 판독값에서 빈 샘플의 평균 흡광도 판독값을 뺍니다.
- 각 표준의 알려진 농도 대 532 nm에서 빈 감도 흡수도 판독값을 플로팅하여 표준 곡선을 만듭니다. 선형 회귀를 사용하여 데이터 점을 맞춥시게 합니다. 표준 곡선에서 얻은 선형 회귀 라인의 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플 농도를 계산합니다.
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Representative Results
산성 조건(pH = 4)과 95°C에서 말론다이얼데히드(MDA) 비스(디메틸 아세트탈)는 MDA23을 산출한다. MDA와 밀접한 관련이 있는 화학 콘게너들은 티오바르비투르산(TBA)의 두 분자와 반응하여 티오바르비투릭 산 반응성 물질(TBARS)이라고 불리는 화합물을 생산하여 붉은 분홍색 색상을 주고 532nm에서 흡수성 λmax 를 갖는다(도 1, 도 2). MDA 비스(dimethyl acetal)를 표준으로 사용하여 표준 곡선(도 3, 표 1)이 생성되어 3개의 상이한 생물학적 샘플에서 분석 및 산화 의 검출 및 검출 도성의 한계를 결정하였다. 총 9개의 TBARS 소약이 다른 날에 3개의 다른 견본에 있는 산화의 수준을 결정하기 위하여 수행되었습니다. 따라서 그림 3에 도시된 바와 같이 총 9개의 표준 커브가 생성되었습니다. 최소 제곱 프로시저24 는 각각 8.67 x 10-6 및 5.66 x 10-4였던 경사 및 y-intercept의 표준 편차를 결정하는 데 사용되었다.
TBARS 분석법의 검출 한계는 3일 동안 빈 시료의 흡광도(실험 복제당 2개의 기술적 복제로 6개의 실험 복제)를 측정하여 표준 분석 절차25에 따라 결정되었다. 최소 구별 가능한 분석 신호(Sm)는 빈 신호(Sθbl)의 평균과 k=3의 빈(ksbl)의 표준 편차의 다중 k를 합산하여 결정하였다. 즉, Sm = Sθbl + ksbl. Sm과 표준 곡선(m)의 경사를 사용하여 검출 한계(cm)는 cm=(Sm-Sθbl)/m으로 계산하였다. 3일 동안 빈 시료의 결과 데이터는 검출 가능한 비잡음 흡광도 신호를 제공하는 데 필요한 TBARS 물질의 최소 농도가 1.1 μM(표 2)임을 보여줍니다. TBARS 분석의 감도는 약 0.00160 흡광도 단위/μM이며, 이는 분석농도의 차이를 구별하는 분석의 능력이다(표 2).
다양한 생물학적 매트릭스에서 지질 과산화의 변화를 검출하는 TBARS 분석의 적용성을 설명하기 위해 CuCl2 는 인간 혈청, HepG2 세포 용해및 저밀도 지단백질의 체외 산화를 유도하는 데 사용되었습니다. 여기에 사용되는 이러한 생물학적 샘플은 생물학적 행렬의 프로토 타입입니다. 예를 들어, HepG2 세포 용해용으로 여기에 제시된 결과에 기초하여, 이 분석이 다른 유형의 세포 용해와 함께 작동할 것으로 기대하는 것이 합리적입니다. 그러나 이러한 목적을 위해 이를 위해 이를 위해 유효성을 검사해야 합니다. 또한, 여기서 사용되는 3개의 생물학적 행렬 중, 특정 유형의 샘플이 TBARS의 낮은 내인성 농도를 나타내는 것이 일반적이다. 예를 들어, CuCl2 로 처리되지 않은 HepG2 셀 용액에 대한 TBARS는 분석의 검출 한계(약 2 μM) 이상이었습니다. 그림 4). 낮은 신호 대 잡음 비율이 있는 상황에서 예상되는 바와 같이, 이 특정 샘플에 대한 변형의 표준 편차 및 계수는 상대적으로 높다(표 3). 그러나, Cu(II) 매개 산화의 결과로 신호가 증가함에 따라, 변화의 계수는 낮아진다. 일반적으로 흡광도가 검출 한계를 넘어서면서 분석 재현성이 향상됩니다(표 3).
이 프로토콜의 목적을 위해, 생물학적 샘플의 체외 Cu (II)매개 산화를 마스크 산화를 사용하는 욕망이 없었다. 상업적으로 제조된 저밀도 지단백(LDL)은 0.01% EDTA를 함유할 수 있다. EDTA는 LDL의 Cu(II)매개 산화를 방지하지만 반드시 다른 금속 매개 산화 반응26,27을 방지할 수 있습니다. TBARS 분석법은 EDTA를 포함하는 LDL 샘플에서 수행되었으며, TBARS의 수준은 Cu(II)처리 및 처리되지 않은 LDL 샘플 간에 변경되지 않았다(도 5A). 그러나, EDTA가 스핀 여과(1.2.3-1.2.5 단계 참조)에 의해 제거된 후, LDL은 TBARS 분석(도 5B)에 의해 검출된 Cu(II)-매개 산화를 시행하였다.
MDA의 관점에서 표현된 건강한 기증자로부터 인간 혈청에 있는 지질 과산화 제품의 정상 범위는 1.80-3.94 μM28 사이이다. 인간 혈청에서 TBARS 분석의 동적 범위를 설명하기 위해, 2mM Cu(II) 이온의 농도가 샘플에 첨가되었고, 이어서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션을 하였다. 이로 인해 TBARS가 6배-7배 증가했습니다(그림 6).
그림 1: 티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석 회로도.
13mm x 100mm 유리 튜브에 100마이크로리터를 첨가하고 티오바르비투릭 산 반응성 물질(TBARS) 시약이 추가됩니다. 1 h에 대한 95 °C에서 배양 한 후, 샘플 및 표준은 30 분 동안 얼음에서 배양 한 다음 4 °C에서 10 분 동안 1,500 x g에서 원심 분리됩니다. 샘플 또는 표준 상체제의 1005마이크로리터는 96웰 플레이트에 적재되고 흡광도는 532nm로 측정됩니다. 알 수 없는 샘플 농도는 표준 곡선의 방정식을 사용하여 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아키타입 티오바르비투릭 산 반응성 물질 반응.
말론알데히드 비스(디메틸 아세탈)는 산촉매 가수분해1 하에서 말론다이얼데히드를 생성합니다. 방출된 말론다이얼데히드(MDA)는 2-티오바르비투릭산(TBA)(pH = 4 및 95°C)의 2분자와 반응하여 빨간색-분홍색 을 주고 532nm 에서 분광측정을 측정할 수 있는 MDA-TBA2 어덕트를 형성한다. 산화 지질에서 파생된 MDA 외에 다른 분자도 TBA와 반응할 수 있기 때문에, 532 nm의 흡광도 측정은 단순히 티오바르비투릭 산 반응성 물질 또는 TBARS의 측정이라고합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 말론알데히드 비스(디메틸 아세탈) 컬러메트릭 표준 커브.
그림은 서로 다른 날에 만든 9개의 표준 곡선을 보여줍니다. 일부 포인트는 겹치며 서로 구별할 수 없습니다. 말론다이얼데히드 비스(디메틸 아세탈)는 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160 μM에서 교정기 샘플로 강화되었다( 표 1에 도시된 바와 같이, n = 1일 농도 포인트당). 흡광도는 532nm에서 측정되었으며, 빈 시료의 평균 흡광도는 알 수 없는 것을 포함하여 해당 배치의 모든 측정에서 빼었다. 매일, 최소 제곱선형 회귀에 의해 생성된 방정식은 생물학적 샘플에서 TBARS를 결정하는 데 사용되었습니다. 결합된 9개의 표준 곡선모두에 대해, 경사의 표준 편차는 8.67 x 10-6이고, y-intercept의 표준 편차는 5.66 x 10-4였다. 최소 제곱 프로시저를 사용하여 경사 및 y-intercept의 표준 편차를 계산했습니다24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: TBARS에서 검출된 HepG2 용해의 산화.
6개의 HepG2 세포 용해 견본은 2mM CuCl2 [HepG2 세포 lysate + 2m Cu(II)]로 배양되었고 6개의 샘플은 CuCl2 (HepG2 세포 lysate)가 없는 용액에서 37°C에서 24h로 배양되었다. 인큐베이션 후, TBARS 분석법은 12개의 샘플에서 수행되었다. 이 절차는 총 3일 동안 2배 반복되었다. 오류 막대는 SD. 별표가 제어와 Cu(II) 처리된 라이사테(p < 0.001)의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 통계적 유의성은 그래프패드에서 Mann Whitney U 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: TBARS에 의해 검출된 저밀도 지단백에서 산화.
(A) TBARS 분석법은 0.01% EDTA를 포함하는 LDL 샘플에서 수행되었다. 6개의 LDL 샘플은 10μM CuCl2 [LDL + 10 μM Cu(II)]로 배양되었고, 6개의 샘플은 37°C에서 2시간 동안 CuCl2 가 첨가되지 않은 제어 용액(Native LDL)으로 배양되었다. 이어서, TBARS 분석법은 12개의 샘플에서 수행되었다. "ns"는 통계적 유의를 나타내지 않습니다. (B) LDL은 EDTA를 제거하기 위해 원심 스핀 필터 장치를 사용하여 스핀 필터링하였다. 이어서, 추가된 Cu(II)를 유한하고 없이 배양하여 (A)에 대해 설명한 대로 다시 수행하였다. TBARS 분석법은 그 직후에 수행되었습니다. 이 같은 절차는 총 3 일 동안 2x반복되었다. 오류 막대는 SD. 별표가 대조군과 Cu(II) 처리된 LDL 샘플(p < 0.001)의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 통계적 유의성은 그래프패드에서 Mann Whitney U 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: TBARS에 의해 검출된 인간 혈청 견본에 있는 지질 과산화.
6개의 인간 혈청 샘플은 2mM CuCl2 [혈청 + 2mM Cu(II)]로 배양되었고, 6개의 샘플은 37°C에서 24h에 대한 CuCl2 (일반 혈청)를 첨가하지 않은 용액으로 배양되었다. 인큐베이션 후, TBARS 분석법은 12개의 샘플에서 수행되었다. 이 절차는 2일 더 반복되었습니다. 오류 막대는 SD. 별표가 대조군과 Cu(II) 처리된 혈청 샘플(p < 0.001)의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 통계적 유의성은 그래프패드에서 Mann Whitney U 테스트를 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유리 튜브 | 200 μM MDA 비스 (디메틸 아세탈) (μL) | 물(μL) | MDA 비스 (디메틸 아세탈) 최종 농도 (μM) |
| 아아 (주) | 0 | 1000 | 0 |
| B | 12.5 | 987.5 | 2.5 |
| C | 25 | 975 | 5 |
| D | 50 | 950 | 10 |
| E | 100 | 900 | 20 |
| F | 200 | 800 | 40 |
| G | 400 | 600 | 80 |
| H | 800 | 200 | 160 |
표 1: 말론알데히드 비스(디메틸 아세탈) 표준 샘플 제제. 새로 준비된 200 μM 말론알데히드 비스(디메틸 아세탈)에서, 권장된 부피를 인용하여 표준 곡선의 최종 농도에 도달합니다. 메서드의 검출 한계를 결정하기 위해 하루에 빈 샘플(A)의 최소 6개의 복제를 수행하는 것이 좋습니다.
| 하루 | 흡광도 | 스블브 (주) | Smc | 감도(흡광도 단위/μM)d | cm (μM) e |
| 1 (n = 6) | 0.0412 | 0.000612 | 0.0430 | 0.00160 | 1.14 |
| 2 (n = 6) | 0.0415 | 0.000632 | 0.0433 | 0.00160 | 1.18 |
| 3 (n = 6) | 0.0413 | 0.000605 | 0.0431 | 0.00160 | 1.13 |
| 3일(n = 18) | 0.0413 | 0.000589 | 0.0431 | 0.00160 | 1.10 |
| a 3일 동안 빈 시료의 흡수도는 6개의 복제로 하루에 복제됩니다. | |||||
| bSbl = 빈 샘플의 흡광도의 표준 편차. | |||||
| cSm = 최소 구별 가능한 분석 신호는 빈 신호(Sθbl)의 평균과 빈(ksbl)의 표준 편차의 여러 k를 합산하여 결정되었으며, 여기서 k =3. 즉,; Sm = Sθbl + ksbl. | |||||
| d 표준 곡선의 경사인 TBARS 분석기의 감도입니다. | |||||
| ecm = cm =(Sm - Sbl)⁄m로 계산된 검출 제한, 여기서 m = 표준 곡선의 경사. | |||||
표 2: TBARS 분석기의 검출 한계입니다.
| 저밀도 지단백 | 휴먼 세럼 | HepG2 세포 리세이트 | |||
| 하루 | % 이력서 | 하루 | % 이력서 | 하루 | % 이력서 |
| 1 (n = 6) | 5.6 | 1 (n = 6) | 7.9 | 1 (n = 6) | 12.6 |
| 2 (n = 6) | 5.4 | 2 (n = 6) | 7.2 | 2 (n = 6) | 15.8 |
| 3 (n = 6) | 3.9 | 3 (n = 6) | 7.0 | 3 (n = 6) | 17.7 |
| 모든 3 일 (n = 18)a | 7.4 | 3일(n = 18) | 9.8 | 3일(n = 18) | 15.5b |
| With 10 μM CuCl2 | 2m CuCl2 | 2m CuCl2 | |||
| 1 (n = 6) | 4.5 | 1 (n = 6) | 6.0 | 1 (n = 6) | 5.8 |
| 2 (n = 6) | 6.5 | 2 (n = 6) | 4.3 | 2 (n = 6) | 6.0 |
| 3 (n = 6) | 6.7 | 3 (n = 6) | 6.2 | 3 (n = 6) | 8.0 |
| 3일(n = 18) | 6.1 | 3일(n = 18) | 5.6 | 3일(n = 18) | 7.3 |
| a 인터데이 정밀도는 3일 간의 데이터를 풀링하여 계산되었습니다. | |||||
| b 분석 LOD 근처에 있는 결과로 인해 정밀도가 제한되었습니다. | |||||
표 3: 3개의 다른 생물학 견본에 있는 TBARS의 분석 재현성.
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Discussion
그 한계에도 불구하고1,3,4,8,9,10,12,12,13,14,15,19 및 실험실 사이의 비교에 대한 적합성의 부족에도 불구하고, TBARS 분석은 가장 오래된 중 하나입니다29,30 그러나 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 소약. TBARS 분석법은 필요한 모든 시약을 준비한 후에는 수행하려면 약 2시간밖에 걸리지 않는 간단한 방법입니다. 여기서, 우리는 표준 곡선을 포함하여이 분석이 샘플의 모든 배치에 대한 비싼 키트를 구입하지 않고도 경제적 인 방법으로 여러 번 수행 할 수있는 방법을 자세히 설명했습니다 (96 샘플에 대한 약 $ 3.50 USD).
분석의 모든 단계는 중요하지만, 추가주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 예를 들어, 티오바르비투릭 산의 pH는 4보다 높지 않아야 합니다. 예방 조치는 티오바르비투릭 산에 수산화 나트륨 용액을 추가할 때 취해야 하며 4개 이상의 pH를 얻는 것을 피해야 합니다. MDA와 TBA 간의 반응이 발생하기 위해서는 산성 환경이 필요하며, MDA 표준은 산촉매 가수분해에 의해 MDA 비스(디메틸 아세트탈)로부터 방출된다. 따라서, 높은 pH는 예측할 수 없는 매우 가변적인 결과로 이어질 수 있습니다31.
또한, 이것은 일부 독자에게 분명 할 수 있지만, 흡광도를 측정하기 전에 96 우물 판의 거품을 제거하는 것도 중요합니다. 거품의 존재는 높은 흡광도 값과 복제 사이의 차이를 산출합니다, 추가적으로, 95 °C에서 1 h 배양 후, 샘플은 얼음에 30 분 이상 배양해서는 안되며, 이것은 전체 샘플을 침전하고 침전물 프리 세상탄을 수집하기 어려울 것입니다. 특히 TBARS 분석이 시작되면 좋은 정지 지점이 없습니다. 시작되면 완료해야 합니다. 마지막으로, 이 분석법에 적용할 수 있는 많은 가능한 방법론적 변형이 있습니다. 여기에 설명된 일반적인 프로토콜은 분석 전에 급진적 인 청소제 또는 다른 유형의 항산화물질을 첨가하는 것을 포함하여 특정 응용 분야에 대해 더 적응 (및 검증)될 수 있습니다.
TBARS 분석이 인기가 있지만 분자별 분석이 아니라는 것을 깨닫는 것이 중요합니다. 지질 이외의 산화 생체 분자에서 파생된 분자를 포함하여 수많은 화학적 반응성 탄산염 함유 유기 분자는 TBA와 반응할 수 있으며 따라서 TBARS1,32,33,34로 계산됩니다. 또한, 흡광도 계 TBARS 분석법의 검출 한계는 이 방법에 의해 결정된 바와 같이 약 1.1 μM보다 훨씬 더 나아지지 않는다. 그러나 다른 검출 방법을 사용하여 검출 의 한계를 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 520 nm에서 여기와 550 nm에서 방출과 분광법은 이전에 조와 Ahn35에 의해 제안된 바와 같이, 더 높은 감도 및 검출의 더 나은 한계를 제공합니다. 질량 분석 기반 방법은 특이성과 검출 한계를 크게 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 전자 포획 음성 이온 화학 이온화(ECNICI) 방법을 가진 GC-MS/MS는 컬럼36에서 2 x 10-18 mol MDA의 검출 한계와 함께 인간 혈청 및 소변 샘플에서 MDA의 펜타플루오로벤젤 유도체를 검출하는 데 사용되어 왔다. 여기서, 크로마토그래피 분리는 탠덤 질량 분광과 함께, 분석의 분자 특이성을 극적으로 향상시킨다.
그럼에도 불구하고, 생물학적 샘플 내에서 산화 공정의 다른 측정과 마찬가지로37,38, 사전 분석 샘플 처리는 TBARS 측정의 결과에 매우 중요합니다. 예를 들어, -20°C에서 혈장 저장은 MDA 농도39,40에서 느리지만 극적인 증가를 초래한다. 따라서 최소한의 시간 만해도 생물학적 시료를 해동하거나 부분적으로 해동된 상태로 노출하면 TBARS 수준의 관절성 고도를 유발하는 것으로 가정되어야 합니다. 즉, TBARS 분석기를 사용하여 비교해야 하는 생체 표본의 사전 분석 처리 및 저장에서 적당한 가변성을 피해야 한다는 것을 의미합니다.
사전 분석 가변성뿐만 아니라 제한된 감도 및 특이성과 관련된 이러한 주의 사항을 감안할 때, 흡광도 기반 TBARS 분석은 실험실 내 일반 평가 또는 범위 찾기 실험에만 사용되는 것이 좋습니다. 이러한 응용 분야에는 상대적인 TBARS 수준이 처리되거나 함께 저장되고 연구원에 의해 완전히 제어되는 단일 변수에 의해 분리되는 생물학적으로 유사한 샘플의 하나 이상의 그룹 사이에서 직접 비교되는 연구가 포함됩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익 이나 공개 하는 이해의 다른 충돌.
Acknowledgments
여기에서 보고된 연구는 상 아니의 밑에 건강의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었습니다. R33 CA217702 및 학생 개발 극대화 이니셔티브(IMSD) 프로그램. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
